Het menselijke lichaam bestaat naar schatting uit 65.000.000.000.000 cellen, die allemaal een specifieke taak en/of functie hebben. Communicatie tussen cellen onderling als mede groeifactoren in de lichaamsvloeistoffen (bijvoorbeeld in het bloed) gene reren signalen die, onder andere, bepalen welke taak of functie een cel heeft en of een cel zich mag delen. Als cellen niet reageren op die signalen of als de signalen niet goed vertaald worden kan dit leiden tot onge controleerde celdeling wat uiteindelijk kan resulteren in kanker.
Signalen die celgroei stimuleren of remmen, moeten van buiten de cel getrans-porteerd worden naar binnen over het celmembraan. Dat membraan, ook wel plasmamembraan genoemd, bestaat uit lipiden (vetten) en eiwitten, en vormt een barrière die de inhoud van de cel scheidt van het externe milieu. In het celmem-braan bevinden zich receptoren die signalen uit hun omgeving opvangen en dit via een cascade van signaalmoleculen in de cel doorgeven naar, onder andere, de celkern waar specifieke genen op het DNA aan of uit worden geschakeld. Dit kan leiden tot een respons, bijvoorbeeld celdeling. Een veel voorkomende manier van signaaloverdracht is het modificeren van signaalmoleculen met een of meer fosfaatgroepen, wat fosforylering wordt genoemd. Zowel eiwitten (proteinen) als lipiden kunnen gefosforyleerd worden door specifieke enzymen, kinases genoemd.
In dit proefschrift is onderzoek gedaan naar diacylglycerol kinase (DGK) dat een fosfaatgroep koppelt aan het lipide diacylglycerol (DAG) waarbij fosfatidezuur (PA) ontstaat. DGK is een enzymatische schakel in een signaaloverdracht cascade dat begint met de receptor-gemedieerde activering van een enzym (fosfolipase C) dat een lipide in de celmembraan (fosfatidylino sitol-bisfosfaat, PIP2) klieft waar -bij DAG gevormd wordt. Een voorbeeld van een signaal overdracht cascade waarin DGK een rol speelt is geïllustreerd in Figuur 1. DAG is een signaalmolecuul dat
Fig 1.
Positie van DGK in een signaal overdracht cascade.
meerdere eiwitten kan activeren, waaronder protein kinase C (PKC), en speelt een rol in celdeling, differentiatie (celspecialisatie) en celmorfologie. Ook het DGK
product, PA, kan meerdere eiwitten activeren, maar het is niet bekend in welke processen in het lichaam het een rol speelt. In gist is aangetoond dat PA een rol speelt bij het reguleren van specifieke genen. DGK regelt dus de hoeveelheid van twee verschillende signaalmoleculen, DAG en PA. Het belang van een goede regu-latie van DAG en PA wordt benadrukt door het grote aantal verschillende subtypen (isovormen) van DGK; bij de mens zijn dat er tien. Dit onderzoek is gefocuseerd op twee DGK isovormen: DGKθ (theta) en DGKζ (zeta). Een overzicht van de litera-tuur over DGKθ en DGKζ is beschreven in Hoofdstuk 1.
1
5
4
154
In Hoofdstuk 2 is bestudeerd welke domeinen binnen het DGKθ molecuul belang-rijk zijn voor het efficiënt fosforyleren van DAG. DGKθ is opgebouwd uit een aantal domeinen, waaronder drie cysteine-rijke domeinen waarvan wordt gedacht dat het DAG bindt en een domein dat verantwoordelijk is voor de enzymatische (kinase) acti viteit. Het derde cysteine-rijke domain van DGKθ is verlengd met 15 aminozuren (bouwstenen van eiwitten), wat geconserveerd is (d.w.z. een ver-gelijkbare structuur heeft) in alle DGKs. Geconserveerde aminozuren binnen deze verlenging bleken essentieel te zijn voor DGK activiteit. Mogelijk speelt de ver-lenging van het cyteine-rijke domein een rol bij het presenteren van DAG aan het kinase domein. Daarnaast is gebleken dat het verwijderen van zelfs een klein gedeelte van DGKθ de DGK activiteit al drastisch verlaagt. Het grote effect op de activiteit duidt er op dat het complete eiwit nodig is voor de correcte vouwing van DGKθ of dat alle domeinen nodig zijn voor interacties met andere eiwitten die DGKθ activiteit kunnen regelen.
Het werk dat is beschreven in de overige hoofdstukken van dit proefschrift is een gevolg van onze ontdekking dat het DGKζ isotype bleek te binden aan het Retino blastoma eiwit (pRB). Hoofdstuk 3 is een in leiding over pRB en de pRB -gerelateerde eiwitten p107 en p130. pRB is een tumor-suppressor eiwit en is een belangrijke schakel die celdeling onderdrukt. In tumoren is pRB of een ander signaalmolecuul in de pRB signalering cascade gemuteerd, waardoor de celdeling niet meer geremd wordt. Naast het reguleren van celdeling is pRB betrokken bij celdifferentiatie.
In Hoofdstuk 4 wordt beschreven dat DGKζ aan zowel pRB, p107 als p130
kan binden. Deze binding verhoogt de activiteit van DGKζ. Daarnaast toonden we aan dat DGKζ een rol speelt in pRB-signalering. Bestraling van cellen (en tu-moren) leidt tot DNA schade welke hersteld moet worden voordat de celdeling kan starten. De daartoe benodigde blokkering van de celcyclus is afhankelijk van pRB. Dit werd duidelijk omdat cellen die afkomstig waren van muizen waaruit het pRB gen verwijderd is, zogenaamde pRB-deficiënte cellen, na bestraling niet stopten zich te delen. Overexpressie (verhoogd produ ceren) van actief DGKζ in pRB-deficiënte cellen daarentegen, herstelt de blokkering van de celdeling na bestraling. DGK activiteit is daarbij essentieel, aangezien cellen waarin een enzy-matisch-inactief DGKζ tot overexpressie is gebracht wel door blijven delen na bestraling. DGKζ overexpressie heeft geen effect op de blokkering van de celcyclus na bestraling in pRB-positieve cellen. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat in pRB-deficiënte cellen een verhoogde hoeveelheid Ras (een klein schakel-eiwit) aanwezig is waarvan bekend is dat het celdeling stimuleert. DGKζ kan Ras signa-lering remmen doordat het DAG wegneemt, en daarmee voorkomt dat DAG een Ras activator (Ras-GRP) kan activeren. Over expressie van DGKζ in pRB-deficiënte cellen zou Ras signalering kunnen onderdrukken waardoor de celdeling niet ge-stimuleerd wordt en de cellen na bestraling wel stoppen met delen.
Net als DGKθ heeft DGKζ een katalytisch domein en twee cysteine-rijke domei-nen. Daarnaast bevat DGKζ een MARCKS domein, dat homoloog is aan (sterk lijkt op) een gedeelte van het myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS) eiwit. Het MARCKS domein van DGKζ wordt gefosforyleerd door PKC, wat de
acti-Nederlandse samenvatting
viteit van DGKζ reduceert. pRB bindt aan het MARCKS domein van DGKζ en daarom is in Hoofdstuk 5 bestudeerd of PKC de binding tussen pRB en DGKζ regelt. PKC
remt inderdaad de binding tussen DGKζ en pRB door de MARCKS domein van DGKζ te fosforyleren. Ook van PKC bestaan diverse isovormen, waarvan met name PKCα de binding tussen pRB en DGKζ bleek te remmen. Door de binding tussen pRB en
DGKζ te verbreken stimuleert PKCα zijn eigen activatie. pRB binding aan DGKζ stimuleert namelijk DGKζ activiteit waardoor DAG omgezet wordt in PA en PKC
niet geactiveerd wordt. Door de interactie te remmen wordt DAG niet weggenomen en kunnen PKC en andere DAG-bindende eiwitten geactiveerd worden. Wat de functie van deze regulering is in de cel is niet bekend, maar van PKCα is bekend dat het een rol speelt in de regulatie van celdeling en differentiatie, dus mogelijk speelt dit mechanisme daar een rol in.
Om de fysiologische functie van de interactie tussen pRB en DGKζ te bepalen is onderzocht of DGKζ celdeling of spier -cel-differentiatie reguleert; processen waarin pRB een rol speelt. In Hoofdstuk 6 is aangetoond dat overexpressie van
DGKζ in verschillende cellijnen geen invloed heeft op de celcyclus. Ook onder condities waarbij pRB de celcyclus blokkeert heeft overexpressie van DGKζ geen additionele effecten. Daarnaast is de celcyclus van DGKζ-deficiënte cellen (afkom-stig van muizen waaruit het DGKζ gen verwijderd is) vergelijkbaar met controle-cellen. DGKζ overexpressie of de afwezigheid van DGKζ heeft dus geen effect op de celdeling.
Aangezien pRB betrokken is bij spiercel-differentiatie, is in Hoofdstuk 7 onderzocht of DGKζ een rol speelt in dit proces. Overexpressie van DGKζ stimu-leert spiercel differentiatie en de productie van spiercel-specifieke eiwitten. Aangezien een inactieve mutant van DGKζ geen effect heeft op spiercel-differen-tiatie, is het verminderen van DAG of het produceren van PA waarschijnlijk belang-rijk voor differentiatie. Gen-expressie studies door middel van
microarrays hebben aangetoond dat DGKζ voornamelijk genen stimuleert die worden geactiveerd door de spiercel-specifieke transcriptiefactor MyoD, wat suggereert dat DGKζ mogelijk MyoD activiteit stimuleert. Promoter studies met verschillende pro moters die bindingsplaatsen voor MyoD bevatten, waaronder de myogenin- en muscle creatine kinase promoter, bevestigden dat DGKζ MyoD -gereguleerde promoters stimuleert. Daarnaast bleken DGKζ-deficiënte cellen niet te kunnen differentiëren tot spiercellen en de daarbij behorende specifieke eiwitten te produceren, wat aantoont dat DGKζ essentieel is voor spiercel-diffe-rentiatie.
In dit proefschrift is versterkt bewijs gevonden dat DGK activiteit, en daarmee de hoeveelheden DAG en PA, goed gereguleerd dienen te worden. Ten eerste, het complete DGKθ eiwit is nodig voor de volledige activiteit van DGKθ, wat sugge-reert dat subtiele veranderingen van het eiwit al voldoende zijn voor regulatie van DGK activiteit. Ten tweede, DGKζ activiteit wordt gereguleerd door pRB, p107 en p130. Ten derde, het enzym PKC remt de activering van DGKζ door pRB.
1
5
6
156
Daarnaast is aangetoond dat DGKζ betrokken is bij twee fysiologische processen: (1) overexpressie van DGKζ in pRB-deficiënte cellen herstelt de blokkering van de celdeling na bestraling en (2) DGKζ stimuleert spiercel-differentiatie. Het feit dat we alleen een effect van DGKζ op de celdeling hebben gevonden in bestraalde pRB-deficiënte cellen, suggereert dat DGKζ alleen een effect heeft op de celdeling onder zeer specifieke condities. Onze hypothese is dat in pRB-deficiënte cellen de balans tussen DAG en PA verstoord is en dat cellen daardoor kunnen blijven delen na bestraling. Overexpressie van DGKζ herstelt deze balans, waardoor cellen in staat zijn het blokkeringmechanisme van de celdeling in gang te zetten. In con-trole-cellen is de DAG-PA balans goed gereguleerd, waardoor overexpressie van
DGKζ geen extra bijdrage levert aan de DAG-PA balans, zodat hiervan geen effec-ten op celdeling worden gevonden. Bij spiercel-differentiatie is mogelijk ook een veran dering in de DAG-PA balans nodig, wat in cellen met verhoogde DGKζ expressie eerder wordt bereikt, waardoor deze cellen sneller differentiëren. Het is bekend dat DAG de spiercel-differentiatie remt door de activering van Ras (via Ras-GRP) en door activering van PKC dat expressie van spiercel-specifieke genen remt. PA, daar entegen, stimuleert spiercel-differentiatie via het signaal eiwit mTOR, maar hoe dit precies gereguleerd wordt is niet bekend.
Om het mechanisme te achterhalen hoe DGKζ bovengenoemde fysiologische processen reguleert en of DAG-PA balansen daarmee te maken hebben, zou in toekomstige experimenten DAG en PA hoeveel heden gemeten kunnen worden. Daarnaast zou onderzocht kunnen worden welke DAG- en PA-bindende eiwitten een rol spelen bij deze fysiologische processen. Een gerichte studie naar het functioneren van spiercellen in DGKζ-deficiënte muizen kan inzicht verschaffen wat de precieze rol van DGKζ in spiercel-differentiatie is. Om de rol van DGKζ in pRB signalering uit te zoeken zou het interessant zijn om pRB mutanten te gene-reren die niet aan DGKζ, maar wel aan andere pRB-bindende eiwitten kunnen binden. Deze mutanten zouden ingezet kunnen worden in celcyclus- en spiercel-differen tiatie experimenten. Een zeer interessante richting voor vervolgonderzoek is om na te gaan of DGKζ regulatie verstoord is in tumoren met een niet-functio-nerende pRB-signaleringsroute. In dit proefschrift is indirect bewijs gevonden dat
DGKζ betrokken zou kunnen zijn bij een verstoorde regulatie van de celcyclus in cellen waarin pRB signalering geremd is, aangezien DGKζ over expressie een blok-kering van de cel cyclus in bestraalde pRB-deficiënte cellen kan herstellen. Het zou zeer interessant zijn te onderzoeken of DGKζ ook een positief effect heeft op een blokkering van de cel cyclus in bestraalde tumoren waarin pRB signalering niet functioneel is. Er is dus genoeg werk voor de toekomst om de rol van DGKζ in pRB-signalering verder te onderzoeken en hopelijk leidt dit tot verder inzicht hoe kanker behandeld zou kunnen worden.