De kristalstructuurbepaling van eiwitten door middel van Röntgen-diffractie is één manier waarmee de driedimensionale structuur van een eiwit bepaald kan worden. Aan de hand van de verkregen informatie kan vaak iets gezegd worden over de functie en de werking van het eiwit. Röntgen-diffractie wordt ook gebruikt in de ontwikkeling van medicijnen. Om te beginnen wordt de structuur van het ziekteverwekkende eiwit, het zogenaamde “target eiwit”, bepaald. De kennis van deze structuur wordt vervolgens gebruikt om geschikte medicijnen te ontwikkelen. Deze medicijnen moeten in staat zijn het aktief gedeelte van het “target eiwit” te binden, om daardoor de activiteit van het eiwit uit te schakelen. Aan de hand van de kristalstructuur van “target eiwit” met het daaraan gebonden medicijn kan gekeken worden of het mogelijk is de eigenschappen van het medicijn te verbeteren. Dit kan door bijvoorbeeld het medicijn zo te veranderen dat de binding van het medicijn aan het “target eiwit” versterkt wordt waardoor een lagere dosering van het desbetreffende medicijn mogelijk is. De eiwitkristallografie is in de laatste jaren enorm verbeterd, door o.a. sterkere Röntgenbronnen, waardoor een resolutie van 1.5 Å of hoger niet langer een onrealistisch doel is. In de eiwitkristallografie wordt gewerkt met de eenheid Angstrom (Å), 1 Å = 1.0 x 10-10 m, en komt ongeveer overeen met de afstand tussen twee atomen in de materie.
Dit proefschrift beschrijft de zuivering en kristallisatie van verschillende eiwitten. In hoofdstuk 1 worden twee van de bestudeerde eiwitten besproken. Een van deze eiwitten betreft het menselijk T cel receptor CD3 complex (TCR-CD3), dat tenminste uit acht eiwitketens bestaat, namelijk de αβ-keten, het δε- en εγ-dimeer en het ζζ-dimeer. Er zijn nog steeds discussies gaande of dit werkelijk de samenstelling is van het TCR-CD3 complex. In hoofdstuk 1 wordt verder een introductie gegeven over de bacteriofaag T4, een virus dat in staat is bacteriën te infecteren. Het virus heeft de uiterlijke kenmerken van een maanlander. Het virus heeft 6 lange en 6 korte pootjes die aan de gastheercel binden voor en tijdens de infectie. Deze pootjes zorgen ervoor dat tijdens de infectie de bacteriofaag zijn DNA via een zogenaamde injectiespuit kan injecteren in de gastheercel. Er was nog weinig structurele informatie beschikbaar over deze pootjes. Na infectie vermenigvuldigt de bacteriofaag zich in de gastheer totdat deze openscheurt en de nieuwe bacteriofagen vrij komen.
De overproductie en zuivering van verschillende CD3 ketens leverde geen gevouwen eiwitten op, wat de poging tot kristallisatie deed mislukken. In diezelfde periode werd de NMR structuur beschreven van het CD3εγ heterodimeer, dit deed mij besluiten de hoofdlijn in het onderzoek te verschuiven. In plaats van op de kristallisatie werd het onderzoek gericht op de associatie tussen de verschillende heterodimeren in vivo. In hoofdstuk 2 is de invloed beschreven van mutaties in de CD3γ keten op de associatie
in vivo van het CD3εγ dimeer en de daaropvolgende T cel receptor CD3 complexvorming. De resultaten laten zien dat bepaalde aminozuren in de CD3γ keten erg belangrijk zijn voor een goede associatie van het CD3εγ heterodimeer. Sommige mutaties verhinderen een goede vorming van het αβδεεγζζ complex op het celmembraan, ondanks het feit dat FACS analyse aantoonde dat de cellen CD3 positief zijn. Mogelijkerwijs is in deze cellen de samenstelling van het TCR-CD3 complex op het cel-oppervlak veranderd in αβδεδεγζζ. Aangezien de CD3δ keten grote overeenkomsten vertoont met de CD3γ keten zou dit een mogelijkheid kunnen zijn. Tevens werden gesynthetiseerde peptiden van de intracellulaire domeinen van CD3δ en CD3ε gebruikt voor kristallisatie en NMR experimenten. Uit deze experimenten blijkt dat de beide peptiden onder de heersende omstandigheden zich niet in een gevouwen conformatie bevinden en daardoor structuurbepaling uitgesloten is.
In hoofdstuk 3 is de kristalstructuur van het receptorbindende domein van de korte pootjes van de bacteriofaag T4 beschreven. De structuur bestaat uit drie identieke ketens die als in een knotje in elkaar geweven zijn. In het midden van deze drie ketens is een zink ion aanwezig. Alle drie de ketens binden aan dit ion door middel van twee histidine aminozuren. Dit zink-ion blijkt voor een grote stabilisatie van het trimeer te zorgen, want wanneer het verwijderd wordt door middel van EDTA blijkt het receptor bindende domein bij verhitting uit elkaar te vallen. Terwijl bij aanwezigheid van zink het receptorbindende domein bij verhitting niet ontvouwt. Tevens worden in hoofdstuk 3 resultaten beschreven betreffende hetzelfde eiwit maar dan gekristalliseerd in een andere ruimtegroep. In deze kristalvorm blijkt een groter deel van de elektronendichtheid geordend te zijn in vergelijking met de eerder verkregen kristallen. In deze extra elektronendichtheid kon de structuur van een fragment van de korte pootjes (het 33 kDa fragment) worden ingebouwd. Echter tot op heden was het niet mogelijk om overal in deze extra elektronendichtheid aminozuren te bouwen.
In samenwerking met de universiteit van Wageningen kristalliseerde ik een serine protease inhibitor (PSPI, potato serine protease inhibitor) uit aardappel en kon ik een natieve dataset tot 1.8 Å meten. Deze resultaten staan beschreven in hoofdstuk 4. Deze protease inhibitors zijn onlangs in de belangstelling gekomen vanwege hun mogelijke anti-kanker activiteit. De PSPI is het eerste “double-headed” dimeer waarvan de kristallisatiecondities zijn beschreven. Andere protease inhibitors waarvan de driedimensionale structuur bekend is, zijn of een “double-headed” monomeer dan wel een “single-headed” dimeer. Helaas was geen van de aanwezige structuren in de PDB geschikt als zoekmodel in de Molecular Replacement. De gemaakte derivaten vertoonden een te lage bezetting van de zware atomen of verstoorden het kristalrooster, waardoor de structuur nog niet bepaald kon worden.
In hoofdstuk 5 worden de resultaten beschreven van de structuurbepaling van menselijk lactoferrine (hLF) geproduceerd in melk van transgene koeien. Dit onderzoek werd uitgevoerd in samenwerking met Pharming te Leiden. De resultaten laten zien dat ondanks de verschillen in N-linked glycosylatie, de kristalstructuur van hLF uit transgene koeienmelk overeenkomt met die van hLF geïsoleerd uit menselijke melk. Er was door Pharming aangetoond dat er geen verschil is in beide lactoferrines, getest in diverse biochemische experimenten en deze structuurbepaling bevestigt de mogelijkheid transgene koeien te gebruiken voor de productie van menselijke recombinante eiwitten in melk.