iliU, XXIII
GENERAL DISCUSSION AND CONCLUSIONS
10.4 CONCLUDING REMARKS
Thymus-dependent immune functions in ageing and tumour-bearing animals were found to be depressed. The causes of this dysfunction, however, were completely different in the two models. In aged animals, a decline in the number of T cells capable of eliciting a response was found, whereas in ttmour-bearing ani-mals increased numbers of macrophages caused suppression of T cell prolitera-tive responses. Thus, studies using different approaches aimed eventually at manipulation of these defects should be sought.
Both our data and those from the literature, reviewed in Chipter 1.1, seem to support the notion that in aged animals the thymus no longer provides the proper environment for T cell differentiation. Moreover, a defect in bone marrow derived prethymic precursor T cells has been found. Therefore, future research should be directed at unravelling the process(es) causing these changes in aged animals.
Increased numbers of macrophages in spleen and blood from tumour-bearing animals not only interfere jm vitro with T cell functions, but also seem to compromise T cell functions jn vivo (reviewed in Chapter 1.2). Hence, in attempts aimed at reversal of this immunosuppression, protocols that lead to jn_
vivo macrophage depletion may merit consideration in the future. In addition, it is necessary to evaluate in such experiments not only nonspecific T cell functions, but also specific anti-tumour responses and tumour growth, in order to Investigate whether tumour-induced immunosuppression influences tumour growth. The latter matter has not been dealt with so far in this type of study.
Possible application of thymic factors in restoration of thymus-dependent immune dysfunctions requires much more basic information concerning the site of action and nature of thymic factors before a rational approach can be started.
Awaiting this Information, it seems that in vitro studies with thymic factors will help to unravel the problems in the field of thymic factors and T cell differentiation.
156
SUMMARY
Studies described in this thesis *r* concerned with changes in cellular immunocompetence in ageing and tumour-bearing animals. The possible therapeu-t i c a l applicatherapeu-tion of therapeu-thynic humoral factherapeu-tors in restherapeu-toratherapeu-tion of diminished T c e l l functions i n i t i a t e d the more fundamental studies on the humoral function of the thymus also described here.
In Chapter 1 , these three different subjects are introduced. First of a l l , techniques used to evaluate several aspects of T c e l l immunocompetence are re-viewed. In addition, the effects of ageing on thymus-dependent immune para-meters »rt described. The possible causes of diminished T cell functions in old age remain unclear. Both a decrease in the number of precursor T cells in the bone marrow and intrinsic defects in the control of T c e l l differentiation by the thymus might be responsible for the observed defects.
The phenomenon of diminished T cell functions in tumour bearing animals is discussed in the second part of Chapter I . Evidence from the literature is pre-sented which suggests that this dysfunction, as observed with _in vitro tech-niques, is probably due to suppressive effects of mecrophages rather than to defects in the T c e l l s . In addition, i t appears that suppressive effects of macrophages in vitro are correlated with immunosuppression in vivo.
Finally, the last part of the introduction is devoted to the information available on the possible role of thymic factors in T c e l l differentiation. No conclusions can be reached as to the target cells for the action of thymic fac-t o r s , alfac-though fac-the posfac-tfac-thymic precursor cells seem fac-to be l i k e l y candidafac-tes. I fac-t is also clear that the relationship between the different factors is s t i l l un-known. Comparison of their biological effects reveals both similarities and differences and comparison of their chemical nature only yields support for the notion that t o t a l l y different principles have been isolated so f a r .
Experiments designed to define more precisely the depressed T lymphocyte proliferative capacity in old age are described in Chapter I I . The conclusion is reached that fewer T cells are capable of responding to T cell mitogens.
In Chapter I I I some investigations regarding the role of the thymus in age-related defects in T cell proliferative capacity *rt described. After i t is shown that the diminished T c e l l responses of peripheral lymphocytes are re-lated to the extent of thymus atrophy, data are presented which suggest that thymocytes from old rats ar* no longer sensitive to the action of a certain source of thymic factors, i . e . , supernatant! from thymic epithelial cultures.
! • > ;
157
i
F t
;
:
The effects of tumour bearing on T cell proliferative capacity of spleen cells are presented in Chapter IV. A correlation was found between depressed responsiveness to T c e l l Mitogens and an increased number of macrophages. The depressed responsiveness could be f u l l y restored by depleting the spleen cells froa Macrophages. The data reported in Chapter V extend the previous findings to other tuaour Models and other lymphoid organs. In addition, the concept that enhanced numbers of Mcrophages were responsible for the observed suppression is supported by data showing that the restorative effect of macrophage de-pletion can be abolished by adding «acrophages from normal individuals.
In Chapter V I , the effects of macrophage depletion and addition on T c e l l proliferative responses of spleen, thymus and blood lymphocytes from normal rats are reported. A Model for the relationship between T lymphocyte respon-siveness and Macrophage to lymphocyte ratio in the culture is presented. This Model explains why some authors report helper and others Mainly inhibitory
ef-fects of macrophages on lymphocyte proliferation.
From Chapter V I I on, the rest of this thesis is devoted to studies on the effects of thyMic factors. As a source of thymic factors, supernatants from thymic epithelial cultures (TES) are employed. A detailed description of the preparation of TES 1s given in Chapter V I I . In addition, i t is shown that TES enhances 1*C-Tdft incorporation into aitogen-stimulated thymocytes, at least p a r t i a l l y by increasing the number of responsive c e l l s .
In Chapter V I I I i t is shown that TES also enhances uC-TdR incorporation into Mixed lymphocyte cultures of thymoeytti. Furthermore, TES seems to induce In thymocyte* T helper c e l l function for j n vitro production of antiSRflC a n t i -bodies by B c e l l s , as well as an increase in intracellular cyclic AMP levels.
In Chapter I X , evidence is presented that TES also enhances a specific effector T c e l l function in thymocytes, i . e . , T k i l l e r cell function. No con-clusion can be reached as yet as to whether this enhancement is due to a direct effect of TES on precursor k i l l e r T cells or on helper T c e l l s . In addition, i t is shown that TES reduces the number of thymocytes with a high Thy 1 density and with high sensitivity to cortisone. Arguments are presented which suggest that these findings reflect a T c e l l differentiation process, but the possibi-l i t y that other T c e possibi-l possibi-l differentiation pathways exist remains s t i possibi-l possibi-l open.
In Chapter X the results art discussed in relation to recent findings re-ported in the l i t e r a t u r e .
/]
Jt
158
2
SAMENVATTING
ft
I
Het in dit proefschrift beschreven onderzoek is gewijd aan de effecten van veroudering en tuaoren op verschitlende aspecten van de cellulaire iaauniteit b i j proefdieren. Net het oog op aogelijke toepassing van humor*le thy*us fac-toren b i j pogingen tot heriteI van afgenoaen T eel functies z i j n tevens meet fundMentele experiaenten oatrent de huaorale functie van de thynus uitgevoerd.
In Hoofdstuk I worden bovengenoeade drie onderuerpen geintroduceerd. In de eerste plaats uordt een overzicht gegeven van technieken die gebruikt kunnen worden on het T cel-afhankelijke iaaunologisch reactieveraogen te bepalen.
Oaarnaast uordt het effect van veroudering op de hiertoe gebruikte parameters beschreven. Uit de literatuurgegevens kan gecn eensluidende coneIusie over de oorzaken van de leeftijdsgebonden afn«ae in T eel functies getrokken uorden.
ZoneI een afnaae in het aantal voorloper T cellen in het beenaerg alsaede intrinsieke defecten in de regulerende functie van de thyaus op het T eel d i f -ferentiatie proces lijken aede verantwoordelijk te z i j n voor de uaargenomen defecten.
Bij tunordragende dieren wordt een sterke daling in verschiIlende T eel functies uaargenomen, zoals uiteengezet in het tueede deel van Hoofdstuk I . Deze vora van iamuundeficientie i t , althans op grond van resultaten verkregen aet in vitro technieken, waarschijnlijk te uijten tan suppressieve effecten van aacrophagen en niet aan een afnaae in reactiviteit van de T cellen z e l f . Er z i j n aanwijzingen dat suppressieve effecten van aacrophagen in vitro gecorre-leerd z i j n aet iamunosuppressie jm vivo.
Het laatste deel van de introductie is gewijd aan de aogelijke rol van thyaus factoren in het T eel differentiatie proces. Hoeuel er geen eensluidende conclusie oatrent het eeltype waarcp thymus factoren hun invloed uitoefenen bereikt kan worden, lijken de z . g . "postthyaic precursor cells" (geintroduceerd in Figuur 1.1) de aeest waarschijnlijke kandidaten. De relatie tussen de op dit aoaent bekende thyaus factoren is nog niet bekend. Er bestaan zowel overeen-konsten als verschillen tussen hun respectievelijke biologische effecten, ter-w i j l uit vergelijking van de chemisehe eigenschappen b l i j k t dat tot dusverre totaal verschiIlende producten z i j n geisoleerd.
Net het doel oa de b i j veroudcring optredende afnaae in T eel p r o l i f e r a t e capaciteit beter te definieren werden de experiaenten beschreven in Hoofdstuk I I uitgevoerd. Uit de resultaten b l i j k t dat er een afnaae is in het aantal T cellen dat in staat is tot proliferatie te worden aangezet door aiddel van s t i a u l a t i * act aitogetvn.
IS
/5£
• v;
• I,
In Hoofdstuk I I I worden cnkele aspecten van de mogelijke rol van de thymus in de leeftijdsgebonden afname in T eel proliferatie capaciteit behandeld. De
•fname in T eel reactiviteit in milt en bloed Lijkt gerelateerd te zijn aan de mate uaarin de thymus geatrophieerd i s , althans bij een bepaalde rattestam.
Verder wordt aangetoond dat de T eel proliferatie capaciteit van thymocyten van oude dieren niet neer verhoogd kan worden net factoren uit supernatanten van gekueekt thymus epitheel. Bij jonge dieren kunnen zulke supernatanten meerdere T ceL functies in thymocyten verhogen of induceren.
Bij tumor-dragende dieren wordt een sterke daling van de in vitro respons tegen T eel mitogenen van milt en bloed lynphocyten waargenomen (Hoofdstuk IV en V ) . Oit b l i j k t gepaard tc gaan met een stijging in het relatieve aantal macrophagen. Door milt en bloed lymphocyten suspensies te behandelen met tech-nieken die leiden tot macrophagen-depletie kan de verlaagde respons volledig hersteld worden. Dit suggereert dat de verlaagde respons het gevolg is van het toegenomen aantal macrophagen en niet van afwijkingen in de T eellen zelf. Het f e i t dat het suppressieve effect van toevoeging van macrophagen van normale dieren het effect van tumoren kan nabootsen (Hoofdstuk V) ondersteunt dit con-cept.
De experimenter! die in Hoofdstuk VI behandeld worden hadden tot doel het effect van mac rophagen-depleti e en -toevoeging op de _in vitro T eel prolifera-tieve respons van m i l t , thymus en bloed lymphocyten van normale dieren te onderzoeken, mede omdat over d i t onderwerp in de literatuur nogal wat contro-verses bestaan. De resultaten hebben geleid tot de constructie van een model omtrent de relatie tussen de proliferatieve respons van T cellen en de ver-houding tussen macrophagen en lymphocyten in de kweek. Dit model verklaart waarom sommige onderzoekers vinden dat macrophagen een helper eel functie u i t -oefenen b i j lymphocyten proliferatie en anderen voornamelijk suppressieve effecten van macrophagen waarnemen.
Vanaf Hoofdstuk V I I is de rest van dit proefschrift gewijd aan in vitro ex-perimenten met thymus factoren, en wel die welke aanwezig zijn in supernatanten van gekweekte thymus epitheel cellen CTES). De bereidingswijze van TES wordt behandeld in Hoofdstuk V I I . TES b l i j k t in staat te z i j n de uC-TdR incorporate in thymocyten die met T eel mitogenen worden gestimuleerd sterk te verhogen.
In Hoofdstuk V I I I wordt aangetoond dat ook de door allogene stimulatie ge-induceerde proliferatie van thymocyten door TES verhoogd kan worden. Tevens l i j k t TES in een deel van de thymocyten T helper eel functie te induceren, als-mede een toename in het intracellulaire cyclisch AMP niveau. Ook een specifieke
"effector" T eel functie, n . l . T " k i l l e r " eel functie, kan door TES in thymo-cyten sterk verhoogd worden (Hoofdstuk I X ) . Bovendien reduceert TES het aantal thymocyten met een hoge dichtheid van Thy 1 antigeen en een hoge gevoeligheid 160
0
r'A
r.
voor corticosteroiden. Er z i j n een aantaL aanwijzingen die suggereren dat deze resultaten een T eel d i f f e r e n t i a t e proces vertegenwoordigen, naar het b l i j f t nogelijk dat er nog alternate even bestaan.
In Hoofdstuk X tenslotte worden de resultaten net elkaar in verband ge-bracht en tevens vergeleken net recente ontwikkelingen in de respectieveLijke vakgebieden.
161
REFERENCES
1 . Abraham, C , Tal, Y. and Gershon, H. (1977} Reduced in vitro response to concanavalin A and lipopolysaccharide in senescent nice: a function of re-duced number of responding cells. Eur. J . Immunol 7, 301.
2. Adler, W.H., Takiguchi, T. and Smith, R.T. (1971) Phytohemagglutinin un-responsiveness in mouse spleen cells induced by methyl-cholanthrene sarco-mas. Cancer Res. 31_, 864.
3. Adler, U.H., Tikiguchi, T. and Smith, R.T. (1971) Effect of age upon p r i -mary alloantigen recognition by mouse spleen cells. J. Immunol. 107, 1357.
4. Andersson, B. and Blomgren, H. (1970) Evidence for a small pool of immuno-competent cells in the mouse thymus. Its role in the humoral antibody re-sponse against sheep erythrocytes, bovine serum albumin, ovalbumin and the N.I.P. determinant. Cell. Immunol. \, 362.
5. Andersson, j . , WBller, G. and SjOberg, 0. (1972) Selective induction of DNA synthesis in T and B lymphocytes. Cell. Immunol. 4 , 381
6. Armerding, D. and Katz, O.H. (1975) Activation pf T and B lymphocytes j n vitro. IV. Regulatory influence on specific T cell functions by a thymus extract factor. J. Immunol. 114, 1248.
7. Astaldi, A., Astaldi, G.C.B., Schellekens, P.Th.A. and Eijsvoogel, V.P.
(1976) A thymic factor in human sera demonstrated by a cAMP assay. Nature 260, 713.
8 . Astaldi, A., Astaldi, 6.C.B., Wijermans, P., Groenewoud, H., Schellekens, P.Th.A. and Eijsvoogel, V.P. (1977) Thymosin-induced human serum factor increasing cyclic AMP. J. Immunol. 119, 1106.
9. Astaldi, A., Astaldi, 6.C.B., Wijermans, P., Groenewoud, H., Schellekens, P.Th.A. and Eijsvoogel, V.P. (1977) Thymus dependent factor in human serum. J . reticuloendoth. Soc. _22, 84 (abstract).
10. Astaldi, G.C.B., Astaldi, A., Groenewoud, M., Wijermans, P., Schellekens, P.Th.A. and Eijsvoogel, V.P. (1977) Effect of a human serum thymic factor on hydrocortisone-treated thymocytes. Eur. J. Immunol. 7_, 836.
1 1 . Bach, F.H., Bach, M.L. and Sondel, P.M. (1976) Differential function of major histocompatibility complex antigens in T lymphocyte activation. . Nature 259, 273.
12. Bach, J.F. (1975) The mode of action of immunosuppressive agents. (Eds. . A. Neuberger and F.L. Tatum), North-Holland Research Monographs, Frontiers of Biology, Amsterdam, 41y
21-13. Bach, J.F. and Carnaud, C. (1976). Thymic factors. Prog. Allergy 2 1 , 342.
163
14. Bach, J.F. Cantor, H., Roelants, G. and StutMan, 0. (1975) T c e l l subsets:
terminology problems. I n : Biological activity of thymic hormones. (Ed.
D.W. van Bekkum), p. 159, Kooyker Scientific, Rotterdam, The Netherlands.
15. Bach, J.F. and Dardenne, M. (1972) Thymus dependency of rosette forming c e l l s , evidence for a circulating thymic hormone. Transplant. Proc. 4, 345.
16. Bach, J.F. and Dardenne, M. (1973) Studies on thymus products. I I . Demon-stration and characterization of a circulating thymic hormone. Immunology 25, 353.
17. Bach, J . F . , Dardenne, M. and Bach, M.A. (1973) Demonstration of a circu-lating thymic hormone in mouse and man. Transplant. Proc. 5, 523.
18. Bach, J . F . , Dardenne, H., Salomon, J.C. (1973) Studies on thymus products.