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Bijlage 2. Energie-genormaliseerde toxiciteit vogels en zoogdieren
Afin de déterminer précisément si cette perte de mobilité chez les souches transgéniques se ferait plutôt tardivement ou précocement, nous avons eu recours à l’utilisation d’un logiciel, nouveau dans le domaine du C. elegans, à savoir WormLab®. Ce logiciel permet contrairement à WormTracker®, de mesurer entre-autre, la locomotion de chaque vers séparément et cela à travers le temps, sans limite du nombre de vers utilisés. Pour ce qui est de la mise en place, nous utilisons un microscope à dissection équipé d’une caméra, nous permettant de prendre des vidéos de nos vers lorsqu’ils se déplacent. La vidéo étant prise, nous pouvons l’analyser avec le logiciel qui détecte chaque ver individuellement, et calcule de nombreux paramètres tels que la vitesse de nage. En effet, les vers que nous utilisions nageaient dans 100 µL de M9. En résumé, l’expérience consistait à mettre 30 vers sur une plaque présentant une petit cercle d’agar se situant au milieu de la plaque afin que ces derniers restent dans le champ de vision de la caméra. Ensuite, nous ajoutions 100 µL d’M9 afin de les obliger à bouger, puis nous prenions la vidéo de 30 secondes. Puis, cette vidéo était analysée par le logiciel, détectant la majeure partie des vers sur la plaque, et calculant ainsi différents paramètres que nous choisissions par la suite selon leur pertinence.
Nous avons choisi différents jours dans la vie du C. elegans adulte, afin de déterminer si la toxicité de la protéine tau serait précoce ou plus tardive dans la vie de l’animal. Pour se faire, nous avons sélectionné les jours 1, 5, 9 et 13. Pour le jour 1, cela nous permet de savoir si le problème se déclenche rapidement au cours de la vie du ver, suggérant un problème lors du développement. De plus, avec le WormTracker®, nous avions vu des résultats intéressants dès le premier jour. Le jour 5 permet de voir si un problème pour l’une des souches se produirait vers la moitié de la vie active du ver puisqu’à partir du jour 12-15, le ver commence à être assez âgé et développe naturellement des problèmes moteurs imputés au vieillissement de l’animal. L’intérêt du jour 9 provient des résultats préliminaires obtenus par le test de paralysie, nous révélant le début d’un problème de motilité vers ce jour-ci. Enfin, le jour 13 permet d’avoir un spectre assez large du développement du phénotype et nous montre l’évolution de celui-ci dans des jours avancés pour l’animal
Pour le jour 1 (Figure 12A), nous retrouvons une vitesse plus importante pour la souche hypoP comparée au contrôle, confirmant les résultats observés avec le WormTracker®, et suggérant une hyperactivité neuronale nécessitant une tau hypoP. Pour la souche hyperP, là encore, comme avec le WormTracker®, la vitesse de cette dernière est bien inférieure au contrôle ainsi qu’à toutes les autres souches transgéniques, mettant en lumière la toxicité importante d’une protéine tau excessivement phosphorylée. De plus, cela suggère que les effets néfastes de cette protéine se produiraient rapidement lors du processus de développement du ver. Surprenamment la souche exprimant la protéine tau WT présente également une vitesse de nage accrue, résultats contradictoires avec ceux du WormTracker®. Cela peut s’expliquer car les deux logiciels ne mesurent pas la même chose. En effet, le WormTracker® mesure l’activité d’un puits contenant plusieurs vers qui vont être détectés par un faisceau lors de leurs mouvements répétés. Pour ce qui est de WormLab®, il détecte et mesure chaque ver individuellement, rendant plus précis l’analyse. Il se pourrait donc qu’avec le WormTracker®, on ne puisse pas détecter de façon aussi précise la vitesse de nage des vers, expliquant une moins grande significativité pour la souche hypoP comparée à WormLab®. Par ailleurs, on peut distinguer (Figure 11D) qu’à certains moments la souche a une plus grande activité par rapport au contrôle, et n’est jamais plus faible que ce dernier. De plus, le test statistique prend en compte l’activité des puits pendant les 5
heures d’expériences alors que le WormLab® lui, se base sur 30 secondes de vidéo uniquement. De ce fait, certains scores sont significativement plus élevés chez la tau WT comparée au contrôle mais sur l’ensemble des points cela ne l’est plus.
Figure 12. – Mesure de la vitesse de nage des souches transgéniques par le logiciel WormLab® (A) Vitesse de nage mesurée au jour 1, adulte pour les trois souches exprimant la tau humaine. (B) Vitesse de nage mesurée au jour 5 adulte pour les trois souches exprimant la tau humaine. (C) Vitesse de nage mesurée au jour 9 adulte pour les trois souches exprimant la tau humaine. (D) Vitesse de nage mesurée au jour 13 adulte. Diminution significative de la mobilité de toutes les
souches due au vieillissement des animaux. Tous les résultats sont présentés comme la moyenne ± de 3 expériences indépendantes. Chaque n représente 3 plaques contenant chacune 30 vers. Les résultats ont été testés par un Ordinary one-way ANOVA avec une correction de Dunnett, ** p<0.01, *** p<0.001 **** p<0.0001 par rapport au contrôle (N2). Les barres noires représentent les médianes de chaque souche, c’est-à-dire là où se situe 50% des vers. Chaque point représente un ver détecté par le logiciel.
Pour les trois autres jours (Fig 12B, 12C et 12D), la souche hyperP continue à avoir une vitesse inférieure à tous les autres modèles. Pour la souche hypoP, à partir du jour 5, la potentielle hyperactivité décelée précédemment, n’est plus présente, suggérant un effet transitoire, se produisant au début de l’âge adulte. Enfin, pour la tau WT, on peut observer qu’au début de la vie des vers, la vitesse de ces derniers est supérieure à celle du contrôle. Puis à un stade plus avancé, lorsque les animaux sont plus âgés (jour 13), une certaine toxicité de la tau apparait, se traduisant par une diminution prononcée de la vitesse de nage des nématodes.
L’ensemble de ces résultats suggèrent qu’en termes de toxicité, la protéine tau hyperP serait la plus nocive, puis viendrait le tour de la tau WT et pour finir la tau hypoP. Ceci est intéressant puisqu’on pourrait se dire que plus la tau est hyperphosphorylée, plus elle aura un effet toxique. Néanmoins, il est important de noter qu’avec ces résultats nous ne savons pas comment expliquer cette diminution de vitesse induite par l’expression de la tau humaine. L’hypothèse la plus probable est que, la protéine qui est exprimée uniquement dans les neurones moteurs, induirait leurs neurodégénérescences, expliquant le déficit de motricité des animaux. Afin de répondre à cette interrogation, nous avons voulu voir en microscopie, la morphologie des neurones moteurs pour les 3 souches transgéniques.
