beschrijft studies die gericht waren op de opheldering van de interactie

van ORA59 en de gerelateerde transcriptiefactor ERF1 met de PDF1.2 promoter. Twee GCC boxen in de PDF1.2 promoter bleken belangrijk te zijn voor zowel de trans-activering door ORA59 of ERF1 in kortstondige expressietesten in Arabidopsis protoplasten als voor binding met deze eiwitten in vitro. Er kon geen samenwerking vastgesteld worden tussen ORA59 en ERF1, wat aangeeft dat deze transcriptiefactoren onafhankelijk van elkaar hun invloed

uitoefenen op de PDF1.2 promoter. Toepassing van de chromatine

immunoprecipitatietechniek (ChIP) toonde aan dat ORA59 ook in vivo bindt aan de PDF1.2 promoter. Gezien de gelijkwaardigheid van de twee GCC boxen in de hiervoor genoemde experimenten kwam de constatering dat mutatie van één enkele GCC box gelegen tussen posities -256 en -261 de respons van de PDF1.2 promoter op JA alleen of in combinatie met ethyleen volledig plat legde als een verrassing. Deze bevinding is wel in overeenstemming met data beschreven in het artikel van Brown et al. (2003). Een verklaring zou kunnen zijn dat in vivo twee functionele GCC boxen nodig zijn voor een alles-of-niets respons van het

PDF1.2 gen op deze hormoonsignalen.

Het doel van de studies beschreven in Hoofdstuk 3 was om vast te stellen of JA een activerend effect heeft op ORA59 op eiwitniveau. De resultaten toonden aan dat JA zowel stabilisatie als nucleaire lokalisatie van ORA59 teweegbracht. Bij het in kaart brengen van functionele domeinen in ORA59 bleek dat voor stabilisatie en nucleaire lokalisatie meerdere niet overlappende delen van het eiwit nodig waren Een interessante waarneming

Samenvatting

135

was het feit dat nucleaire lokalisatie van ORA59 niet afhankelijk was van COI1. Gebaseerd op deze resultaten is in Hoofdstuk 3 gepostuleerd dat er nog een andere jasmonaatreceptor is naast COI1, dat er een F-box eiwit is dat ORA59 herkent ter markering voor afbraak, en dat er een repressoreiwit is dat ORA59 in het cytoplasma vast houdt in afwezigheid van JA.

ORA47 reguleert een heel andere subset van JA-responsieve genen dan ORA59. Induceerbare overexpressie van ORA47 leidt tot verhoogde expressieniveaus van genen die coderen voor enzymen betrokken bij jasmonaatbiosynthese, zoals AOC2, AOS, en LOX2 (Pré, 2006). Oxylipine metingen in planten die ORA47 tot overexpressie brengen onthulden sterke veranderingen in het oxylipine profiel. Deze resultaten geven aan dat ORA47 verantwoordelijk is voor de zelfstimulerende lus in JA biosynthese.

De specifieke doelstellingen van het onderzoek beschreven in Hoofdstuk 4 waren om vast te stellen of ORA47 de expressie van alle vier leden van de AOC genfamilie controleert, en of de AOC genen directe doelwitten zijn van ORA47. De resultaten toonden aan dat de expressie van alle vier AOC genen werd aangeschakeld door overexpressie van ORA47. Een GCC-achtige box in de AOC2 promoter vertoonde specifieke interactie met ORA47 in vitro en in vivo, en deze GCC-achtige box was belangrijk voor ORA47-afhankelijke activiteit van de AOC2 promoter. Daarnaast werd aangetoond dat ORA47 bond aan de

AOC1 promoter in vivo, en dat ORA47 de AOC1 promoter kan trans-activeren in een

kortstondige expressietest in protoplasten. Mutatie van de GCC-achtige box in de context van een AOC2 promoterafgeleide van 600 bp lang resulteerde in een 2.5-voudige verlaging van de inductie door JA, maar niet in volledige inactivering. Dit geeft aan dat de GCC-achtige box belangrijk is voor de JA-responsieve activiteit van de AOC2 promoter, maar dat de 600 bp lange promoter ook nog additionele JA-responsieve sequenties bevat.

In de roze maagdenpalm (Catharanthus roseus) controleert de AP2/ERF-domein transcriptiefactor ORCA3 de MeJA-responsieve expressie van een aantal genen betrokken bij de biosynthese van terpenoïde indoolalkaloïden (Memelink et al., 2001). De expressie van het ORCA3 gen zelf wordt ook aangeschakeld door JA. Het zogeheten D fragment van 74 bp lang afkomstig uit de ORCA3 promoter functioneert als een autonoom (Me)JA-responsief element (JRE; Vom Endt et al., 2007). Deze JRE bevat twee belangrijke sequenties, namelijk een kwantitatieve sequentie die noodzakelijk is voor een hoog niveau van expressie, en een kwalitatieve sequentie die werkt als een MeJA-responsieve aan/uit schakelaar. De kwalitatieve sequentie is een zogenaamde G-box met één afwijking (AACGTG). Gebaseerd op het feit dat sommige leden van de basische helix-lus-helix (bHLH) familie van transcriptiefactoren van tomaat aan een G-box-achtige sequentie van een JA-responsieve promoter kunnen binden (Boter et al., 2004) is voorspeld dat de kwalitatieve sequentie van de ORCA3 JRE interactie vertoont met een bHLH eiwit van Catharanthus.

Samenvatting

136

Het doel van de studies beschreven in Hoofdstuk 5 was om te bepalen of de JRE actief is in Arabidopsis, en zo ja, of deze activiteit afhankelijk is van de bHLH transcriptiefactor AtMYC2. De JRE bleek inderdaad functioneel te zijn in Arabidopsis. Tevens werd vastgesteld dat de JRE in vitro en in vivo specifieke interactie vertoonde met AtMYC2. Meting van de activiteit van een reportergen onder controle van de JRE in een atmyc2-1 mutant toonde aan dat de activiteit volledig afhankelijk was van AtMYC2. Net als in Catharanthuscellen (Vom Endt et al., 2007) was de JA-responsieve activiteit van de JRE niet afhankelijk van de novo eiwitsynthese. Dit is consistent met de waarneming dat de JRE directe interactie vertoont met AtMYC2. Het toont tevens aan dat reeds aanwezig AtMYC2 wordt geactiveerd door JA signalering zonder dat nieuw aangemaakte eiwitten nodig zijn, wat klopt met de recente ontdekking dat AtMYC2 wordt geactiveerd door JA-, COI1-en proteasoom-afhankelijke afbraak van leden van de JAZ repressorfamilie (Chini et al., 2007; Thines et al., 2007).

Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was de functionele analyse van JA-responsieve transcriptiefactoren in Arabidopsis met nadruk op hun interactie met de promoters van hun doelwitgenen.

In het kort zijn de volgende nieuwe inzichten verkregen. De promoter van het

PDF1.2 gen bevat minstens twee functioneel gelijkwaardige GCC boxen in plaats van één

zoals eerder gerapporteerd (Brown et al., 2003). De JA biosynthesegenen AOC1 en AOC2 zijn directe doelwitgenen van ORA47, hetgeen een verdere ondersteuning vormt voor de gedachte dat ORA47 de biosynthese van JA bevordert door directe regulatie van de biosynthesegenen (Pré, 2006). JA beïnvloedt de activiteit van ORA59 door stabilisatie en nucleaire lokalisatie van dit eiwit. JA-responsieve lokalisatie in de kern is niet afhankelijk van de jasmonaatreceptor COI1, wat aangeeft dat er nog een andere jasmonaatreceptor bestaat. Het jasmonaat-responsieve element van de ORCA3 promoter is actief in Arabidopsis, en deze activiteit wordt gecontroleerd door de bHLH transcriptiefactor AtMYC2, wat suggereert dat een verwant bHLH eiwit de expressie van het ORCA3 gen in Catharanthus reguleert.

Interessante vragen voor volgend onderzoek betreffen de mechanismen van stabilisatie en nucleaire lokalisatie van ORA59 en de identiteit van de alternatieve jasmonaatreceptor. Ook zou het interessant zijn om (het) bHLH eiwit(ten) in Catharanthus te identificeren verantwoordelijk voor JA-responsieve ORCA3 expressie, en om de regulatie en de impact van dit/deze eiwit(ten) op terpenoïde indoolalkaloïdbiosynthese te bestuderen.

137 Curriculum Vitae

Adel Zarei was born on the 23^rd of July, 1966 in Babol, Iran. He attended high school at “Dabirestan Taleghani” in Babol. In 1986, he entered the Faculty of Agricultural Sciences, and in 1990 he finished his bachelor studies in Horticultural Sciences at the Chamran University. From September 1991 until 1993 he stayed at Tarbiat-Modaress University and received his master degree from the department of Horticultural Sciences. In 1994 he was appointed as a member of college of Agriculture, University of Mazandaran as instructor and co-researcher active in the department of Plant Pathology for 8 years. In 2003 he received an award from the ministry of Science, Research and Technology of Iran to start his PhD research under supervision of Prof. dr. Johan Memelink at the Institute of Biology, Leiden University, The Netherlands.