poly(amidoamine)s (PAAs) voor het functionaliseren van oppervlakten van verschillende soorten biomaterialen. De relatie tussen structuur en functie van verschillende PAAs wordt in detail besproken met betrekking tot het vermogen multilagen op te bouwen en de mogelijkheden de verkregen multilagen toe te passen voor gecontroleerde afgifte. Twee potentiele toepassingen van de ontwikkelde multilagen zijn verder uitgewerkt, nl. de afgifte van nucleotiden voor gen-transfectie en de afgifte van laag-moleculaire bioactieve stoffen.
Hoofdstuk 1 geeft een algemene inleiding over het onderwerp van dit proefschrift en een overzicht van het in dit proefschrift
beschreven onderzoek. In Hoofdstuk 2 wordt een literatuurstudie beschreven die de fysicochemische eigenschappen en mogelijke biomedische toepassingen van laag-voor-laag (LbL) opgebouwde multilagen behandelt.
In Hoofdstuk 3 beschrijft de eerste studies om LbL multilagen te maken van enkele lineaire PAAs waarvan is gebleken dat ze veelbelovende niet-virale vectoren voor gentherapie zijn. De serie bestond uit PAAs met toenemende positieve lading onder fysiologische omstandigheden. Het uitgangspunt daarbij was dat de ladingsverschillen tussen de PAAs zullen resulteren in verschillen in het vermogen om met DNA een multilaag coating te vormen. De experimenten lieten zien dat PAAs met hoge positieve lading met DNA multilagen vormen waarin minder DNA is opgenomen dan de multilagen gevormd met minder positief geladen PAA. De multilagen met de hoog positieve PAAs zijn echter wel stabieler onder fysiologische omstandigheden. Vorming van LbL multilagen met het minst positief geladen PAA, pCABOL, geeft in de hoogste incorporatie van DNA per depositie cyclus, maar de resulterende coating verandert snel van structuur en verlies meer dan de helft van het DNA-gehalte binnen een uur onder fysiologische omstandigheden. Het meest positief geladen PAA (pCDAB) blijkt duidelijk cytotoxische eigenschappen te hebben, maar de beide andere PAAs, pCHIS en pCABOL bleken goed biocompatibel te zijn en in staat om cellen in vitro via het oppervlak van de multilagen te transfecteren. Pogingen om de stabiliteit van de LbL multilagen te vergroten en de afgifte van het transfectie agent te controleren zijn beschreven in
Hoofdstuk 4. Een serie van lineaire copolymeren met variabele hoeveelheid pCDAB en pCABOL werd gesynthetiseerd om
het effect van extra positieve lading op stabiliteit van de meerlaagse coating te bestuderen. Een multilaag van pCDAB/pCABOL met 90% ABOL geeft een hogere stabiliteit dan die van het pCABOL homopolymeer, maar bevat minder ingebouwd DNA. Om de stabiliteit van deze multilaag verder te vergroten werd deze covalent gecrosslinked met glutaraldehyde (GA), waardoor de stabiliteit van de multilaag sterk toeneemt. Vergelijking van de transfectie capaciteit van de verschillende multilagen laat zien dat deze afneemt in de volgorde pCABOL homopolymeer > 90% ABOL copolymeer > GA gecrosslinkte 90% ABOL copolymeer. Deze volgorde is een belangrijke indicatie dat de mogelijkheid DNA (als polymeercomplex) af te geven uit de multilagen een belangrijke factor is om effectieve celtransfectie vanuit de LbL multilagen te verkrijgen.
In Hoofdstuk 5 wordt de synthese van twee willekeurig vertakte copolymeren van boorzuur (BA) gefunctionaliseerde PAAs (BA-PAAs) beschreven, alsmede de vorming van multilagen van deze copolymeren met de diol-bevattende macromoleculen poly(vinyl alcohol) (PVA) en chondroitin sulfaat (ChS). De boorzuurgroepen in de BA-PAAs vormen een reversibele binding met de diolgroepen van respectievelijk PVA en ChS onder vorming van een boorzure ester groep waardoor er een dynamische (reversibele) interactie tussen de twee types lagen ontstaat. Multilagen opgebouwd uit BA-PAAs met PVA waren relatief dun en erg gevoelig voor zure pH en glucose in oplossing. Multilagen met ChS waren dikker en reageerden niet op de aanwezigheid van glucose in oplossing terwijl de respons op pH verlaging een gecompliceerd patroon liet zien. De verschillen kunnen verklaard worden door aan te nemen dat voor de BA-PAA/PVA multilagen de boorzure ester vorming de belangrijkste kracht is om de lagen bij elkaar houden, terwijl dit voor de BA-PAA/ChS multilagen de electrostatische interacties zijn tussen het positief geladen BA-PAA en het negatief geladen ChS. Hieruit werd geconcludeerd dat de ChS gebaseerde multilagen nog vrije boorzuurgroepen bevatten die gebruikt zouden kunnen worden om een afgiftesysteem te ontwikkelen voor bioactieve moleculen die een diol groep bevatten, terwijl de op PVA gebaseerde multilagen geschikt zouden kunnen zijn voor de afgifte van boorzuur bevattende verbindingen. In vitro celcultuur studies lieten zien dat op alle
multilagen goede celgroei plaatsvindt, gelijk aan die op polystyreen oppervlakken. Hoofdstuk 6 beschrijft de toepassing van op ChS gebaseerde multilagen als afgiftesysteem voor alizarine S (ARS), dat dient als model voor catecholamine medicijnen. Het blijkt mogelijk om tijdens de opbouw van de multilagen bij elke depositie cyclus ARS in gecontroleerde hoeveelheden mede op te nemen. De ARS beladen multilagen zijn responsief op aanwezigheid van reducerende agentia en verlaging van pH en geven ARS af dat zowel in vrije vorm als in de vorm van BA-PAA gebonden boorzure ester door de aanwezige cellen wordt opgenomen. De laatste vorm is zichtbaar in de cellen vanwege de specifieke fluorescentie van de boorzure ester. Door middel van confocale microscopie was ook zichtbaar dat er fluorescente deeltjes in de kern van de cellen aanwezig waren. In Hoofdstuk 7 worden experimenten beschreven waarbij multilagen gebaseerd op PVA met BA- PAA worden beladen met bortezomib, een proteasoom-remmer die gebruikt wordt bij de behandeling van multipel myeloom. De therapeutische effectiviteit van de multilagen werd geoptimaliseerd door variatie van de bortezomib concentratie in de depositie oplossing en door variatie van het aantal lagen in het multilaag systeem. Uit de resultaten blijkt dat de bortezomib beladen multilagen een duaal afgifte profiel vertonen waarbij bortezomib opname door de cellen afhankelijk is van de directe omgeving waarin de cellen zich bevinden. De hoogste dosis bortezomib wordt opgenomen door cellen die in direct contact zijn met het bortezomib beladen oppervlak van de multilagen. Cellen die niet in direct contact met de multilagen zijn nemen bortezomib op via het medium waaraan het bortezomib uit de multilagen wordt afgegeven. In dit laatste geval is het aantal lagen waaruit het multilaag systeem is opgebouwd van directe invloed omdat dit dienst doet als depot voor bortezomib.
Hoofdstuk 8 beschrijft de optimalisatie van de eerder in Hoofdstuk 3 beschreven pCHIS en pCABOL gebaseerde multilagen
voor oppervlakte-gemedieerde cel transfectie. Variatie in de zaaidichtheid van de cellen op het oppervlak van de multilagen en het effect van elk PAA op de transfectie-efficiëntie is daarbij onderzocht. Voor beide PAAs blijkt een gemiddelde zaaidichtheid van de dellen op het oppervlak de beste transfectie resultaten te geven. pCABOL is daarbij meer effectief dan pCHIS, wat wordt toegeschreven aan het vermogen van de pCABOL multilagen om meer plasmid DNA op te nemen en de doorgaans betere transfectie die met pCABOL/DNA complexen wordt verkregen. De gevonden optimale condities werden daarna toegepast voor 2D en 3D coating van poly(ε-caprolacton) (PCL), ge-hepariniseerd PCL (PCL-HEP), en polymelkzuur (PLA) oppervlakken. Hierop konden met succes multilagen worden aangebracht en cellen op deze materialen werden tot 50% getransfecteerd.
Daarbij bleek tevens dat na coating met een multilaag op de PCL en PLA materialen aanzienlijke verbetering van de cel aanhechting optrad. Transfectie verliep ook succesvol op 3D PCL en PCL-HEP materialen voorzien van multilagen, hetgeen de mogelijk opent om op deze wijze gefunctionaliseerde materialen te ontwikkelen die gecontroleerd bioactieve stoffen aan cellen afgeven in contact met deze materialen.