Diabetes is uitgegroeid tot een wereldwijde epidemie. Type 2 diabetes (T2D) neemt ongeveer 90% van alle diabetes gevallen in beslag en wordt gekarakteriseerd door insulineresistentie (IR) in belangrijke metabole weefsels. De enorme stijging in het aantal T2D patiënten is gerelateerd aan de toename van het aantal mensen met overgewicht en vervetting van de organen, in het bijzonder de spieren, veroorzaakt door een overmaat aan voedselconsumptie en een verminderde fysieke activiteit. Echter, de exacte processen die leiden tot IR zijn nog niet bekend. Een belangrijke hypothese binnen het onderzoeksgebied naar de oorzaken van T2D is dat een verstoorde functie van de mitochondriën in de skeletspier leidt tot een verlaagde capaciteit om vetzuren te oxideren, wat resulteert in een ophoping van vetten in de spiercellen (intramyocellulaire lipiden, IMCL). Verhoogde concentraties IMCL en intermediairen daarvan induceren daarop IR door een proteïne kinase te activeren, welke de insuline signalering en daarmee glucose opname verstoort. Recente studies hebben deze theorie in twijfel getrokken and linken IR aan een toegenomen in plaats van afgenomen capaciteit om vetzuren te oxideren. De hoge vetzuuroxidatie snelheden zoals waargenomen in insulineresistente spier zijn geassocieerd met een lage complete vetzuuroxidatie en een verhoogde incomplete ‐oxidatie. Daarom is gesuggereerd dat de ophoping van incompleet gemetaboliseerde vetzuren in de mitochondriën ‘mitochondriële stress’ veroorzaakt, wat zou leiden tot IR. Ter verheldering van deze kwestie worden in dit proefschrift de mitochondriële aanpassingen in skeletspier tijdens de ontwikkeling van IR and T2D nader onderzocht middels het gebruik van in vivo (31P en 1H magnetische resonantie spectroscopie (MRS)) en in vitro (o.a. mitochondriële respiratie metingen en bepaling van mitochondriaal DNA en acylcarnitine niveaus) methodes.
De tegenstrijdige resultaten aangaande de rol van mitochondriële disfunctie in T2D zouden verklaard kunnen worden door de verschillende technieken die gebruikt zijn om de mitochondriële functie in de spier te bepalen. In vitro methodes, zoals de bepaling van genexpressie niveaus, enzym activiteiten, het aantal mitochondriën, de morfologie van mitochondriën en mitochondriële respiratie, geven specifieke informatie over verschillende aspecten van mitochondriële functie, maar de resultaten kunnen niet direct vertaald worden naar in vivo mitochondriële functie. Met behulp van 31P MRS kan de energetische status van de spiercel in vivo worden bepaald door het meten van fosfocreatine (PCr), ATP en anorganisch fosfaat (Pi). In de literatuur zijn twee verschillende 31P MRS methodes toegepast om de mitochondriële functie van skeletspier in vivo te bepalen, namelijk het meten van (1) de ATP synthese flux in rust met behulp van een saturatie transfer (ST) experiment en (2) de snelheid van PCr herstel na inspanning met dynamische 31P MRS. Echter, deze methodes leveren totaal verschillende parameters, te weten de snelheid van het basale metabolisme en de maximale oxidatieve capaciteit. In hoofdstuk 2 van dit
proefschrift zijn beide methodes vergeleken in ratten met mitochondriële disfunctie door behandeling met de complex I remmer diphenyleneiodonium (DPI), met het doel om te bepalen welke methode het meest geschikt is om de mitochondriële functie van de spier in
vivo te meten. Terwijl de dynamische 31P MRS metingen na inspanning lieten zien dat het herstel van PCr 46% langzamer was in ratten behandeld met DPI, was de ATP synthese flux in rust gemeten met ST niet verschillend ten opzichte van controle ratten. Deze resultaten tonen aan dat in vivo mitochondriële functie in de spier directer en gevoeliger bepaald wordt door de PCr herstelsnelheid na inspanning dan door ST metingen in rust.
In hoofdstuk 3 is de pH‐afhankelijkheid van de PCr hersteltijdsconstante, PCr, onderzocht. Verzuring van spierweefsel vertraagt de PCr hersteltijd en bemoeilijkt de interpretatie van PCr als maat voor oxidatieve capaciteit. Door meerdere inspanningsprotocollen met een variërende intensiteit uit te laten voeren door elke proefpersoon konden we concluderen dat het effect van verzuring op de PCr herstelsnelheid verschilt tussen personen en dat een algemene correctiefactor voor verzuring dus niet toepasbaar is. Daarnaast is aangetoond dat de pH‐afhankelijkheid van PCr correleert met de snelheid van de protonenflux uit de spier.
In de hoofdstukken 4‐6 is 31P MRS toegepast om de rol van mitochondriële disfunctie in de spier in de ontwikkeling van IR en T2D nader te onderzoeken. Hoofdstuk 4 beschrijft een cross‐sectionele studie waarin patiënten, die reeds lange tijd T2D hebben, vergeleken worden met personen in een vroeg stadium van T2D en met personen met een normale bloedglucose homeostase. Elke groep bestond uit mannen met gemiddeld dezelfde leeftijd, lichaamssamenstelling en een laag niveau van dagelijkse lichaamsbeweging. De resultaten laten zien dat mitochondriële disfunctie niet noodzakelijk een oorzaak of gevolg van IR en/of T2D is. De verstoring in mitochondriële functie in T2D patiënten zoals in eerdere studies is aangetoond lijkt eerder een gevolg te zijn van een verlaagde fysieke activiteit en/of een verstoorde insuline signalering.
Met een diermodel van IR, zoals Wistar ratten op een hoog‐vet dieet, is het mogelijk om longitudinale studies uit te voeren en daarmee een inzicht te krijgen in het tijdsverloop van veranderingen in mitochondriële functie tijdens de ontwikkeling van IR. In hoofdstuk 5 is de mitochondriële functie en vetophoping in de spier in vivo en in vitro bepaald in Wistar ratten na 2,5 en 25 weken hoog‐vet dieet. Op de korte termijn (2,5 week) leidde het hoog‐ vet dieet tot een stijging van IMCL en acylcarnitines in het spierweefsel en een verhoogde oxidatieve capaciteit van de spier in vivo, welke volledig verklaard kon worden door een toename in het aantal mitochondriën. Na 25 weken hoog‐vet dieet was de vetophoping in de spier verder toegenomen, net zoals het aantal mitochondriën en de capaciteit van de mitochondriën om in vitro vet te oxideren. Echter, de in vivo oxidatieve capaciteit van de spier was niet verhoogd, wat wijst op een verlaagde mitochondriële functie in vivo die gecompenseerd wordt door een verhoogd aantal mitochondriën. De ogenschijnlijke
tegenstelling tussen de in vitro en in vivo bepalingen van mitochondriële functie wordt mogelijk veroorzaakt door factoren die geen rol spelen bij de in vitro metingen.
In hoofdstuk 6 wordt, net zoals in hoofdstuk 5, aangetoond dat in ratten op hoog‐vet dieet vrij carnitine in de spier significant is verlaagd, terwijl de middellange‐ en lange‐keten acylcarnitines zijn toegenomen. De verhoogde acylcarnitine niveaus in de spier duiden erop dat de mitochondriële disfunctie geobserveerd in vivo veroorzaakt kan zijn door een hoge concentratie vetmetabolieten, wat lijkt te worden bevestigd door de bevinding dat mitochondriën van ratten op een hoog‐vet dieet vatbaarder zijn voor vetzuur‐geïnduceerde ontkoppeling in vitro. Bovendien wordt in dit hoofdstuk aangetoond dat carnitine supplementatie wel het carnitine tekort in de spier normaliseert, maar niet bijdraagt aan een verbetering van de lipide huishouding en de in vivo mitochondriële functie van de spier.
De bevindingen die beschreven zijn in dit proefschrift zijn in overeenstemming met eerdere studies die aan hebben getoond dat IR correleert met een verhoogde in plaats van verlaagde vetzuuroxidatie, met een ophoping van incompleet gemetaboliseerde vetzuren en mitochondriële disfunctie als gevolg. Daarnaast is onomstreden vastgesteld dat het gebruik van een combinatie van verschillende technieken, bij voorkeur zowel in vivo als in
vitro, essentieel is voor een grondig onderzoek naar de mitochondriële functie in
skeletspier.
Dankwoord
Het is gelukt! Vier jaar werk is nu gebundeld in dit proefschrift. Maar dat was me zeker niet gelukt zonder de samenwerking met en begeleiding van verschillende personen. Het is dan ook niet overbodig om hen op deze plaats daarvoor te bedanken.
Allereerst natuurlijk Klaas, als professor van de Biomedical NMR groep en promotor van mijn promotieonderzoek heeft u in een paar jaar tijd van een klein hecht clubje een groep gemaakt die goed op de kaart staat. Dit heeft er ook voor gezorgd dat u het alleen maar drukker kreeg, maar toch wist u eigenlijk altijd tijd te maken wanneer het nodig was: van het bespreken en interpreteren van nieuwe resultaten tot het corrigeren van papers en hoofdstukken. Uw positieve manier van becommentariëren heb ik altijd erg gewaardeerd. Jeanine, wat ben jij belangrijk geweest voor de totstandkoming van dit boekje! Je wilde overal betrokken bij zijn en ik kon altijd bij je binnenlopen. Je persoonlijke benadering om duidelijk te maken wat wel en wat niet in overeenstemming was met jouw ideeën vond ik erg prettig, net zoals alle gesprekken over privesituaties. Bedankt voor alles wat je voor me hebt gedaan, ik heb vooral ook door jou de afgelopen 4 jaar met veel plezier gewerkt! Jolita, without you the in vitro experiments would not be of such a high quality as they are now. The dedication with which you work in the lab is really unbelievable and this is directly resulting in the nicest results. Besides a very good researcher, I learned to know you as a very pleasant person. I enjoyed our trip to Rome really a lot!
Sander, vooral de laatste tijd hebben onze wegen elkaar gekruist. Met jullie lab technieken heb je een enorme toegevoegde waarde gehad in onze studies. Zeker ook omdat de samenwerking altijd zo prettig verliep, vind ik het erg jammer dat je uiteindelijk toch niet in mijn commissie kunt zitten. De samenwerking tussen jullie lab van het AMC en de Biomedical NMR groep gaat zeker nog veel mooie studies opleveren!
Voor de humane type 2 diabetes studie heb ik met veel plezier samen gewerkt met Luc van Loon en Stephan Praet. Luc, eigenlijk ben ik door jou hier op de TU/e terecht gekomen toen ik bij je aanklopte voor een afstudeerstage. Naast je wetenschappelijke adviezen zal ik vooral je wijze raad die je gaf na een afsluitingsetentje in Veldhoven over samenwonen nooit meer vergeten! Stephan, jouw enthousiasme heeft me in het begin weleens overdonderd, maar ik weet zeker dat dit een belangrijke bijdrage heeft gehad aan de berg aan data die we hebben geproduceerd en wat geleid heeft tot een mooi resultaat.
Wie ik zeker niet wil vergeten zijn alle vrijwilligers voor de humane studies: zowel voor de pilot studies; Ad, Ben, Sjaak en Jan, als voor de studie beschreven in hoofdstuk 3; Ewelina, Jeanine, Gustav, Koen, Ben en Toon (ook bedankt natuurlijk voor alle andere klusjes waarmee je me geholpen hebt, zoals het plakken van mijn fietsband: ideaal zo’n
conciërge!), en de vrijwilligers die mee hebben gewerkt aan de studie beschreven in hoofdstuk 4.
Joep van Lier, bedankt voor het delen van jouw ‘fit’ ervaring. Ook al was wat je deed voor mij soms een grote puzzel, door jouw hulp zijn onze saturatie transfer data zeker betrouwbaar gefit. Marije, de uurtjes bij de scanner voor onze ‘pH studie’ samen waren een stuk gezelliger dan wanneer ik er alleen zat. Helaas zijn de data nog niet in dit boekje verschenen, maar het wordt zeker nog een mooie publicatie. Iedereen in het Scheikunde lab bedankt voor de hulp bij het uitvoeren van de ELISA’s.
Naast goede wetenschappelijke contacten, zijn niet of minder wetenschappelijke contacten belangrijk om zo goed mogelijk te presteren. De sfeer in de vakgroep heb ik als erg prettig ervaren, zeker toen bleek dat er 20 collega’s enthousiast te krijgen waren voor een korfbaltoernooi. In de afgelopen 4 jaar heb ik een aantal kamergenootjes gehad, waarmee ik tegenslagen maar zeker ook mooie momenten heb meegemaakt. Ewelina, I am very happy that you will be very close to me during my defense as my usher, just as you were during my whole PhD project. Hopefully next year we can arrange our plan to visit Poland together! Bram, Tessa en Leonie, B2.03 was echt een top kamer. Ik ga de leuke gesprekken en gezelligheid zeker missen. Geralda, ondertussen zit je alweer een jaar in Utrecht, maar gelukkig hebben we nog steeds leuk contact. De tenniscarrière, ooit zo mooi begonnen in Geldrop, kunnen we voorlopig maar beter even in de koelkast zetten. Houden we het toch gewoon bij een etentje op zijn tijd? Ward, jij blijft toch ook meedoen met de etentjes? Erg fijn dat de mooie resultaten waar je zo hard voor hebt gewerkt er nu zijn en je boekje er dan toch echt lijkt te komen!
Dan zijn er nog een aantal collega’s van de Biomedical NMR groep die ik hier wil vernoemen. Bart, ik zal je spannende weekend verhalen tijdens de pauze gaan missen! Succes met het voortzetten van ons werk en als opperorganisator van de groepsuitjes. Richard, soms zit het tegen, maar als het dan eenmaal lukt gaat het echt meezitten en resulteert alle moeite in erg mooie studies! Hou vol, positief blijven en dan weet ik zeker dat je een prachtig boekje krijgt. Het blijft natuurlijk wel erg jammer dat onze spiervezelkleuringen van cross‐secties van de hele TA mijn boekje niet op fleuren. Larry, je was vaak een rots in de branding als er weer eens brokken waren aan de 1.5T scanner of wanneer ik als niet‐technicus technische hulp nodig had, bedankt daarvoor. Voor mij als nuchtere Brabantse meid was je af en toe een vreemde vogel, maar wel een aardige. Jo, David en in het bijzonder Leonie bedankt voor al jullie biotechnische hulp bij de OGTT’s, DEC protocollen enz. Hedwig en Ria, ik ben jullie dankbaar voor de hulp met alle administratieve rompslomp die bij (de afronding van) een promotie project komt kijken. Jef, ook al luisterden we niet altijd naar je koffie oproep, toch waren de pauzes en BBQ’s na het Nlaag voetbal toernooi erg gezellig! Henk, door al het werk wat jij hier hebt gedaan, heb ik een vliegende start kunnen maken en jouw werk door kunnen zetten. Verder wil ik
natuurlijk Gustav, Jeroen, Holger, alle andere collega’s, (ex‐) aio’s en studenten van de Biomedical NMR groep heel erg bedanken voor de leuke pauzes en groepsuitjes.
Zoals iedereen die mij een beetje kent wel weet, is korfbal een belangrijke bezigheid voor mij. Ook al lijkt het soms misschien niet zo, toch is het een heerlijke ontspanning en uitlaatklep. Dat komt voor een groot deel natuurlijk ook door ons gezellige, no‐nonsense, maar vooral ‘hechte’ team! Naast het zelf spelen mag ik natuurlijk de meiden van de A1 niet vergeten, jullie zijn toppers. Als ik chagrijnig was kwam het waarschijnlijk door de stress om dit boekje, mijn verontschuldigingen daarvoor. Dimphy, ik vind het fijn dat ik altijd bij je terecht kan, voor advies, opbeurende woorden, je realistische blik, maar zeker ook voor gezelligheid! Doreen, there is something, something I want to tell you… je bent een geweldig vriendinnetje! Ik hoefde dan ook niet lang na te denken wie ik als paranimf achter me wil hebben staan. Ons Maastricht/sinterklaas clubje: Anne, Janneke, Marije, Marijn en Nicole, ik hoop dat we nog lang de vriendinnen blijven die we nu zijn, op naar ons 10‐jarig jubileum! Frans en Nicolien, vanaf de eerste dag heb ik me welkom gevoeld bij jullie. Jullie interesse en betrokkenheid in de stappen die Koen en ik namen zijn erg belangrijk voor ons. Luc, ik ben er nu ook van overtuigd dat de uren die Koen en jij achter de computer doorbrachten meestal niet door jou kwamen. Succes, maar vooral ook veel plezier nog met je Utrechtse studentenleventje! We komen binnenkort echt een keer naar je kamer kijken, dus zet die wereldgerecht pakken maar klaar.
Pap en mam, hierbij wil ik jullie ook ontzettend bedanken voor alle vrijheid en mogelijkheden die jullie me altijd gegeven hebben. Ook al hebben jullie weinig kaas gegeten van mitochondriën, jullie zijn geïnteresseerd in alles wat ik doe en meemaak, waardoor ik altijd graag thuis kom. Zo zijn de voetbalavonden samen met Kees nog steeds gezellig. Suus, ik ben blij dat je mijn zusje bent en ik heb altijd al geweten dat je zo’n goede juf zou worden als je nu bent, ik ben trots op je! Ook al vond je het niet nodig, toch wil en kan ik jou hier niet onvermeld laten Koen. Je bent belangrijk voor me, om teveel redenen om hier op te noemen. Ik ben benieuwd waar onze ‘(trein) reis’ ons nog allemaal gaat brengen!