In organismen die zich geslachtelijk voortplanten, is het correct totstandkomen van de geslachtelijke identiteit een essentieel proces. In insecten bestaat er een breed scala aan mechanismen die ten grondslag liggen aan deze geslachtsbepaling; er komen verschillende chromosomale systemen en verschillende geslachtsbepalende genen voor. Het geslacht wordt bepaald door een cascade van genen met een hiërarchische organisatie. Bovenaan (aan het begin van) deze cascade bevindt zich een primair geslachtsbepalend signaal, gevolgd door een “aan/uit” schakelaar die het primaire signaal interpreteert en verder leidt naar een globale effector onderaan (aan het einde van) de cascade. De geslachtsbepalende cascade wordt in het vroeg-embryonaal stadium geactiveerd, en loopt via geslachtsspecifieke splicing van het pre-mRNA van de “aan/uit” schakelaar transformer (tra) naar doublesex (dsx) aan het einde van deze cascade. Afhankelijk van het primaire signaalwordt de ontwikkeling van het embryo door dsx ofwel als mannetje ofwel als vrouwtje ingezet. De primaire genetische signalen in de cascade zijn zeer divers, terwijl de genen onderaan de cascade juist geconserveerd zijn (Gembe en Beye, 2011; Bopp et
al., 2014). Volgens de bottom-up hypothese, voorgesteld door Wilkins (1995), evolueren
deze cascades van onder naar boven, waarbij er achtereenvolgens steeds nieuwe genen bovenaan de cascade worden opgenomen.
De huisvlieg, Musca domestica, is een opmerkelijk voorbeeld van de grote diversiteit van geslachtsbepalende mechanismen en is daarom een ideaal modelorganisme om de evolutionaire diversificatie van geslachtsbepalingscascades te bestuderen (Dübendorfer et al., 2002). Het polymorfe geslachtsbepalingssysteem van huisvliegen is al meer dan vijftig jaar bekend, en is uniek in het feit dat er verschillende natuurlijke populaties bestaan waar een dominante genetische factor die de mannelijke ontwikkeling veroorzaakt (de M-factor) op verschillende chromosomen voor kan komen (op het Y-chromosoom, of op een van de vijf autosomen) (Hiroyoshi, 1964; Franco et al., 1982; Denholm et al., 1983). De vraag of deze M-factoren verschillende genen zijn of kopieën van hetzelfde gen dat een translocatie heeft ondergaan naar verschillende posities in het genoom, is tot nu toe nog niet beantwoord.
De M-factor is het primaire signaal in de geslachtsbepalingscascade en verhindert de maternale activatie van de transformer auto-regulatie (Inoue en Hiroyoshi, 1986; Hilfiker-Kleiner et al., 1993). De M-factor zorgt ervoor dat het pre-mRNA van Md-tra in een niet-functionele variant wordt gespliced, wat vervolgens leidt tot de splicing van het pre-mRNA van Md-dsx in de mannelijke variant (Hediger et al., 2010). Het doel van mijn onderzoek was om de M-factor(en) in de huisvlieg te identificeren en te karakteriseren. Daarnaast heb ik mij gericht op de belangrijke evolutionaire vraag hoe M-factoren kunnen evolueren op verschillende plaatsen in het genoom.
Dutch summary |
voor een overgang van zygotisch Md-tra naar de mannelijke isoformen (Hediger et
al., 2010). Op basis van deze aannames is een differentiële expressieanalyse uitgevoerd
tussen RNAseq-data van uitsluitend mannelijke of vrouwelijke embryo’s uit het syncytium stadium. Dit leidde tot de identificatie van een aantal mRNA’s die alleen in mannelijke embryo’s aanwezig waren. Deze zijn vervolgens vergeleken met vrouwelijke M. domestica- genoomsequenties (Scott et al., 2014), waarbij een aantal sequenties werd gevonden, die aanwezig zijn in mannetjes, maar niet in vrouwtjes. Tussen deze sequenties, hebben we vijf man-specifieke contigs gevonden waarvan de sequentie in grote mate bleek overeen te komen met die van het gen CWC22/nucampholin, dat codeert voor een pre-mRNA splicing factor. Vervolgens zijn met verschillende primerparen de overlappende delen van deze vijf man-specifieke contigs geamplificeerd en daarmee is bevestigd dat deze deel uitmaken van één transcriptionele eenheid. Dit betekent dat de vermoedelijke initiator van de mannelijke ontwikkeling in de huisvlieg is geïdentificeerd. Dit gen isMdmd genoemd (afkorting van Musca domestica male determiner) (hoofdstuk 2).
Op basis van een hoge mate van overeenkomst in de sequentie van de twee genen, is geconcludeerd dat Mdmd een paraloog is van CWC22 (Sharma et al., 2017). CWC22 heeft een algemene functie in het splicen van pre-mRNA, en is vereist voor de formatie van het exon junction complex (EJC) (Barbosa et al., 2012; Steckelberg et al., 2012; Alexandrov et al., 2012). Een BLASTN-zoekopdracht van Mdmd-sequenties in het vrouwelijke M. domestica-genoom leidde tot de identificatie van de paraloog Md-
ncm (afkorting van Musca domestica nucampholin), een ortholoog van ncm in Drosophila melanogaster. De hoge mate van overeenstemming tussen de sequenties van Mdmd en Md- ncm is een aanwijzing dat Mdmd is ontstaan door een genduplicatie. Het eiwit MDMD
bevat twee domeinen, MIF4G en MA3, die geconserveerd zijn binnen de Metazoa; en deze zijn in meerdere soorten betrokken bij het bewaken van de integriteit van het mRNA, translatie, en non-sense decay (NMD) (Alexandrov et al., 2012).
Mdmd is als eerste geïdentificeerd in de MIIII-stam van M. domestica, waar de M- factor op het derde chromosoom ligt. De eerste vraag die vervolgens werd gesteld was of Mdmd ook aanwezig is op het Y-chromosoom, en op een van de andere autosomen. De vondst van Mdmd in verschillende M-stammen (MII, MIIII, MV en MY), en de grote mate van overeenkomst in de sequentie van deze kopieën, suggereert dat Mdmd hetzelfde gen is in deze verschillende stammen. Naar verwachting bleek de spliceosoomfactor Md-ncm, in tegenstelling tot Mdmd, aanwezig te zijn in de genomen van zowel mannetjes als vrouwtjes van de verschillende M-stammen. In een fylogenetische analyse clusterden de Mdmd- versies van de verschillende M-stammen sterk samen, wat aangeeft dat de Y-gebonden en autosomale M-factoren een gemeenschappelijke oorsprong hebben, en door een translocatie op verschillende plekken in het M. domestica-genoom terecht zijn gekomen (hoofdstuk 3). Een fylogenetische analyse van de MDMD-, MD-NCM-, en NCM-eiwitsequenties in
verschillende metazoa fyla geven inzicht in hoe Mdmd van Md-ncm is gedivergeerd, terwijl ncm het patroon van de geaccepteerde verwantschappen binnen de Metazoa volgt. In nauw verwante vliegensoorten zijn er geen paralogenvan ncm gevonden, hetgeen suggereert dat de opname van Mdmd in de geslachtsbepalende cascade uniek is voor de huisvlieg (hoofdstuk 3). Een andere interessante vondst is dat Mdmd aanwezig is in meerdere kopieën waarvan een aantal functioneel en andere niet-functioneel lijken te zijnen dat dit verschilt voorM-loci van verschillende M. domestica-stammen (Sharma et al., 2017). Deze kopieën van Mdmd zijn wellicht ontstaan doordat ze voor of na translocatie lokaal meerdere malen zijn gedupliceerd op het Y-chromosoom of op de verschillende autosomen, om de functionaliteit van Mdmd te behouden (hoofdstuk 5).
Om de functie van Mdmd als bepalende factor voor mannelijke ontwikkeling te toetsen, werd embryonale RNAi (eRNAi) uitgevoerd op Mdmd in vroege embryo’s van verschillende M-stammen. Blokkade van Mdmd door middel van eRNAi resulteerde in een omkering van het geslacht: mannetjes vertoonden vrouwelijke ontwikkeling met volledig gedifferentieerde ovaria. Hiermee kon bevestigd worden dat Mdmd-activiteit in een vroeg embryonaal stadium noodzakelijk is voor de differentiatie van mannelijke gonaden in de MIII-, MIIII-, MV- en MY-stammen (hoofdstuk 4). In MI-mannetjes werd echter geen geslachtsomkering waargenomen, hetgeen suggereert dat deze stam een ander M-locus heeft. Daarnaast is getoetst of de suppressie van Mdmd door eRNAi invloed had op de vrouw-specifieke splicing van Md-tra. Na een knock-down van Mdmd bleken de Md-tra- transcripten in de ovaria van de mannetjes met omgekeerd geslacht, alleen in de vrouwspecifieke splicevariant (Md-traF) voor te komen, en deze verandering leek onomkeerbaar. Dit suggereert dat Mdmd de vrouw-specifieke splicing van Md-
tra onderdrukt. Op basis van deze resultaten konden worden geconcludeerd
dat Mdmd vereist is voor de differentiatie van mannelijke gonaden in het syncytiale embryonale stadium. Om in de toekomst de functie van Mdmd in alle stadia van de ontwikkeling te onderdrukken, zou CRISPR/Cas9 toegepast kunnen worden.
In hoofdstuk 5 worden twee modellen geopperd om te beschrijven hoe Mdmd een functie heeft gekregen in het bepalen van mannelijke ontwikkeling na duplicatie van Md-
ncm. De hypothese in model I is dat Mdmd een nieuwe functie heeft gekregen die geen
verband houdt met de functie van Md-ncm, waarbij Mdmd specifiek de auto-regulatie van zygotisch Md-tra inhibeert. De hypothese in model II is dat Mdmd een dominante negatieve regulator van Md-ncm is, en dat Mdmd interfereert met de functies van Md-ncm die noodzakelijk zijn voor de vrouw-specifieke splicing van Md-tra.
Dutch summary |
Krzywinska et al., 2016), en Mdmd (in M. domestica, Sharma et al., 2017). Deze drie genen vertonen onderling geen overeenkomst in sequentie, wat laat zien dat de diversiteit aan primaire geslachtsbepalende signalen mogelijk zeer groot is. Verdere identificatie van genen die leiden tot mannelijke en vrouwelijke ontwikkeling in andere insectensoorten, zou het inzicht in de regulatie en evolutie van geslachtsbepaling aanzienlijk kunnen verbreden.
Tot slot laatdit onderzoek zien hoe een gen dat door duplicatie ontstaat een geheel nieuwe functie kan krijgen in het bepalen van geslachtsspecifieke ontwikkeling. Daarnaast laat het zien hoe heterogeen geslachtsbepaling kan zijn binnen een insectensoort, en dat het genetische mechanisme dat leidt tot deze geslachtsbepaling snel kan evolueren. Deze opgedane kennis leidt niet alleen tot een breder begrip van de evolutie van geslachtsbepaling, maar kan ook bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe, duurzame bestrijdingssystemen tegen insecten die schadelijk zijn voor de landbouw, of die ziekten overdragen, zoals fruitvliegen en steekmuggen.
It’s time to bring to an end! Many people have contributed to this beautiful journey in one way or the other, and now I would like to take this moment to thank every one of them. First and foremost, I extend my warm gratitude to my promoter Prof. Leo W. Beukeboom, your support, motivation, guidance and encouragements were conducive towards the completion of this thesis. I admire your passion and interest in science and research. I respect your caring, friendly and easygoing attitude towards your students. Thank you very much for providing me with an opportunity to work as your student.
I am deeply grateful to my co-promotor Dr. Daniel Bopp for giving me the opportunity to carry out my PhD work in his lab at the University of Zurich. I have always appreciated your views towards the subjects. Indeed I learned a lot from you. I would like to thank my other co-promoter Dr. Louis van de Zande for all fruitful discussions that we made.
I would like to acknowledge Prof. Mark Robinson for his very enthusiastic efforts for
Musca project. Your support and prompt replies to my e-mails and queries were beneficial.
I feel honoured and fortunate to have had a chance to work with you. Prof. Ernst Wimmer, your suggestions during the project was always of great help and compelled me to think differently. I especially appreciate your arrangements for the half early Gottingen brain stormy meetings.
I would also like to thank the members of the assessment committee, Prof. L. Rabinow, Prof. L. Sánchez and Prof. I. R. Pen for taking the time to read my thesis.
My sincere thanks to Andreas to whom I lived in Bassersdorf, Zurich for a long time. You taught me a lot and cared like a guardian. The moments I spent with you will always be precious to me. Many times I revised those days so that I could restore those memories throughout my life. Thanks for teaching me the basics of many things (especially skiing and tracking). I will always remember the world that you showed to me. I consider myself very fortunate to have you as a part of my life. Thanks for everything!
Big thanks to my colleague and good friend Claudia. It was a great time with you in Zurich. I appreciate your help and support during work and providing an amicable working environment. I admire your super friendly nature and "always ready to help other's" attitude. I miss your company. Leonidas, it was a pleasant time with you in Zurich and thank you for managed a trip to India with my family.
Acknowledgements |
Linda and Sjors, Many thanks, for your lovely company on several occasions.
Thank you, Christine, to invite me twice to organise the Zumikerlauf and sharing some beautiful memories with your family.
Monika, thanks for your help and discussions on Musca project. It was an honour to meet a person like you.
Raquel, thank you very much for the delightful time. I learned a lot from you about the happiness of Life.
I would also like to thank number of students to whom I worked; Jan Otto, Christoph, Dominik, Nikola, Svenia, Nicolas, Tamara, Salome, Seraina, Tea, Michael, Arne, and Femke.
Thank you, Kirsten, for advising me to rent the place of your brother when I first arrived in Groningen. Roelof, Dirk Jan and Mark thank you for sharing the apartment. You guys helped me a lot during the first three months in Groningen before moving to Zurich. I can remember that with your help within one hour after reaching to the Groningen, I bought a bike from the shop and after that my Groningen life becomes more comfortable.
Ljubinka, thank you for being a paranymph. We spent around one year (6+6 months with coffee and laugh) in Groningen, and both time luckily we shared the same office (since you left Groningen I missed those moments sometimes). It was a great time to work with you (without any expectations to each other). I hope that in the near future we will do more collaborative research!
Thank you, Raj for preparing Indian food (when I have no place to cook in Groningen) and helping to find an apartment in Groningen during the wandering time of my PhD. Also thanks to Shubham, Siddhartha, Ketan, Dhwani and Hemant for having a friendly company. Thanks for all cooking, fun, travels and discussions over the years. Outside the lab, it was a memorable time for festival celebrations and dinners. I truly appreciate your time and efforts to my parents when they visited me in Groningen.
Big thanks to my Zurich company (Sunil, Vibhu, Jimit, Preetam, Kapil, and Arnamoy). It was a fabulous time with all of you, especially weekend party and many road trips to different places in Europe.
Thank you, Remo, Daniela, Anna, Daniel (junior) and Hanna for a delightful time and chat at IMLS, Zurich. Jacqueline, thanks for taking care of my questions regarding visa and residence permit in Switzerland.
Thank you WIRE for organising many international student trips in Netherlands. It was a fantastic time.
Rogier and Peter, I appreciate your help for the housefly culture in Groningen.
Anna, Many thanks for suggesting several group activities and taking care of the promotion arrangements. Elzemiek, Thank you, for organising many kinds of scientific activities (especially writing camp at Schiermonnikoog).
I would like to pass my sincere thanks to Peter for translating the thesis summary in Dutch. Thanks, Xuan, Yuan and Fangying for all the (naive) jokes and versatile discussions that we had together during my last year in Groningen. Fangying, thanks for being my paranymph.
There are also so many people whose names are not mentioned. Big thanks for your help in many ways during the past years like finding and sharing an apartment, visa stuffs, short out the local things etc.
I would like to extend my gratitude to all of the Alumni and lab mates for scientific discussions, fun and parties (Borrels) over the years in Groningen and Zurich. I am glad to have a company like you. I am thankful to all to make my time memorable. As an Alumnus, I would like to connect with all of you shortly.
I would like to express my most profound gratitude to my family. I would not have reached this far without your constant support, love, trust, affection and motivation. Whatever I am today is because of you and for you. At last, I would like to dedicate my thesis to the thousands of houseflies that sacrificed for Science.