reaction of a PDGFRA mutation in reaction of a PDGFRA mutation in
HOOFDSTUK 2 geeft een overzicht van recente literatuur over het gebruik van
ctDNA voor het monitoren van de respons op behandeling bij patiënten met een kwaadaardige tumor. Voor deze analyse zijn 82 studies gevonden met name over patiënten met longkanker met EGFR-mutaties, melanoom met BRAF-mutatie, darmkanker met een KRAS-mutatie en borstkanker met verschillende mutaties. De meeste publicaties betreffen relatief kleine patiëntenseries en er zijn vrijwel geen grote gerandomiseerde studies gepubliceerd. In de meerderheid van de studies wordt een duidelijke relatie gezien tussen de kwantitatieve detectie van mutaties en de respons op therapie van patiënten. CtDNA kan gebruikt worden voor het vaststellen van een vroege respons op de therapie. Dit is zichtbaar in een duidelijke daling van de hoeveelheid ctDNA na het starten van de behandeling gericht op de aanwezige mutatie. Dit is mogelijk in vrijwel alle patiënten met detecteerbaar ctDNA voor start van de behandeling (baseline). In sommige gevallen wordt er enkele dagen na start van de behandeling een kortdurende sterke stijging gezien van de hoeveelheid ctDNA. Dit kan worden veroorzaakt door massale afbraak van cellen en lijkt een positief effect meteen na start van de behandeling. Ondanks veelbelovende resultaten is progressie van ziekte tijdens de behandeling niet bij alle patiënten aan te tonen met behulp van ctDNA.
A
A
Gedurende de behandeling raken de meeste patiënten resistent voor therapie, dit wordt onder andere veroorzaakt door secundaire mutaties die de tumor ongevoeligAA
maken voor de initiële doelgerichte therapie. Deze resistente mutaties ontstaan tijdens de behandeling en kunnen ook gedetecteerd worden in ctDNA. Secundaire mutaties zijn echter vaak in lagere concentraties aanwezig dan de primaire mutatie en daardoor moeilijker te detecteren. Vooralsnog lijkt daarom de primaire mutatie het meest geschikt om de behandeling te monitoren.
Een van de problemen bij het analyseren van ctDNA is de vaak lage concentratie van het gemuteerde tumor DNA in cel vrij plasma. Het normale proces van cel-verval en -vernieuwing zorgt voor een altijd aanwezige achtergrond van niet gemuteerd DNA (wild-type) in het bloed afkomstig van normale weefsels. De fractie ctDNA in het plasma afkomstig van de tumor is in algemeen lager dan 0.1%. Daarom zijn gevoelige mutatie-detectie-methoden nodig om het ctDNA te kunnen detecteren. Voordat het DNA geanalyseerd kan worden moet het uit bloed geïsoleerd worden. Idealiter zou men alleen de kortere fragmenten isoleren die van de tumor afkomstig zijn en de wild-type fragmenten (afkomstig van gezond weefsel en witte bloedcellen) niet meenemen. In HOOFDSTUK 3 zijn drie verschillende methoden om ccfDNA uit het bloed te isoleren met elkaar vergeleken (Qiagen CNA kit (standaard in UMCG- laboratorium), Maxwell RSC cfDNA plasma kit en de Zymo manual quick cfDNA kit). Het geïsoleerde ccfDNA werd getest op integriteit met een door ons zelf ontwikkelde β-actine droplet digital PCR (ddPCR) assay en een DNA fragment analyzer. Dit liet zien dat de techniek met de hoogste opbrengst niet het beste scoort met betrekking tot de integriteit van het DNA. In de samples met de hoogste opbrengst werden veel langere wild-type fragmenten gevonden. Dit kan het gevolg zijn van witte bloedcellen die kapotgaan tijdens de procedure van het opwerken van het bloed. De hoogste opbrengst werd verkregen met de CNA kit, maar met de op magnetic beads gebaseerde RSC kit werden hogere aantallen gemuteerd DNA gevonden. Mogelijk dat de RSC kit bij voorkeur ctDNA isoleert. De verschillen in opbrengst en integriteit van het ccfDNA uit hetzelfde plasma tonen aan dat verschillende ccfDNA technieken de uitkomsten beïnvloeden zeker wanneer in opeenvolgende plasma samples de hoeveelheid ctDNA gebruikt wordt voor therapie adviezen. Wij zijn groot voorstander van (inter)nationale harmonisatie en standaardisatie van de isolatieprocedures uit plasma voordat de techniek breed ingezet kan worden in de kliniek.
Verschillende technieken zijn beschikbaar voor het analyseren van geïsoleerd DNA. Wij hebben gekozen voor een droplet digital PCR-techniek (ddPCR). Met deze techniek wordt het DNA verdeeld over +/- 20.000 minuscule druppeltjes die elk één DNA-fragment bevatten en vervolgens per druppel met een PCR geanalyseerd kunnen worden: dus we doen in één test 20.000 afzonderlijke PCRs wat resulteert in een hoge gevoeligheid (mutanten in een achtergrond van wildtype DNA kunnen worden gedetecteerd tot 0,05% afhankelijk van de hoeveelheid input DNA) en de relatief lage kosten per experiment. Ongeveer 60- 70% van de patiënten met GIST heeft een mutatie in exon 11 van het KIT-gen.
A
A
Om de meest voorkomende KIT exon 11 mutaties in patiënten met GIST te kunnen detecteren, hebben wij een specifieke assay ontwikkeld. Het ontwerp van dezeAA
assay en de eerste resultaten staan beschreven in HOOFDSTUK 4. Deze assay is ontwikkeld volgens het drop-off principe. Twee gelabelde probes (groen en blauw) kunnen binden aan het niet-gemuteerde (wild-type) DNA elk in een van twee mutatie ‘hotspot’ gebieden in KIT exon 11. In geval dat de ddPCR op normaal DNA wordt uitgevoerd, zullen beide probes aan het DNA binden en zullen in alle druppels zowel het groene als blauwe signaal zichtbaar zijn. Wanneer een mutatie aanwezig is in een van deze hotspot regio’s zal de probe die in het gebied met de mutatie ligt niet meer kunnen binden en wordt in de druppels dus maar 1 probe zichtbaar; de probe die niet kan binden (drop-off genoemd in het Engels) betekent dus dat er een mutatie aanwezig is in het DNA. Omdat mutaties in beide hotspots tegelijkertijd niet beschreven zijn functioneert 1 probe altijd als controle voor de hoeveel DNA die in de PCR zit. Met deze assay is het mogelijk om 70% van de bekende KIT exon 11 mutaties te detecteren. De assay is eerst getest op tumorweefsel en vergeleken met de resultaten van een andere techniek (next generation sequencing), in 21 van de 22 samples werd de mutatie gedetecteerd. Vervolgens is er getest op plasma samples van patiënten met een GIST. De mutatie in het ccfDNA kon gedetecteerd worden in 13 van de 14 patiënten met uitgezaaide ziekte en in 1 van de 8 patiënten met gelokaliseerde ziekte. Na het starten van de behandeling werd in eerste instantie een stijging van het aantal mutaties gezien in 5 van 11 patiënten wat mogelijk veroorzaakt wordt door een snel therapie effect en het hierbij behorende cel verval. Na het starten van de behandeling daalde het aantal gemuteerde fragmenten uiteindelijk in alle patiënten met een radiologische therapie respons (gebaseerd op CT-uitslagen). In HOOFDSTUK 5 zijn twee patiënten beschreven met een zeldzame PDGFRα mutatie. Beide patiënten hebben een mutatie die dichtbij het D842 domein ligt waarvan we weten dat het resistentie voor behandeling met tyrosine kinase remmers (TKI) veroorzaakt. De patiënten werden behandeld met verschillende TKI’s en hadden hierop een respons. Probes voor de detectie van patiënt-specifieke mutaties werden ontwikkeld om het verloop van de hoeveelheid van het ctDNA te kunnen volgen in het bloed. Tijdens de behandeling werd op verschillende momenten bloed verzameld en de mutaties werden gemeten om het beloop van de behandeling te monitoren. Bij progressie van ziekte werd een stijging gezien van het aantal mutanten in het plasma en na het starten van tweede en derde lijn behandeling daalde dit aantal weer, in overeenstemming met de radiologische respons. Om de gevoeligheid van de tumoren met deze zeldzame PDGFRα mutaties voor de behandeling met imatinib te verklaren, werd een 3D-eiwit model met het kinase domein van PDGFRα met de verschillende mutaties gemaakt. Dit 3D-model liet zien dat beide mutaties geen structurele veranderingen ten gevolge hebben in de eiwitten waarop imatinib aangrijpt en daarmee suggereert dat deze mutaties geen resistentie voor de behandeling als gevolg hebben.