5. Potentiële denitrificatie
5.2.2 Bepaling van de potentiële denitrificatie
De potentiële denitrificatie is bepaald door middel van een anaërobe incubatie bij 20 oC in een met nitraat aangerijkte grond met behulp van acetyleeninhibitietechniek (Velthof en Oenema, 1995; Velthof, 2003). Acetyleen remt de omzetting van lachgas (N2O) naar N2, waardoor het goed meetbare N2O het enige eindproduct is van denitrificatie (Yoshinari et al., 1977). De N2O is bepaald met een foto-acoestische gasmonitor van Bruel & Kjaer (Velthof en Oenema, 1995) na 1, 2 en 3 dagen. De methode waarin de potentiële denitrificatie wordt bepaald door middel N2O-productie met acetyleeninhibitie komt overeen met de methode waarin de potentiële denitrificatie wordt bepaald door middel van bepaling van de afname van de nitraatconcentratie in de bodem tijdens incubatie (Zwart, 2003). De detectielimiet van de methode met acetyleeninhibitie is lager dan de methode op basis van nitraatafname. Daarnaast is de acetyleeninhibitiemethode sneller, goedkoper en vraagt om minder bodemmonster. Een onzekerheid bij het gebruik van de acetyleeninhibitiemethode is het effect van acetyleen op de Thiobacillus denitrificans, een bacterie die pyriet als energiebron voor denitrificatie kan gebruiken. In een studie van Dalsgaard en Bak (1992) met een bepaalde stam van Thiobacillus denitrificans bleek acetyleen niet de reductie van N2O te remmen. Het is niet duidelijk of dit binnen Thiobacillus denitrificans vaker voorkomt. Alle bepalingen zijn uitgevoerd op het laboratorium van de sectie Bodemkwaliteit van de Wageningen Universiteit en Research Centrum.
De bepaling van de potentiële denitrificatie werd in een periode van vijf dagen uitgevoerd. Op dag 1 werd verse grond in de incubatieflessen van 500 ml ingewogen, overeenkomend 100 gram droge grond. Het vochtgehalte is bepaald door middel van drogen met 105 oC. De flessen met gronden werden vervolgens één dag geïncubeerd bij 20 oC. Dit werd gedaan om de activiteit van de bacteriën te verhogen, aangezien de monsters in een koelcel waren opgeslagen. Op dag 2 werden de grondmonsters met water bevochtigd en daarna werd 5 ml van een KNO3-oplossing toegediend (0,086 M NO3), zodat het nitraatgehalte van de
bodemoplossing ongeveer 1,2 g l-1 bedroeg (meer dan 300 mg N per kg grond). De oplossing werd goed door de grond gemengd. Alle grondmonsters werden met water verzadigd en als “slurry” geïncubeerd (het uiteindelijke vochtgehalte bedroeg 0,20-0,35 g water per g vochtige grond). De flessen werden daarna met N2 geflushed om anaërobe condities te creëren. De flessen werden met een dop met septum afgesloten en er werd 25 ml acetyleen (C2H2) toegevoegd, zodat de C2H2-concentratie in de headspace ongeveer 5% (v/v) bedroeg. Op dag 3, 4 en 5 is de N2O-concentratie van de headspace van de flessen gemeten. De
gemiddelde meettijd per monster bedroeg 3,5 minuten en na elk monster werd de gasanalyzer met N2 gespoeld. Na de laatste meting op dag 5 is het volume van de headspace bepaald door het verschil in gewicht tussen de fles met alleen grond en de fles met grond die met water is gevuld. De gemeten N2O-concentratie in de headspace wordt gecorrigeerd voor de N2O in de aan- en afvoerslangen en de inhoud van de gasanalyzer:
[1] N2Ocor = (N2Om*(volumefles + volumeanalyzer) – N2Oanalyzer* volumeanalyzer)/volumefles waarin
N2Ocor = de gecorrigeerde N2O-concentratie in de headspace van de fles in μl l-1 N2Om = de gemeten N2O-concentratie in de headspace van de fles in μl l-1
N2Oanalyzer = de N2O-concentratie van de lucht in de analyzer die in de headspace van de fles wordt geblazen (dit is de N2O-concentratie van de vorige meting)
volumefles = volume van de headspace van de fles met grond in liter
volumeanalyzer = intern volume van de analyzer en het volume van de aan- en afvoerslangen in liter (was 70 ml in dit onderzoek)
De N2O-productie in μg stikstof per kg grond per dag wordt berekend uit de toename van de gecorrigeerde N2O-concentraties in de headspace tussen twee tijdstippen, de tijd tussen twee metingen, het volume van de headspace en de hoeveelheid grond:
[2] N2O-productie = (N2Ot2 – N2Ot1 ) * volumefles /molairN2O * molgewichtN2O/grond/tijd waarin
N2O-productie = de N2O-productie in μg N kg-1 droge grond dag-1
N2Ot2 = de gecorrigeerde N2O-concentratie in de headspace van de fles op
tijdstip 2 in μl l-1
N2Ot1 = de gecorrigeerde N2O-concentratie in de headspace van de fles op
tijdstip 1 in μl l-1
volumefles = volume van de headspace van de fles met grond in liter.
molairN2O = het molair volume van N2O in l mol-1 (1 mol = 22,4 l bij 20 oC) molgewichtN2O = het molgewicht van N2O-N (28 g per mol N2O als N)
grond = hoeveelheid droge grond in kg tijd = tijd tussen de twee metingen in dagen
De potentiële denitrificatie (μg kg-1 droge grond dag-1 als N) is de maximale dagelijkse N2O-productie die in de drie dagen is gemeten. De potentiële denitrificatie verschilt soms tussen de drie dagen, maar er is geen duidelijk patroon. Er is dus geen aanwijzing dat de potentiële denitrificatie toeneemt in de periode van drie dagen, hetgeen zou duiden op adaptatie van bacteriën en een toenemende denitrificatie-activiteit.
5.2.3 Bodembepalingen na CaCl
2–extractie van grondmonsters
Naast de potentiële denitrificatie zijn enkele andere bepalingen uitgevoerd. Hiervoor zijn de grondmonsters gedroogd bij 40 oC, gedurende twee uur bij 20 oC geëxtraheerd met
0,01 M CaCl2 (verhouding 3 gram grond in 30 ml 0,01M CaCl2-oplossing; Houba et al., 2000). De extracten zijn bepaald op NO3, NH4, totaal N en oplosbaar organische C (SOC; soluble organic C) volgens procedures beschreven door Houba et al., 2000). Het gehalte aan oplosbare organische (SON; soluble organic N) is berekend uit het verschil tussen totaal N en anorganisch N (NO3 + NH4). Daarnaast is de pH van het extract bepaald.
De uitslagen van de analyses met CaCl2-extractie worden door het laboratorium weergegeven in mg per kg droge grond. De grondmonsters zijn echter afkomstig van met water verzadigde lagen, zodat verwacht mag worden dat er water uit de monsters is gelopen tijdens het nemen, het transporteren en het voorbehandelen van de monsters. Dit leidt tot een onderschatting van de werkelijke gehalten, indien de gehalten worden uitgedrukt per kg droge grond. Aangezien de vochtgehalten bekend zijn, kunnen de concentraties worden omgerekend naar mg per liter bodemvocht. Deze gegevens worden dan ook gepresenteerd.