A novel screening method for isolation of mutants involved in inulin signalling
Hoofdstuk 3 is beschreven, kan zetmeel worden afgebroken door verschillende enzymen,
α‐amylase, glucoamylase en α‐glucosidase leden van de glycoside hydrolase (GH) families 13, 15 en 31. Deze eiwitfamilies worden gekarakteriseerd door de aanwezigheid van gebieden met sterk geconserveerde aminozuren zgn geconserveerde domeinen. Door het zoeken naar eiwitten met vergelijkbare domeinen, is de volledige verzameling van GH13, 15 en 31 familieleden herkend in het A. niger genoom en werden 17 nieuwe leden geïdentificeerd. De expressie‐analyse van de genen die coderen voor deze eiwitten laat een groot aantal van deze genen zien met onverwachte expressiepatroon: ze werden noch geïnduceerd door maltose (het inducerende suiker voor de enzymen betrokken bij zetmeelafbraak) noch was de expressie afhankelijk van de aanwezigheid van de AmyR transcriptiefactor. Van slechts twee van de nieuw geïdentificeerde enzymen, een mogelijk α‐glucosidase (AgdB) en een mogelijk α‐amylase (AmyC), kan op grond van het expressieprofiel geconcludeerd worden dat ze een rol zouden kunnen spelen tijdens de groei van A. niger op zetmeel. De mogelijke fysiologische functies van de andere
Samenvatting
165
voorspelde familie GH13, GH15 and GH31 enzymen, inclusief voorspelde intracellulaire enzymen en eiwitten die zijn geassocieerd met het celmembraan of de celwand in alternatieve α‐glucan gerelateerde processen, worden besproken.
Van de nieuw geïdentificeerde enzymen uit de GH13 familie werden drie leden (AgtA, AgtB and AgtC) in detail verder bestudeerd. Deze eiwitten die hoge gelijkheid vertonen met schimmel α‐amylases, zijn speciaal omdat ze waarschijnlijk via een zgn.
GlycosylPhosphatidylInositol‐anchor (GPI‐anker) aan het plasmamembraan of aan de
celwand gebonden zijn. Opvallend was ook dat ze enkele sterk geconserveerde aminozuren uit de α‐amylase familie misten. Hoofdstuk 4 beschrijft de functionele karakterisering van twee van deze eiwitten (AgtA and AgtB). Beide eiwitten werden gezuiverd uit A. niger stammen die deze eiwitten tot overexpressie brengen en werden biochemisch gekarakteriseerd. Door het analyseren van het groeidefect van een agtA deletie stam en van stammen die agtA of agtB tot overexpressie brengen is de functie van de eiwitten verder bestudeerd. Zowel AgtA als AgtB vertonen een uniek type α‐(1, 4) glucanotransferase (EC 2.4.1.25) activiteit . Deletie van agtA in A. niger resulteerde in een stam met een verhoogde gevoeligheid voor een stof die de opbouw van de celwand verstoort, Calcofluor White , wat duidt op een rol van dit eiwit tijdens de vorming van de celwand. Interessant is dat homologen van AgtA and AgtB ook aanwezig zijn in andere schimmelsoorten met α‐glucan in hun celwand, maar niet in gist soorten die geen α‐glucan in hun celwand hebben. Een mogelijke functie van deze enzymen is dus dat ze een rol spelen bij de synthese van het α‐ glucan in de celwand.
In Hoofdstuk 5 onderzoeken we het A. niger genoom op de aanwezigheid van enzymen uit de GH32‐familie, waarvan wordt vermoed dat ze betrokken zijn bij de afbraak van inuline. Twee nieuwe intracellulaire eiwitten, SucB en SucC, werden geïdentificeerd, naast drie al bekende extracellulaire inulinolitische enzymen, SucA (invertase), InuE (exo‐inulinase) en InuA (endo‐inulinase). Transcriptie‐analyse liet zien dat de extracellulaire enzymen op een gecoördineerde manier tot expressie komen en dat de inductie plaatsvindt op inuline en sucrose. De transcriptie van deze genen was ook onder controle van de cataboliet repressor CreA. Verdere analyse gaf ook aan dat sucrose of een sucrose‐afgeleid molecuul , maar niet fructose, als inducer optreedt voor de expressie van inulinolytische genen in A. niger.
In Hoofdstuk 6 onderzoeken we of SucB, één van de twee nieuw ontdekte intracellulaire invertases, een essentiële rol speelt bij het maken van de inducer betrokken bij het inuline of sucrose katabolisme. Hiervoor zijn de phylogenetische, moleculaire and biochemische karakteristieken van SucB bestudeerd. Van het gezuiverde SucB eiwit is aangetoond dat het zich gedraagt als een invertase met transfructosylerende eigenschappen. Deletie van het sucB gen in A. niger resulteerde niet in verandering van de groei op inulin of sucrose, wat aantoont dat SucB geen essentiële rol lijkt te spelen tijdens inuline of sucrose katabolisme in A. niger. SucB zou daar en tegen nodig kunnen zijn voor intracellulaire omzetting van sucrose naar fructose en glucose of voor de hydrolyse van kleine fructo‐oligosacchariden.
Samenvatting
166
Zoals in Hoofdstuk 5 is beschreven werd de expressie van de genen die coderen voor de extracellulaire inulinolytische enzymen op eenzelfde wijze gereguleerd en geïnduceerd door sucrose en inuline. Dit suggereert dat er een gemeenschappelijke transcriptiefactor zou kunnen bestaan om de expressie van de genen te activeren in aanwezigheid van een inducer. In Hoofdstuk 7 beschrijven we de identificatie en karakterisering van een Zn(II)2Cys6 type transcriptiefactor, die we InuR hebben genoemd (Inuline Regulator). De identificatie van inuR was gebaseerd op de inspectie van genclusters in het A. niger genoom. Het inuR gen is geclusterd met sucB, een mogelijk intracellulair invertase (Hoofstuk 6) en een gen dat waarschijnlijk codeert voor een suikertransporter. Deletie van het inuR gen liet een sterke gereduceerde groei zien op inuline en sucrose. Inductie van de genen die coderen voor de extracellulaire inulinolytische enzymen en de suiker transporter naast de inuR transcriptiefactor in de aanwezigheid van sucrose en inulin was afhankelijk van InuR. Expressie‐analyse van alle genen uit het A. niger genoom onthulde de inductie van drie additionele genen die werden geïnduceerd op sucrose op een InuR afhankelijke manier. Deze drie genen coderen voor mogelijke suikertransporters die mogelijk betrokken zijn bij het transport van sucrose of sucrose afgeleide suikers (glucose en fructose) over de plasmamembraan. De specificiteit van deze suikertransporters is een interessant onderwerp en wordt nu verder onderzocht dmv biochemische analyses. In silico analyse van de promotergebieden van de door InuR gereguleerde genen onthulde een waarschijnlijke bindingsplaats voor InuR. Deze bestaat uit twee CGG triplets, gescheiden door acht nucleotiden, en komt voorin alle InuR afhankelijke, sucrose geïnduceerde genen. Deze mogelijke bindingsplaats lijkt erg op de al bekende bindingsplaats van de AmyR transcripti factor(CGGN8(C/A)GG). Analyse van de
dubbelmutant (ΔamyRΔinuR) onthulde dat de twee transcriptiefactoren
hoogstwaarschijnlijk onafhankelijk van elkaar functioneren. Hoe de InuR en AmyR transcriptiefactoren hun doelgenen bepalen en wat de specificiteit van de binding veroorzaakt is een interessant onderwerp voor verder onderzoek.
Onder de inulinolytische genen in A. niger hebben we het inuE gen geïdentificeerd als het sterkst geïnduceerde gen in de aanwezigheid van inuline en sucrose. In Hoofdstuk
8 presenteren we, gebruikmakend van de inuE promoter en twee reporter genen (racA‐
G12V en Groen Fluorescerend Protein (GFP), een nieuwe screeningsmethode voor de isolatie van mutanten die betrokken zijn bij inuline of sucrose signalering. Deze genetische screen, gevolgd door de identificatie van de gemuteerde genen, zou de identificatie mogelijk moeten maken van eiwitten die inducer moleculen genereren, transporteren of registreren. Ook zouden genen die coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij de activatie van de InuR transcriptiefactor geïdentificeerd kunnen worden. Deze methode kan in het algemeen worden gebruikt voor de identificatie van transcriptionfactor mutanten in A. niger en wellicht ook in andere schimmels. Tot slot wordt aan het eind van hoofdstuk 8, gebaseerd op de laatste vier hoofdstukken (5 t/m 8), een speculatief model gepresenteerd waarin de mogelijke functie van verschillende eiwitten die betrokken zijn bij de afbraak en opname van inuline en inuline afbraakproducten door A. niger wordt beschreven.
167
摘要
黑曲霉是一种广泛存活于植物残体中的丝菌体式真菌。作为一种腐生菌，它能产生大量不同 的水解酶，用来降解环境中植物的高分子多糖成分为小分子化合物，从而为其本身提供能源 和碳源。这些酶大都有很多（潜在的）用途，比如：在面包业，淀粉业，织物业以及食品和 饲料工业等。这些用途近来吸引了大量的研究兴趣。通过遗传、生化、生物信息等途径来开 发黑曲霉旨在更加清楚地了解其对糖类物质的降解、修饰网络，从而为提高酶的产量和底物 的利用率提供科学依据。另外，从黑曲霉中发现新活性酶也是一个主要因素。近年来由荷兰 的生物技术公司 DSM 和美国的 DOE 基因组研究所对黑曲霉的基因组测序的完成，以及黑曲 霉的基因芯片技术的具备，使得从黑曲霉中发现新活性酶以及从基因组水平上来分析其机体 内的碳水化合物（糖类）降解的转录调控网络成为可能。 这篇论文，我们的主要研究目标是探索黑曲霉降解、修饰碳水化合物的分子机制。 比如，黑曲霉是如何感受到周围环境中存在的不同碳源的；某种特定诱导碳源的存在或产生 又是如何激活这些降解酶基因的转录表达的。我们的研究重点在于寻找多糖类物质如淀粉、 菊糖、以及它们的衍生物在黑曲霉体内的降解途径中出现的诱导分子和转录调节因子。另 外，由这些结构基因编码的酶是如何催化不同的碳源的，以及这些酶的生理功能是什么，也 是我们研究的重要方面。 本论文的第一章概括了黑曲霉作为酶产生菌的重要性以及当前有关淀粉和菊糖降解修饰酶的 知识。有关碳水化合物降解的酶的转录表达和其蛋白产量在有机体内是高度调节的。这种调 节主要由各种不同的广泛转录因子（如 CreA、AreA、PacC 等），和特定糖类降解途径的转 录因子（如 AmyR 和 InuR）来控制的。这一章主要给读者了解有关调节基因表达的转录因 子的一些背景信息，同时也详细阐述了与碳水化合物降解有关的酶编码基因的调节机制以及 不同转录因子的一些重要特征。 为了发现降解淀粉、菊糖有关的新活性酶，我们采用了两种方法。第一种方法在第 二章里阐述。该方法是利用克隆技术来构建淀粉和菊糖特定的黑曲霉基因表达文库。这些基 因表达文库分别构建在以细菌和酵母为转化体的载体上。分子分析证明这些基因表达文库质 量尚好并被转化到细菌和酵母体内。由于 cDNA 翻译的蛋白表达量以及蛋白表达转化体的数 量的不足，目前只筛选出少量的转化体。该章末尾提出了几种改善 cDNA 表达文库的构建及 筛选方法的建议和措施。 第二种方法是利用已知活性酶的序列来调查黑曲霉的基因组，从而获得相似序列编 码的蛋白。在本文的第三章，我们介绍了植物淀粉可被 α‐淀粉酶，葡萄糖化酶及 α‐葡萄糖苷 酶降解成小分子的葡萄糖。这些酶分别属于糖苷水解酶系 13、15 和 31 家族，因此在第三章 里我们主要调查了黑曲霉基因组中可能编码糖苷水解酶系 13、15 和 31 家族的酶。结果我们摘要 168 发现了 17 个新蛋白酶。通过基因组序列以及它们的转录表达水平调节的综合分析，结果显示