Samenvatting
Samen
vatting
Samenvatting
De gemiddelde levensverwachting is de laatste jaren enorm gestegen, met als gevolg dat het aantal ouderdom-gerelateerde aandoeningen ook toeneemt. Weefseltechnologie en stamcel therapieën zijn dus hard nodig. Weefseltechnologie (of tissue engineering) heeft als doel het vervangen of repareren van een defect weefsel waarbij cellen worden gecombineerd met een dragermateriaal, terwijl in stamcel therapieën vaak gebruik wordt gemaakt van losse cellen.
Zoals samengevat in hoofdstuk 2, vormen humane mesenchymale stamcellen (hMSCs) een interessante bron van stamcellen voor cel therapieën en weefseltechnologie. Dit omdat deze cellen in staat zijn zich te vormen tot verschillende weefsels, zoals bot, kraakbeen, vet en endotheel. Ook scheiden deze cellen een groot aantal groeifactoren uit welke de omgeving kunnen beïnvloeden. Deze kunnen bijvoorbeeld een immunologische reactie reduceren, maar ook bijdragen aan neo-angiogenese, overleving van cellen en het voorkomen van littekenweefsel. Een groot aantal klinische onderzoeken is op dit moment bezig, of al afgerond, om deze immunologische en trophische effecten van MSCs te onderzoeken, voornamelijk voor autoimmuun ziekten, hartinfarcten en nierfalen. Hoewel soms veelbelovend, zijn de resultaten tot op heden echter nog niet erg consistent en de implementatie van gestandaardiseerde protocollen leidt er hopelijk toe dat verschillende studies onderling vergeleken kunnen worden en dat eenduidige conclusies kunnen worden getrokken.
Voor toepassingen in bot weefseltechnologie wordt er over het algemeen aangenomen dat de differentiatie van stamcellen naar botcellen de botformatie in vivo bevordert. Maar, niet elk molecuul dat differentiatie van hMSCs induceert, resulteert ook in een toename van de botformatie in vivo. We hebben al eerder aangetoond dat behandeling van hMSCs met het molecuul db-cAMP, waarmee de protein kinase A (PKA) signaal transductie route wordt geactiveerd, zowel de differentiatie als de botformatie verbetert. In hoofdstuk 3 hebben we deze differentiatie proberen te optimaliseren, door andere moleculen welke ook de PKA route activeren te onderzoeken, en we hebben hierbij aangetoond dat ook behandeling met forskolin een positief effect heeft op botformatie. Hoewel de hoeveelheden nieuw gevormd bot niet significant hoger waren dan met db-cAMP, bevestigt dit onze data dat activatie van PKA tot meer bot leidt.
Afgezien van het type PKA activator speelt ook de manier waarop PKA geactiveerd wordt een belangrijke rol, en dan vooral de lengte en de sterkte van het signaal. In hoofdstuk 4 laten we zien dat stimulatie van hMSCs met liganden voor de GPCR receptor, welke de PKA route zouden activeren, geen effect heeft op differentiatie van hMSCs. Ook had activatie van PKA met tussenpozen een tegengesteld effect vergeleken met continue stimulatie. Dit leidde tot een afname van de activiteit van alkalische phosphatase (een
187
Samenvatting
Samen
vatting
marker voor bot differentiatie), terwijl deze juist toenam door continue stimulatie. Dit suggereert dat niet alleen de sterkte, maar mede de lengte van het signaal bepaalt welk effect PKA activatie op de cellen heeft.
In hoofdstuk 5 zagen we dat stimulatie van hMSCs met een andere cAMP-analoog (8-br-cAMP) vet differentiatie induceert en dat dit effect nog sterker werd in combinatie met dexamethasone. Dit duidt erop dat PKA niet alleen betrokken is bij bot differentiatie, maar ook een rol speelt in de balans tussen vet en bot differentiatie. Onze data wijst er verder op dat behandeling met 8-br-cAMP leidt tot een sterkere activatie van PKA en cAMP-doelgenen. Ander onderzoek suggereert dat bij hoge concentraties niet alleen PKA, maar ook Epac, welke betrokken is bij vet differentiatie, wordt geactiveerd. Hogere PKA activiteit of activatie van Epac lijkt dus te correleren met vet differentiatie.
In hoofdstuk 3 lieten we zien dat de genexpressie van insulin-like growth factor (IGF- 1) en bone-morphogenetic protein-2 (BMP-2) toenemen na activatie van PKA in hMSCs. Wanneer deze groeifactoren door de cel worden uitgescheiden, kunnen ze de cellen in de omgeving beïnvloeden. In hoofdstuk 6 laten we zijn dat behandeling van hMSCs met db-cAMP inderdaad leidt tot een toename van deze groeifactoren in het medium, en dat deze biologisch actief zijn. Geconditioneerd medium van db-cAMP-behandelde cellen verbeterde de groei en de bot differentiatie van hMSCs, vergeleken met medium van niet-behandelde cellen. Dit wijst erop dat deze uitgescheiden groeifactoren een rol kunnen spelen bij de botformatie in het lichaam.
Aangezien we in hoofdstuk 6 zagen dat IGF-1 in hoge concentraties wordt uitgescheiden na behandeling met db-cAMP, hebben we in hoofdstuk 8 gekeken welke effecten IGF-1 heeft op hMSCs. We vonden hierbij dat IGF-1 de groei en differentiatie van hMSCs bevordert, maar de aanwezigheid van serum en de gebruikte concentratie spelen hierbij een belangrijke rol. Vervolgens is het effect van IGF-1 overexpressie op botformatie onderzocht, door MSCs adenoviraal te transduceren met adIGF-1, adBMP-2 of beide. We vonden hierbij dat, vergeleken met een mock-transductie, de botformatie enigszins was verhoogd in de adIGF-1 groep, terwijl grote hoeveelheden bot waren gevormd in de adBMP-2 groep. Nog meer bot was gevormd in de co-transductie groep (adIGF-1 en adBMP-2). Opmerkelijk was dat de secretie van BMP-2 in deze groep hoger lag dan na transductie met BMP-2 alleen, wat erop duidt dat adIGF-1 de transductie met adBMP-2 bevordert. Echter, hierdoor kunnen geen conclusies worden getrokken over het effect van IGF-1 op BMP-2-geïnduceerde botformatie.
Naast de secretie van bot groeifactoren, zou de secretie van angiogene groeifactoren de formatie van bloedvaten in een construct kunnen bevorderen, wat cruciaal is voor het overleven van de cellen. Aangezien de therapeutische effecten van MSCs in hartinfarcten en nierfalen ook grotendeels worden toegedicht aan de secretie van
Samenvatting
Samen
vatting
dit soort groeifactoren, zou een toename van deze uitgescheiden factoren ook in de weefselregeneratie de effecten van hMSCs kunnen verbeteren. Wanneer cellen onder lage zuurstofconcentraties (hypoxia) worden gekweekt scheiden ze meer van deze angiogene groeifactoren uit en nemen de therapeutische effecten inderdaad toe. Het kweken van cellen op deze manier is echter lastig en relatief duur. Daarom hebben we in hoofdstuk 7 een grote screen gedaan op een geïmmortalizeerde MSC lijn. Deze cellijn bevat een hypoxia response element (HRE) en hiermee kunnen moleculen die de hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) signaal transductie route activeren geïdentificeerd worden. Phenanthroline was de meest veelbelovende hit en verder onderzoek naar de mechanismen van dit molecuul liet zien dat deze sterke expressie van HIF-1 doelgenen induceert. Opmerkelijk was dat phenanthroline de expressie en secretie van interleukine-8 verhoogde, terwijl hypoxia en de bekende hypoxia-mimiek desferoxamine geen effect hadden op interleukine-8. Verder laten we zien dat geconditioneerd medium van phenanthroline-behandelde cellen dezelfde effecten heeft als geconditioneerd medium van hypoxia cellen, en dit molecuul vormt dus een goed alternatief.