beschrijft de kwaliteitscontrole van de PMP Pxa1p in S cerevisiae Pxa1p

is een gisthomoloog van humaan adrenoleukodystrofie-eiwit (ALDP) en mutaties in ALDP, die vaak tot eiwitinstabiliteit leiden, kunnen leiden tot de ernstige genetische aandoening adrenoleukodystrofie (ALD). We selecteerden twee ALD-veroorzakende mutaties en genereerden de overeenkomstige mutaties in gist Pxa1p (Pxa1MUT_{), getagd aan mGFP. We} hebben waargenomen dat Pxa1MUT_{-mGFP snel wordt afgebroken, terwijl Pxa1-mGFP stabiel} blijft, wat aangeeft dat kwaliteitscontrole een rol speelt in het Pxa1MUT_{-mGFP -verloop. De} afbraak van Pxa1MUT_{-mGFP werd significant verminderd na behandeling met} proteasoomremmers, wat aantoont dat het proteasoom hierbij betrokken is en verder een rol suggereert voor ubiquitinatie in het Pxa1MUT_{-mGFP -verloop. Onze pogingen om} ubiquitinevormen van Pxa1MUT_{-mGFP te detecteren, waren niet succesvol, mogelijk omdat} geubiquitineerde Pxa1MUT_{-mGFP weinig aanwezig is of omdat ubiquitinering van een ander} eiwit en niet Pxa1MUT_{-mGFP nodig is voor Pxa1}MUT_{-mGFP -afbraak. Met behulp van de tFT-} benadering hebben we waargenomen dat het cytosolische E3-ligase Ufd4p een belangrijke rol speelt bij de afbraak van Pxa1MUT_{-mGFP. De waarneming dat Pxa1}MUT_{-mGFP is gestabiliseerd} op peroxisomen in ufd4-cellen suggereert dat Ufd4p-afhankelijke kwaliteitscontrole van Pxa1MUT_{-mGFP plaatsvindt bij peroxisomen. Net als Ufd4p remt het verlies van de} peroxisomale E3-ligase Pex2p ook de afbraak van Pxa1MUT_{-mGFP. Er kunnen twee redenen} zijn om uit te leggen waarom meerdere E3's betrokken zijn bij Pxa1MUT_{-mGFP -afbraak; 1)} twee parallelle routes richten zich op Pxa1MUT_{-mGFP voor afbraak, één vereist Ufd4p waarbij}

de andere Pex2p betrokken is, of alternatief 2) het verlies van factoren van het peroxisomale ubiquitineringsysteem beïnvloedt de peroxisoomfunctie, wat op zijn beurt de afbraak van Pxa1MUT_{-mGFP remt. De afwezigheid van het cyclische receptoreiwit Pex5p kan ook het} Pxa1MUT_{-mGFP -verloop remmen. Dit wijst erop dat het verlies van Pex2p of Pex4p indirect} de afbraak van Pxa1MUT_{-mGFP kan remmen. Ten slotte laten we zien dat Pxa1}MUT_{-mGFP een} bepaalde mate van activiteit behoud en dat dit wordt verhoogd door Pxa1MUT_{-mGFP -afbraak} te remmen door de verwijdering van UFD4. Details over de mechanismen van hoe Ufd4p het Pxa1MUT_{-mGFP -verloop reguleert, zullen ons in staat stellen om beter te begrijpen hoe} cytosolische UPS-factoren het verloopvan PMP's kunnen reguleren en dus van invloed kunnen zijn op de peroxisoomfunctie. Bovendien toont het feit dat het remmen van de afbraak van Pxa1MUT_{-mGFP de cellulaire activiteit van Pxa1p kan versterken aan dat het blokkeren van} ALDP-mutantafbraak een effectieve manier kan zijn om ALD te behandelen.

In hoofdstuk 4 presenteren we ons onderzoek naar S. cerevisiae Pex13p. Net als bij H.

polymorpha, hebben we waargenomen dat Pex13p gefuseerd met mGFP (Pex13-mGFP) in S.

cerevisiae een snelle afbraak ondergaat in cellen die zijn gegroeid onder peroxisoom-

inducerende omstandigheden, wat aantoont dat het Pex13p-verloop een geconserveerde gebeurtenis is. Door de tFT-benadering toe te passen, laten we zien dat de peroxisomale ubiquitinatiemachines een belangrijke rol spelen bij de afbraak van Pex13-mGFP, terwijl de aanvullende cytosolische UPS-factoren Ufd4p, Ubc4p en Ubr2p een ondergeschikte rol spelen, mogelijk door de vorming van poly-Ub-ketens op Pex13- mGFP. Het feit dat meerdere E2's en E3's betrokken lijken te zijn bij het Pex13-mGFP-verloop, suggereert dat verschillende routes parallel werken om de afbraak van Pex13-mGFP te faciliteren of dat al deze factoren samenwerken bij het ubiquitineren van Pex13-mGFP, om het eiwit te targeten voor proteasomale afbraak. Onze resultaten tonen ook aan dat de functie van Cdc48p niet vereist is voor Pex13-mGFP-afbraak. Aangezien Cdc48p betrokken is bij de afbraak van ER- en mitochondriale membraaneiwitten, onderscheidt deze waarneming de afbraak van PMP's van die van andere organellaire membraaneiwitten en bewijst dat er verschillende mechanismen bestaan om deze afbraakprocessen te faciliteren. Eén mogelijkheid is dat het AAA-ATPase Msp1p, waarvan werd gerapporteerd dat het staartverankerde eiwitten zoals Pex15p uit het peroxisomale membraan haalt voor afbraak, Pex13p zou kunnen targeten om naar het proteasoom getransporteerd te worden. Als alternatief zouden de AAA-ATPases Pex1p en Pex6p, die betrokken zijn bij het extraheren van geubiquitineerd Pex5p uit het peroxisomale membraan, ook kunnen worden beschouwd als een interessante kandidaat voor verder onderzoek. Recente rapporten geven echter aan dat proteasomen rechtstreeks op membranen kunnen worden gerekruteerd om de afbraak van membraaneiwitten te faciliteren. Misschien zou een dergelijk mechanisme ook de afbraak van Pex13p kunnen reguleren. Er is nog meer onderzoek nodig om duidelijk te krijgen hoe geubiquitineerd Pex13p wordt geëxtraheerd uit het peroxisomale membraan en waarom Pex13p het doelwit is voor afbraak.

PMP's spelen een cruciale rol bij het reguleren van veel peroxisomale functies en zijn daarom belangrijk voor de peroxisoomhomeostase en het celmetabolisme. Onderzoek naar de afbraak van PMP's zou ons helpen te begrijpen hoe PMP-homeostase wordt gereguleerd, in welke mate PMP-afbraak betrokken is bij het reguleren van peroxisomale functies en hoe PMP- afbraak zich verhoudt tot andere eiwitafbraaksystemen in de cel. In dit proefschrift is de afbraak van PMP's in S. cerevisiae onderzocht. De resultaten laten duidelijk zien dat Pxa1-tFT en Pxa1MUT_{-mGFP, welke beide minder goed functioneren, snel worden afgebroken. Het feit dat} alleen defecte versies van Pxa1p, maar niet de wildtype-versie, degradatie ondergaan, toont het bestaan aan van een kwaliteitscontroleroute op het peroxisomale membraan dat gericht is op defecte PMP's voor degradatie. De sterke link tussen ER en mitochondriale membraaneiwitkwaliteitscontrole en ziekte geeft aan dat toekomstige studies gericht moeten zijn op het onderzoeken van deze PMP-kwaliteitscontroleroute. Bovendien geeft de betrokkenheid van Ufd4p bij de afbraak van Pxa1MUT_{-mGFP, Pxa1-tFT en (mogelijk) Pex13-} mGFP aan dat er gemeenschappelijke mechanismen kunnen bestaan die PMP's voor afbraak targeten, en dat cytosolische eiwitten de PMP-afbraak en daarmee de peroxisoomfunctie kunnen reguleren. Toekomstige studies die gericht zijn op het identificeren en karakteriseren van aanvullende cytosolische UPS-factoren die betrokken zijn bij PMP-afbraak, zullen waardevolle inzichten verschaffen in de rol van PMP-verloop bij gezondheid en ziekte.