Aegilops speltoides-spesifieke volgordes: TST3, TST6, TST7, TSH1, TSH3

Die inleierstelle wat nie ten volle geoptimiseer kon word nie en onduidelike, polimorfiese bande van onverwagte grootte geamplifiseer het, sal hier bespreek word. In iedere geval is verskeie pogings aangewend om die PKR van elke inleierstel te optimiseer deur die DNS, inleierstel, MgCl2, sowel as die dNTP konsentrasies asook die smeltingstemperatuur van die inleierstel te wysig.

Die Ae. speltoides-transposon 3 (TST3) inleierstel kon nie volledig geoptimiseer word nie (Figuur 10A). Daar kan wel ‟n band van ongeveer die regte fragment-grootte (700 bp) soos bepaal deur die IDT-inleier-ontwerp-program, waargeneem word. Dié fragment is in die S13-translokasie geamplifiseer, maar nie in Ae. speltoides nie. Die amplifikasiesetel van die inleierstel kan dus nie met sekerheid met die Ae. speltoides chromatien in die translokasie verbind word nie. Daar was ook koring-spesifieke amplifikasie in die negatiewe monsters (CS, CS-S, W84-17) waarvan die bande ‟n effens sterker intensiteit getoon het as die band in die S13 translokasie laan.

Ae. speltoides-transposon 6 (TST6) (Figuur 10B). Die onvolledig geoptimiseerde PKR

reaksie het steeds verskeie produkgroottes geamplifiseer, waaronder ‟n band van die voorgestelde grootte soos bepaal deur die IDT-inleier-ontwerp-program. Hoewel daar polimorfisme waargeneem is, kon geeneen van die bande uitsluitlik met die Ae.

speltoides chromatien verbind word nie. Een band (> 300bp) is moontlik

koring-spesifiek en kom moontlik voor in die chromosoom 3AS-streek wat in die S13 translokasie verplaas is, aangesien dit verdwyn in laan 18. Die band kan moontlik ook as ‟n negatiewe merker gebruik word.

Die Ae. speltoides-transposon 7 (TST7) inleiers amplifiseer talle loci (Figuur 10C). Hoewel daar oënskynlik unieke bande in Ae. speltoides geamplifiseer is, is hierdie produkte nie ook in die S13 translokasie geamplifiseer nie. Dit wil daarop dui dat die betrokke Ae. speltoides-spesifieke loci buite die getranslokeerde streek val en dus nie nuttig is vir kartering nie.

Die Ae. speltoides-herhalende volgorde 1 (TSH1) PKR kon nie volledig geoptimiseer word nie (Figuur 10D). Daar kan wel ‟n band van ongeveer die regte fragment-grootte

(453 bp) soos bepaal deur die IDT-inleier-ontwerp-program, waargeneem word. Die band word egter in die negatiewe monsters naamlik: CS en CS-S waargeneem en glad nie in die Ae. monster soos verwag nie. Die sogenaamde Ae. speltoides-spesifieke-herhalende volgorde blyk dus om nie spesifiek vir Ae. speltoides te wees nie. Daar is ook nie-spesifieke amplifikasie, waarvan die bande ‟n sterker intensiteit (hoër amplifikasie konsentrasie) as die verlangde band het. Daar kan ook smere wat in die W84-17, Ae. speltoides en S13 translokasie lane voorkom, waargeneem word. ‟n Moontlike verklaring vir die smere kon dalk ‟n te hoë konsentrasie van DNS in die PKR-reaksiemengsel wees, maar daar was nog geen merkbare verskil in die intensiteit van die smere nadat die DNS konsentrasie met die helfte verminder is nie.

Die Ae. speltoides-herhalende volgorde 3 (TSH3) reaksie kon nie volledig geoptimiseer word nie (Figuur 10E). Daar kan wel ‟n band van ongeveer die regte fragment-grootte (127 bp) soos bepaal deur die IDT-inleier-ontwerp-program, waargeneem word. Die band word egter in die negatiewe monsters naamlik: CS en CS-S waargeneem en glad nie in die Ae. speltoides-monster soos verwag nie. Die sogenaamde Ae. speltoides-spesifieke-herhalende volgorde was dus ook nie spesifiek vir Ae. speltoides nie. Daar was ook nie-spesifieke amplifikasie, waarvan die bande ‟n sterker intensiteit (hoër amplifikasie konsentrasie) as die verlangde band gehad het. Daar het ook smere voor in die W84-17, Ae. speltoides en S13 translokasie lane voorgekom wat op te hoë DNS konsentrasie in die PKR-reaksiemengsel kon dui, maar daar was nog geen merkbare verskil in die intensiteit van die smere nadat die DNS met die helfte verminder is nie. Daar kan wel twee bande van ongeveer 300 en 500bp in die CS, CS-S en W84-17 lane waargeneem word wat as potensiële negatiewe merkers vir Ae. speltoides en translokasie S13 sou kon dien. Daar kan ook ‟n band van ‟n lae intensiteit in die Ae. speltoides en die S13 translokasie lane waargeneem word wat nie in die koringgenoom lane voorkom nie. Hierdie band kan as potensiële positiewe merker vir die spesie-genoom en translokasie dien. Hierdie produkte sal verder ontwikkel moet word voordat dit as merkers beskou kan word.

A) TST3 (700bp) B) TST6 (756bp) C) TST7 (888bp) D) TSH1 (453bp) L 1 2 3 4 5 -K 600 bp 700 bp 800 bp L 1 2 3 4 5 -K 700 bp 800 bp 1000 bp 800 bp 1000 bp 400 bp 500 bp L 1 2 3 4 5 -K L 1 2 3 4 5 -K

Figuur 10: Agarose foto‟s van die PKR-produkte van vyf Ae. speltoides-spesifieke volgordes. (A) TST3, Ae. speltoides-transposon 3; (B) TST6, Ae. speltoides-transposon 6; (C) TST7, Ae. speltoides-transposon 7; (D) TSH1, Ae. speltoides-herhalende volgorde 1. Kontrole-paneel om te toets vir Ae. speltoides-spesifieke amplifikasie: (1)

CS; (2) CS-S; (3) W84-17; (4) Ae. speltoides; (5) Volledige S13 translokasie. L – 100bp leer (HPLII, Bioline); -K – negatiewe kontrole (water).

E) TSH3 (127bp) 1 2 3 4 5 ─K L 200 bp 100 bp 50 bp Figuur 10: Vervolg:

(E) TSH3, Ae. speltoides-herhalende volgorde 3. Kontrole-paneel om te toets vir Ae. speltoides-spesifieke amplifikasie: (1) CS; (2) CS-S; (3) W84-17; (4) Ae. speltoides; (5) Volledige S13 translokasie. L – 100bp leer (HPLII, Bioline); -K – negatiewe kontrole (water).

+

3.5.2. Evaluering van sekere van die nuut-geïdentifiseerde Ae. speltoides spesifieke en koring-spesifieke volgorde-inleierstelle om te onderskei tussen S13 rekombinante

Die merker-soektog (afdeling 3.5.1) wat gebaseer was op Ae. speltoides-spesifieke volgordes het verskeie potensieel-nuttige positiewe en negatiewe merkers vir die S13 translokasie opgelewer. Hieronder was fragmente wat gegenereer is deur inleierstelle

Ae. speltoides-transposon 8 (TST8) (Figuur 9E); Ae. speltoides-spesifieke volgorde 1

(TSS1) (Figuur 9K); inleierstel Ae. speltoides-transposon 6 (TST6) (Figuur 10B) en Ae.

speltoides-herhalende volgorde 3 (TSH3) (Figuur 10E).

Daar is ook drie verskillende SCAR-merkers spesifiek vir die S13 translokasie ontwikkel deur Eksteen (2008).

Beide hierdie groepe van potensiële merkers is vervolgens gebruik om fragmente in al die rekombinante te amplifiseer en dit te ontleed.