Hart- en vaatziekten vormen de belangrijkste doodsoorzaak in de Westerse Wereld en worden voornamelijk veroorzaakt door slagaderverkalking, ook wel ‘atherosclerose’ genoemd. Slagaderverkalking leidt tot vernauwing van de slagader. Als de vernauwing zich in het hart bevindt kan dit leiden tot pijn op de borst. Als deze vernauwing scheurt dan kan er een stolsel ontstaan dat het bloedvat verstopt wat leidt tot een hartinfarct. Ook kan door de hoge druk in de slagaders het stolsel losschieten en ergens anders een bloedvat verstoppen wat bijvoorbeeld tot een herseninfarct kan leiden. De twee belangrijkste oorzaken voor slagaderverkalking zijn ontsteking en hyperlipidemie. Hyperlipidemie is gekenmerkt door een verhoogde concentratie van triglyceriden (TG) en cholesterol in (zeer-) lage-dichtheid lipoproteïnen ((V)LDL).
Hoofdstuk 1 van dit proefschrift dient als algemene introductie. Hierin worden de vetstofwisseling en slagaderverkalking geïntroduceerd, evenals de rol van geactiveerd bruin vet in de vetstofwisseling en in de bescherming tegen slagaderverkalking. Daarnaast worden de diverse typen ontstekingscellen en de rol van ontsteking in de ontwikkeling van slagaderverkalking uitgelegd. Suikers en vetten vormen belangrijke bouwstenen voor ons lichaam. De belangrijkste vetten in ons dieet zijn TG en cholesterol. TG is belangrijk als brandstof voor ons lichaam doordat het drie vetzuren per molecuul bevat die kunnen worden vrijgemaakt en gebruikt als energiebron door organen en weefsels. Cholesterol wordt niet gebruikt als brandstof maar is belangrijk voor de aanmaak van nieuwe cellen, bepaalde hormonen, vitamine D en galzuren. Suikers zijn oplosbaar in ons bloed maar TG en cholesterol niet. Daarom worden vetten in het bloed vervoerd in microscopisch kleine vetbolletjes, zogenaamde ‘lipoproteïnen’, die TG en cholesterol naar de verschillende organen transporteren. De lipoproteïnen, chylomicronen en VLDL, die respectievelijk door de darm en lever worden gemaakt, bevatten in eerste instantie veel TG. Bekend is dat het enzym lipoproteïne lipase vetzuren kan vrijmaken uit het TG binnen deze deeltjes, welke vervolgens kunnen worden opgenomen door organen en weefsels. Skeletspieren en het hart gebruiken deze vetzuren voor het leveren van energie, en wit vetweefsel slaat vetzuren weer op in de vorm van TG. TG is ook een belangrijke brandstof voor bruin vetweefsel. Blootstelling aan kou is de belangrijkste natuurlijke activator van bruin vet en leidt tot de omzetting van vet dat in het bruin vet ligt opgeslagen tot warmte. Hierdoor slinkt de vetvoorraad in bruin vet. Om warmte te kunnen blijven produceren neemt bruin vet TG op uit het bloed. Dit heeft tot gevolg dat
10
activatie van bruin vet de concentratie TG in het bloed verlaagt, al was het nog onbekend hoe TG door bruin vet wordt opgenomen. Nadat organen TG hebben opgenomen uit de lipoproteïnen blijft een deeltje over dat relatief weinig TG bevat en veel cholesterol. Deze cholesterol-verrijkte deeltjes noemen we lipoproteïnerestanten (het slechte cholesterol). Lipoproteïnerestanten worden normaliter door de lever opgenomen en daardoor uit het bloed verwijderd, maar wanneer dat onvoldoende gebeurt en de concentraties in het bloed te hoog worden kunnen ze de vaatwand binnendringen. In de vaatwand worden deze lipoproteïnerestanten opgenomen door ontstekingscellen, de belangrijkste stap in de ontwikkeling van slagaderverkalking. Gedurende de ontwikkeling van slagaderverkalking zorgt de ophoping van onder andere cholesterol en ontstekingscellen ervoor dat de vaatwand vernauwt, wat uiteindelijk kan leiden tot een infarct in het hart of in de hersenen met de dood tot mogelijk gevolg.
Hoge-dichtheid lipoproteïnen (HDL; het goede cholesterol) wordt aangemaakt in de lever en darmen en beschermt juist tegen slagaderverkalking. HDL kan cholesterol opnemen uit de ontstekingscellen in de vaatwand en het cholesterol naar de lever transporteren waar het wordt uitgescheiden, voornamelijk als galzuren in de ontlasting. Slagaderverkalking kan zich dus ontwikkelen door zowel hoge bloedgehaltes van lipoproteïnerestanten die de vaatwand infiltreren en ontsteking bevorderen, als door onvoldoende verwijdering van cholesterol uit de vaatwand door HDL.
Zoals hierboven al beschreven speelt ontsteking ook een belangrijke rol bij de ontwikkeling van slagaderverkalking. Wanneer ontstekingscellen cholesterol in de vaatwand hebben opgenomen scheiden zij signaalmoleculen uit die de ontsteking verder bevorderen. Dit leidt ook tot infiltratie van nog meer ontstekingscellen in de vaatwand. Ontstekingscellen kunnen echter ook signaalmoleculen uitscheiden die ontsteking remmen. Een voorbeeld van zo’n ontstekingsremmend signaalmolecuul is interleukine 37 (IL-37), wat wel in mensen maar niet in muizen aanwezig is. Een verhoogde aanmaak van ontstekingsremmende signaalmoleculen zoals IL-37 zou ontsteking kunnen verlagen en zo de ontwikkeling van slagaderverkalking kunnen remmen. Of een ontstekingscel ontstekingsremmende of ontstekingsbevorderende signaalmoleculen aanmaakt hangt af van de manier waarop de ontstekingscellen geactiveerd worden. Ontstekingscellen kunnen geactiveerd worden door binding van moleculen aan receptoren op hun celmembraan. Dit leidt in de meeste gevallen tot de productie van signaalmoleculen die ontsteking bevorderen. Een bekende groep ontstekingsbevorderende receptoren
op het membraan van ontstekingscellen zijn de C-type lectine receptoren (CLRs). Deze receptoren zijn voornamelijk verantwoordelijk voor het herkennen van suikerachtige structuren op schimmels. Het voorkomen van activatie van CLRs zou kunnen leiden tot een lagere aanmaak van ontstekingsbevorderende signaalmoleculen. Het verlagen van ontsteking zou vervolgens weer kunnen beschermen tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking.
Het onderzoek in dit proefschrift had twee doelen: 1) identificatie van genen in muizen en mensen die de activiteit van bruin vet beïnvloeden om vervolgens te onderzoeken wat de rol van deze genen is in de vetstofwisseling en de ontwikkeling van slagaderverkalking; 2) identificatie van genen in muizen die de mate van ontsteking beïnvloeden om vervolgens te onderzoeken of deze genen ook de ontwikkeling van slagaderverkalking beïnvloeden.
Zoals hierboven aangegeven neemt geactiveerd bruin vet dus grote hoeveelheden TG op uit het bloed, waarna de vetzuren uit TG gebruikt kunnen worden om warmte te produceren. Het was echter niet bekend op welke manier bruin vet TG opneemt: 1) door het vrijmaken van vetzuren uit TG buiten de cel, waarna bruine vetcellen deze vetzuren opnemen, 2) door opname van hele lipoproteïnen, of 3) door een combinatie van beide. Om dit te bestuderen hebben wij in hoofdstuk 2 gebruik gemaakt van lipoproteïneachtige deeltjes van drie verschillende groottes, waarvan zowel de vetzuren van de TG als het cholesterol radioactief waren gemerkt. Deze deeltjes werden vervolgens ingespoten in muizen die blootgesteld waren aan een omgevingstemperatuur van 28°C (inactief bruin vet), 21°C (gemiddelde activiteit van bruin vet) of 7°C (zeer actief bruin vet). Hierna bepaalden we de opname van de radioactief gemerkte vetzuren en cholesterol door de verschillende organen, waaronder bruin vet. We konden op deze manier aantonen dat bruin vet voornamelijk vetzuren opneemt nadat deze uit TG zijn vrijgemaakt buiten de cel en niet via de opname van hele deeltjes. Deze selectieve wijze van vetzuuropname was gelijk voor deeltjes die qua grootte lijken op chylomicronen dan wel VLDL en door zowel inactief als zeer actief bruin vet, al was de hoeveelheid vetzuren die werd opgenomen door zeer actief bruin vet vele malen groter dan door inactief bruin vet.
Actief bruin vet neemt dus veel vetzuren op die afgesplitst zijn vanuit TG, die op hun beurt weer vrijgemaakt zijn uit lipoproteïnen. Hierdoor ontstaan restanten van lipoproteïnen die relatief veel cholesterol bevatten en door de lever worden opgenomen. Uit onze
10
studies bleek dat bruinvetactivatie via dit mechanisme niet alleen het TG-gehalte maar ook het cholesterolgehalte in het bloed verlaagt en tevens beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking in muizen. Behandeling met een statine, een cholesterolverlagend medicijn, versnelt de opname van lipoproteïnerestanten door de lever. Daarom testten we in hoofdstuk 3 de hypothese dat activatie van bruin vet in combinatie met statinebehandeling de cholesterolgehaltes in het bloed en de ontwikkeling van slagaderverkalking nog verder verlaagt, door gebruik te maken van E3L.CETP muizen. Inderdaad zorgde de combinatie van bruinvetactivatie en behandeling met een statine voor een verder verhoogde leveropname van lipoproteïnerestanten vergeleken met alleen bruinvetactivatie. Hierdoor verlaagde de combinatie van behandelingen inderdaad de cholesterolgehaltes in het bloed en beschermde nog beter tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking vergeleken met bruinvetactivatie alleen. Op basis van deze resultaten concludeerden wij dat bruinvetactivatie een veelbelovende therapeutische toevoeging kan zijn aan de routinematige behandeling met statines om hart- en vaatziekten verder terug te dringen.
Geactiveerd bruin vet leidt dus tot een verhoogde opname van lipoproteïnerestanten door de lever. Cholesterol in de lever wordt voornamelijk gebruikt voor de aanmaak van galzuren die vervolgens worden uitgescheiden in de darmen en ons lichaam kunnen verlaten via de ontlasting. Een deel van deze galzuren wordt echter weer opgenomen door de darmen en aan de bloedbaan afgegeven voor hergebruik. Omdat het effect van bruinvetactivatie op het cholesterol- en galzuurmetabolisme nog grotendeels onbekend was, bestudeerden we deze relatie, wederom in E3L.CETP muizen, in hoofdstuk 4. Bruinvetactivatie verlaagde de galzuuruitscheiding via de ontlasting, verhoogde de galzuurgehaltes in het bloed en veroorzaakte ophoping van cholesterol in de lever. Vervolgens was onze hypothese dat we het galzuurmetabolisme konden verbeteren en de cholesterolophoping in de lever konden voorkómen door de galzuuruitscheiding via de ontlasting te verhogen. Om dit te bewerkstelligen gebruikten we een medicijn dat de heropname van galzuren door de darmen remt en zo de uitscheiding van galzuren via de ontlasting bevordert. We bestudeerden het effect van bruinvetactivatie in combinatie met deze remmer van de galzuurheropname op het galzuurmetabolisme en de cholesterolgehaltes in de lever. Deze combinatiebehandeling verhoogde de galzuuruitscheiding via de ontlasting en normaliseerde de galzuurgehaltes in het bloed vergeleken met alleen bruinvetactivatie en verbeterde op deze manier het galzuurmetabolisme. Bovendien beschermde deze combinatiebehandeling
tegen cholesterolophoping in de lever en verlaagde het de cholesterolgehaltes in het bloed beter dan bewerkstelligd kon worden met alleen bruinvetactivatie. We concludeerden uit deze gegevens dat het combineren van bruinvetactivatie met een remmer van galzuurheropname het galzuurmetabolisme verbetert, de lever tegen cholesterolophoping beschermt en cholesterolgehaltes in het bloed verder verlaagt vergeleken met alleen bruinvetactivatie. Daarbij postuleerden wij dat de combinatiebehandeling, door deze verdere verlaging van cholesterolgehaltes in het bloed, mogelijk ook kan zorgen voor een nog verdere remming van slagaderverkalking.
Door de hierboven beschreven studies hebben we veel inzicht verkregen over het effect van bruinvetactivatie op de vetstofwisseling in muizen. Het was echter nog onbekend wat het effect is van bruinvetactivatie op de vetstofwisseling van mensen. Daarom hebben we in hoofdstuk 5 bestudeerd wat het effect is van bruinvetactivatie, door middel van korte blootstelling aan kou, op de hoeveelheid en typen lipoproteïnen in het bloed. Ook bestudeerden we het effect van blootstelling aan kou op de mate waarin HDL cholesterol kan opnemen uit ontstekingscellen. Vóór en na blootstelling van jonge, slanke mannen aan een koelingsprotocol van 2 uur werden bloedmonsters afgenomen. Korte blootstelling aan kou verhoogde de bloedgehaltes van TG en cholesterol. Dit ging samen met een verhoogde concentratie VLDL-deeltjes na blootstelling aan kou. Ook zorgde blootstelling aan kou voor een verhoogde concentratie kleine HDL-deeltjes die meer cholesterol bevatten. Eerder is beschreven dat deze kleine HDL-deeltjes efficiënt cholesterol kunnen opnemen uit ontstekingscellen. Inderdaad toonden we aan dat het HDL van mannen die waren blootgesteld aan kou efficiënter cholesterol op kon nemen vanuit ontstekingscellen dan HDL dat geïsoleerd was voor blootstelling aan kou. Samengevat leidt korte blootstelling aan kou dus tot een verhoogde concentratie van grote VLDL deeltjes en kleine HDL deeltjes. Daarbij verhoogt korte blootstelling aan kou de functionaliteit van het HDL met betrekking tot opname van cholesterol, wat een beschermende werking kan hebben op de ontwikkeling van slagaderverkalking.
In hoofdstuk 6 focusten we ons op de rol van ontsteking in de ontwikkeling van slagaderverkalking. Het signaalmolecuul IL-37, dat aanwezig is in mensen en niet in muizen, werkt ontstekingsremmend. Een verhoogde hoeveelheid IL-37 in het lichaam zou dus mogelijk ontsteking kunnen verlagen en daardoor kunnen beschermen tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking. Daarom onderzochten we het effect van de aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscellen op de ontwikkeling van slagaderverkalking
10
in muizen. Omdat ontstekingscellen geproduceerd worden vanuit cellen in het beenmerg, hebben we een beenmergtransplantatie uitgevoerd met beenmerg van muizen waar menselijk IL-37 aanwezig was of met beenmerg van controlemuizen waar IL-37 niet aanwezig was. Omdat IL-37 niet voorkomt in muizen kregen we op deze manier een groep muizen die IL-37 tot expressie bracht in hun ontstekingscellen en een controlegroep die IL-37 niet tot expressie bracht. Om slagaderverkalking te ontwikkelen kregen alle muizen een Westers dieet dat veel cholesterol bevat in vergelijking met standaard muizenvoer. De aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscellen verlaagde inderdaad ontsteking in de muizen maar had geen effect op het lichaamsgewicht, de voedselinname en cholesterolgehaltes in het bloed. Ondanks de verlaagde ontsteking had de aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscellen daarnaast ook geen effect op de ontwikkeling van slagaderverkalking. Hieruit concludeerden wij dat de aanwezigheid van IL-37 in ontstekingscelen niet beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking.
De aanmaak van signaalmoleculen die ontsteking bevorderen of juist remmen hangt af van de manier waarop ontstekingscellen geactiveerd worden. Binding van bepaalde structuren aan receptoren op de ontstekingscellen zoals zogenaamde ‘C-type lectin receptors’ (CLRs) zorgt voor activatie van deze cellen, wat vervolgens leidt tot de aanmaak van signaalmoleculen die de ontsteking bevorderen. In hoofdstuk 7 onderzochten we daarom of de afwezigheid in ontstekingscellen van de CLR Dectine-2 of van ‘caspase recruitment domain-containing protein 9’ (CARD9), de belangrijkste regulator van alle CLR-familieleden, beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking. Om dit te onderzoeken hebben we een beenmergtransplantatie uitgevoerd met beenmerg van muizen waarin ofwel géén Dectine-2 aanwezig was, ofwel géén CARD9 aanwezig was, of van controlemuizen waar Dectine-2 en CARD9 allebei wél aanwezig waren. Vervolgens kregen de muizen weer een Westers dieet om slagaderverkalking te induceren. De afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen had geen effect op zowel ontsteking als de ontwikkeling van slagaderverkalking. De afwezigheid van CARD9 in ontstekingscellen had ook geen effect op ontsteking, maar leidde verrassenderwijs tot de ontwikkeling van meer slagaderverkalking. Hieruit concludeerden we dat de afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen de ontwikkeling van slagaderverkalking niet beïnvloedt, terwijl afwezigheid van CARD9 in ontstekingscellen de ontwikkeling van slagaderverkalking bevordert, wat suggereert dat de aanwezigheid van CARD9 zou kunnen beschermen tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking.
CLRs zijn verantwoordelijk voor het herkennen van suikerachtige structuren op schimmels. Daarom bestudeerden we in hoofdstuk 8 nogmaals de rol van de CLR familie in de ontwikkeling van slagaderverkalking, ditmaal in een situatie met hoge suikergehaltes in het bloed, zoals voorkomt in mensen met suikerziekte ofwel diabetes. Onze hypothese was dat, in geval van diabetes, suikerachtige structuren in het bloed kunnen binden aan CLRs wat leidt tot activatie van ontstekingscellen. Daarom onderzochten we of de afwezigheid van Dectine-2 of CARD9 in ontstekingscellen beschermt tegen de ontwikkeling van slagaderverkalking tijdens diabetes. Om dit te onderzoeken hebben we weer een beenmergtransplantatie uitgevoerd met beenmerg van muizen waarin ofwel géén Dectine-2 aanwezig was, ofwel géén CARD9 aanwezig was, of van controlemuizen waar Dectine-2 en CARD9 allebei wél aanwezig waren. Vervolgens zorgden we ervoor dat de muizen diabetes kregen, waarna ze een Westers dieet kregen om slagaderverkalking te kunnen ontwikkelen. De afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen verlaagde de hoeveelheid ontstekingscellen in het bloed maar deze ontstekingscellen maakten wel meer ontstekingsbevorderende signaalmoleculen. De afwezigheid van Dectine-2 in ontstekingscellen had geen effect op de ontwikkeling van slagaderverkalking. De afwezigheid van CARD9 in ontstekingscellen had geen effect op zowel ontsteking als op de ontwikkeling van slagaderverkalking. Daarom concludeerden we dat in diabetische muizen de afwezigheid van Dectine-2 of CARD9 in ontstekingscellen geen effect heeft op de ontwikkeling van slagaderverkalking.
De belangrijkste resultaten uit dit proefschrift zijn bediscussieerd in hoofdstuk 9. Omdat resultaten die verkregen zijn uit proefdieren niet direct vertaald kunnen worden naar de mens, brengt onderzoek in proefdieren beperkingen met zich mee. Deze beperkingen werden besproken voor zowel het bruin vet-gerelateerde onderzoek als het ontstekings-gerelateerde onderzoek. Ook werd het toekomstperspectief besproken van bruinvetactivatie en ontstekingsverlagende strategieën in de strijd tegen hart- en vaatziekten. Samen hebben de studies die beschreven zijn in dit proefschrift onze kennis vergroot over zowel het effect van bruinvetactivatie op de vetstofwisseling en de ontwikkeling van slagaderverkalking, als de rol van ontsteking in de ontwikkeling van slagaderverkalking, wat aansluit op de onderzoeksdoelen uit dit proefschrift. Op basis van de resultaten beschreven in dit proefschrift lijkt vooral de activatie van bruin vet een veelbelovende strategie om hart- en vaatziekten verder terug te dringen.