de gezondheid van de cellen op een negatieve manier beïnvloeden De HeLa

cellen werden geëvalueerd op verschillende parameters om de kwaliteit van hun interne homeostase te kunnen beoordelen. De metabolische activiteit, de totale productie van radicalen, veranderingen in genetisch gedrag en de regulering van eiwitten werden gecorreleerd aan het aantal geschatte opgenomen diamantdeeltjes. De nanodiamanten hadden geen invloed op de normale homeostase van de cel en kunnen beschouwd worden als veilig in gebruik, zeker wanneer het gebruikt wordt in gebruikelijke concentraties voor magnetometrie (rond 1 µg/ml).

In Hoofdstuk 5 hebben we een interessante vraag opgelost in het veld van het sturen van diamantdeeltjes. In dit veld wordt stevig gediscussieerd of het covalent hechten van antilichamen op het oppervlakte van nanodiamanten beter werkt dan fysische adsorptie. Hier hebben wij dit vergeleken en gevonden dat beide methodes werken in specifieke situaties, waarbij wij op de nucleus van de cel aangestuurd hebben. We hebben een grote variatie aan verschillende antilichaam-diamant concentratieratio's, incubatietijden en verschillende protocolaanpassingen getest om de diamant zo efficiënt mogelijk bij de celkern te krijgen. Door het maken van Euclidian Distance Maps van onze confocale beelden, konden wij de afstand van de deeltjes tot de nucleus in de verschillende condities vergelijken. Door middel van geadsorbeerde antilichaam-diamanten kan men deze na een lange incubatie tijd, ongeveer 24 uur, grotendeels terugvinden in kort bereik van de nucleus. Wanneer cellen worden gebruikt die gefixeerd zijn (een techniek die meer lijkt op traditionele immunohistologie) laten diamanten die covalent gebonden zijn aan een secundair antilichaam veelbelovende resultaten zien. Daarbij hebben we met onze zelfgebouwde confocale microscoop een protocol ontworpen om de diamant heel precies te volgen bij zijn reis door de cel en daarmee een traject te maken van het pad dat de diamant aflegt. Met behulp van wiskundige vergelijken in speciale software konden we een grote variëteit aan parameters beschouwen die ons meer vertellen over de exacte bewegingen die het diamantdeeltje in de cel maakt.

Een belangrijke eigenschap van fluorescente nanodiamanten, zoals initieel genoemd, is de mogelijkheid om geactiveerd te worden met een elektronenstraal. In Hoofdstuk 6 hebben we fluorescente nanodiamanten gebruikt om een licht te schijnen op twee verschillende biologische vraagstukken. Ten eerste wilden we de opname van nanodiamanten in macrofagen visualiseren. Ten tweede hebben we de diamanten op een indirecte manier verbonden aan antilichamen, zodat we ze konden utiliseren als een immunologisch label. Streptavidine werd geadsorbeerd op het oppervlak van FNDs, en dit werd gebruikt om het te verbinden aan biotine. De biotine-streptavidine verbinding is beroemd binnen de biologie om zijn zeer moeilijk te verbreken connectie. Het gebruikte Biotine was geconjugeerd aan een secundair

139

Summary / Samenvatting

antilichaam. Deze secundaire antilichamen zijn relatief goedkoop en reageren met het naar buiten gerichte dierspecifieke domein van een primair antilichaam. Het primaire antilichaam was gericht tegen een transmembraan eiwit van een cellijn die HT29 genoemd wordt. In deze coloncarcinoom cel wordt het eiwit EpCAM extra veel geproduceerd. In dit geval was EpCAM ook gefuseerd met een groen fluorescent eiwit (GFP), waardoor de visualisering van EpCAM en de visualisering van de nanodiamanten tegelijkertijd mogelijk was. Hiermee kon een maat gegeven worden aan de kwaliteit van de immunologische labeling. Adsorptie van streptavidine op het oppervlak van diamantdeeltjes vergroot de bruikbaarheid van de diamantcomplexen enorm, omdat het gebruikt kan worden om ieder antilichaam met een biotine label aan te tonen. Alle samples die we verkregen van deze experimenten werden gevisualiseerd in drie verschillende opzetten: (1) een traditionele confocale microscoop, (2) een zelf gebouwde confocale microscoop / magnetometer en (3) een geïntegreerde elektronenmicroscoop. In de traditionele confocale microscope vonden we dat de nanodiamanten en het GFP beiden zichtbaar waren vooraf aan de bewerkingen voor elektronenmicroscopie, maar dat alleen de nanodiamanten zichtbaar waren naderhand. Dit komt omdat gedurende het bewerkingsprotocol een post-fixatie stap moet worden uitgevoerd, in welke Osmium tetroxide gebruikt wordt. Deze stof vernietigt de werking van normale fluorescerende eiwitten en organische kleurstoffen. Omdat het NV-center zich bevindt binnenin de extreem resistente nanodiamant, blijft de fluorescentie behouden. In onze zelfgebouwde microscoop konden we zien dat zelfs na deze bereiding het nog steeds mogelijk was om een Optically Detected Magnetic Resonance spectrum te maken, een soort unieke handtekening voor het Nitrogen-Vancy center. Uiteindelijk hebben we gedemonstreerd dat in de geïntegreerde elektronenmicroscoop, we niet alleen de nanodiamanten konden identificeren met secundaire elektronen, maar ook met het cathodoluminescente signaal. Met beide detectie technieken konden we enkele (niet geaggregeerde deeltjes onderscheiden.

Tot slot hebben we deze resultaten bediscussieerd in het licht van recente bevindingen, in Hoofdstuk 7. De alternatieven voor fluorescente nanodiamanten worden daar beschouwd en de implicaties van deze resultaten worden geëxtrapoleerd naar andere deeltjes en andere velden van onderzoek. Aan het einde wordt een vooruitzicht gegeven met aanwijzingen voor toekomstige richtingen in dit onderzoeksveld en een ultiem einddoel wordt voorgesteld.

Acknowledgements

Geachte lezer, dear reader,

You have made it all the way to the end of the thesis (or just skipped most of it to see if your name ended up in the list). This might well be the most important part of my whole thesis, as I can express my gratitude to those without whom this thesis would not have existed in the first place. The fact that my thesis is finished within 4 years and that I have been able to do so many different cool things is the result of a lot of different people who in any small or tremendously large way helped, motivated, supported, lectured, pushed, entertained and intoxicated me. And to all of you I want to give a huge THANK YOU! Thank you big-big!1

Dear Romana, I still very well remember our first meeting, which I later thought of as the most peculiar job interview I ever had. I think we talked 30 minutes about my profile and the PhD position and the remaining two hours about building a Lego Death Star with your lab. Without you I would have never finished my PhD as quick as it is done now. You have ever been so helpful in career advice and always put your (PhD) students and postdocs in the highest priority. I hope you will have a lot more success stories and happy PhD students in the future, show them how it’s done! Not so long ago, in the summer of 2018, Go joined this project as co-promotor. I am very glad to have such an enthusiastic scientist strenghten my promotion team and hope he will lead our group to more clinical approaches of research.

I would also like to express my very warm gratitude to the reading committee of my thesis. Henny, thank you for being a part as the representative of the department. I am also very grateful to have met Lou during my time in the Gopher board and am happy that you accepted to read and weigh my thesis. And of course I was delighted when François, who is a big name in the biological nanodiamond field, accepted to be part of my reading committee as well.

Thanks also to the department head Henk, for giving us so much freedom in the organization of my thesis and the facilitation of the process.

In addition I would like to express my gratitude to Nora, who so awesomely designed all the chapter arts which you see throughout this thesis and the cover art, it has become a lot easier to explain with these illustrations.

This work is the result of a huge amount of synergy within our research group.

Mayeul and Felipe were the people who I have spent almost my whole PhD with

and who helped me out in the understanding of physics and programming. Yori was the next to join our group and I am very happy that we could share our interest in the multiverse and portals! Thamir has invested a huge amount of time in getting

1 _{For those I forget to mention, make sure to let me know and there will be a nice ice-cold}

141

Dankwoord

Chapter 5 finished in time, to which I owe him a great debt. Although Kiran and me