Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR spectroscopy

Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR spectroscopy

Peter Kroon, s1687735  18/03/2015 

Abstract

Drug  development  is  a  challenging  process,  which  often  fails.  To  ameliorate  this,  we  attempted  to  develop an efficient methodology for fragment‐based drug design based on dynamic combinatorial  chemistry and NMR spectroscopy. To this end, two libraries were designed based on crystallographic  data from the group of Klebe for the model protein endothiapepsin using computer aided modelling. 

The designed compounds all feature an acylhdyrazone linker and at least one fluorine atom. The first  library  was  discarded  due  to  problems  with  the  synthesis.  The  second  library  was  analysed  using  quantitative  ¹⁹F‐NMR  and  ¹H‐STD‐NMR  spectroscopy,  using  trifluoroacetic  acid  as  an  internal  reference for the fluorine NMR spectra. No binding compounds could be identified, even though one  of the compounds was a known binder. It is hypothesised this is due to the trifluoroacetic acid since  the ¹H‐STD‐NMR  spectrometry  also  produced  no  results.  However,  it  could  be  concluded  that 

19F‐NMR  spectrometry  provides  better  peak  resolution  with  little  loss  of  sensitivity  compared  to 

1H‐NMR  spectrometry  when  analysing  mixtures;  and  that  STD‐NMR  requires  far  less  protein  than  regular NMR spectroscopy for analysing templated DCLs. 

Table of Contents

Abstract ... 1 

Table of Contents ... 2 

Introduction ... 3 

Structure‐based drug design ... 3 

Fragment‐based drug design ... 4 

Dynamic combinatorial chemistry... 5 

NMR techniques ... 7 

Quantitative NMR... 7 

Saturation‐transfer difference NMR ... 7 

Endothiapepsin ... 9 

Library design ... 10 

Modelling ... 14 

Discussion ... 16 

Quantitative ¹⁹F‐NMR ... 16 

1H‐STD‐NMR ... 16 

19F‐STD‐NMR ... 16 

Conclusions ... 17 

Acknowledgements ... 17 

Bibliography ... 17  Supporting Information ...S1  Library A — Compounds 1 to 8 ...S1  Modelling methods ...S1  Modelling results ...S2  Synthesis ... S11  Library B — Compounds 10 to 18... S27  Modelling results ... S27  NMR experiments ... S32  Preparation of NMR samples ... S32  Quantitative ¹⁹F‐NMR ... S32 

1H‐STD‐NMR ... S32  Quantitative ¹⁹F‐NMR results ... S33 

1H‐STD‐NMR spectrum ... S36   

Introd

Drug  de number  and  ana dynamic required

Structu

Drug dev enzymes these en selected dimensio consider and opti

Figure 1: T

Medicina the  enzy started. 

heavily  synthesi enzyme, crystal  s inhibitor found.^[1, intricate consumi

duction

evelopment  of compoun alyse  each  o c  combinato d in synthesis

ure‐based

velopment is s involved in nzymes kills o

 an inhibitor onal  structu red at this st

misation) an

The process fro

al chemistry yme  is  obta

By using co on  the  intu sed,  and  its , it is attemp structure  is  t r  that  do  no

2]  This  mea e)  compound

ing.  

nowadays  is nds that nee of  these  com

rial  chemist s, and nuclea

d drug de

s a long and n the disease

only the pat r can be desi ure  of  the  age.^[1] If a po nd finally sub

m disease to ne

y is involved  ained  (usual mputer‐aide uition  and  s s  efficacy  is  pted to obta then  used  in t  bind  efficie ns  that  bef ds  have  to 

s  plagued  b ed to be con mpounds.^[1,2 try  based  on ar magnetic r

esign

 costly proce e need to be

hogen (Targ gned based  enzyme.  C otent inhibit bmitted for c

ew drug. Figure

mainly in lea ly  via  crysta ed modelling skill  of  the 

tested  in  v ain a co‐cryst n  silico  to  ide

ently.  The  p ore  a  suffic be  synthesi

y  long  deve nsidered, and

2]  We  hope  n  already  kn resonance (N

ess, progress e identified a et identifica

on known in Commonly,  a tor is found,  clinical trials

e taken from Jia

ad optimisat allography),  g techniques medicinal  c vitro.  If  it  is  tal structure entify  empty process  is  rep ciently  poten ised,  purifie

elopment  tim d the amoun

to  ameliora nown  inhibit NMR) spectr

sing through and it has to tion and vali nhibitors, en

around  100 this lead is f (Figure 1).^[1,2

ang et al.^[2]  

tion.^[1] Once  an  iterative s, a potentia chemist  invo

confirmed  e of the enzy

y  pockets  in peated  until nt  inhibitor  d  and  analy

mes,  stemm nt of time re

ate  this  situ tors  to  grea oscopy to fa

h several disc o be confirm

idation). Onc zyme functio 0,000  separa urther optim

2] 

a three‐dim e  cycle,  dep l inhibitor is  olved.^[3]  This that  the  com yme with thi

  the  enzyme a  sufficient is  found  a  ysed.  This  is

ing  mainly  f equired to sy uation  by  e atly  reduce  cilitate analy

crete steps. 

ed that knoc ce a target e on, or ideally ate  compou mised (Lead d

mensional str picted  in  Fig s designed; t s  compound mpound  inh is inhibitor. 

e,  or  moietie tly  potent  in

multitude  o s  usually  ve

from  the  ynthesise  mploying  the  time  ysis. 

First, the  cking out  enzyme is  y a three‐

unds  are  discovery 

ucture of  ure  2,  is  this relies  d  is  then  hibits  the  This new  es  of  the  hibitor  is  of  (often  ery  time‐

Figure 2: The process of structure‐based drug design. 

Fragment‐based drug design

Fragment‐based  drug  design  is  a  methodology  that  can  be  used  to  facilitate  structure‐based  drug  design,  and  in  particular  the  lead‐identification  and  optimisation  steps.  Classically,  many  large  compounds  are  screened  against  a  target,  in  the  hope  one  or  more  will  bind  to  the  protein  (high‐throughput  screening,  HTS).  However,  because  the  compounds  screened  are  usually  rather  large, and enzymes bind compounds very selectively, many compounds often need to be screened to  find  a  successful  candidate.^[1]  Two  alternative  approaches  can  be  used  when  applying  fragment‐

based drug design: fragment linking, and fragment growing. 

In  fragment  linking  and  growing,  smaller  compounds  are  screened  instead.  These  will  usually  bind  the target enzyme only weakly, but chemical space can be sampled far more efficiently. If multiple,  small compounds bind the protein in different pockets, these can be thought of as fragments of the  ultimate inhibitor. In this case, if the binding modes of these fragments can be elucidated, it may be  possible  to  link  the  fragments  together  in  order  to  obtain  a  highly  potent  inhibitor  in  an  efficient  manner. However, great care must be exercised: if there is too much strain in the linker between the  fragments, or if it slightly too long or too short, this will prevent the inhibitor from binding like the  fragments, leading to a loss of potency. Because of this strict geometrical requirement on the linker,  fragment linking is usually considered  hard, but  there are examples in which  this methodology has  been successfully applied, resulting in very potent inhibitors.^[4–6]  

If instead there is only binding information available for one fragment, this fragment may be "grown" 

in  order  to  make  more  beneficial  interactions  with  the  protein.  This  process  is  generally  more  elaborate than fragment linking, but it is easier. There are still pitfalls however. It is often very easy  to  identify  empty  hydrophobic  pockets  in  a  three‐dimensional  model  of  an  enzyme.  Growing  the  inhibitor  in  this  direction  would  probably  result  in  an  insoluble  compound  however.  This 

Compound  synthesis and 

purification

Evaluation

Crystallography Modelling and 

design

methodo Figure 3.

In practi not  unco modellin

Figure 3: F large com small  orga manner. B pocket in o

Dynam

Dynamic compou template accordin of  chang affinity;^* noted  th template change i

*

ology  has  a .  

ice, the disti ommon  to  g ng is used to 

Fragment‐based pounds are scr anic  molecules  Bottom panel: 

order to form a

mic combi

c  combinato nds  is  form e, and will in ng to Le Chât ge  in  conce

*  this  degree hat  the  amp

e, and the to n concentra

lso  been  us

inction betw grow  one  fra facilitate the

d drug design. T eened against t bind  the  targe If only one sm a potent inhibit

inatorial c

orial  chemist med.^[12–14]  Ne n this way be telier's princi ntration  of  e  of  change 

lification  fac otal concentr tion, a lot of

ed  successf

ween fragme agment  in  o e process.  

Top panel: the  the target enzy et  protein  thes all organic mol or. Figure taken

chemistry

try  is  an  app ext,  if  a  tem e depleted fr

iple, making  individual  li

in  concentr ctor  is  a  func

ration of bui f template m

ully,  resultin

nt linking an rder  to  mim

classical appro yme, but only a se  may  be  link lecule binds th n from Erlanson

y

proach  in  w mplate  is  ad rom their eq more of the brary  memb ation  is  calle ction  of:  the lding blocks.

may be requir

ng  in  comm

nd fragment mic  a  second

oach to drug de  few — if any — ked  together  to e protein, this  n.^[1] 

which  a  libra dded,  some  quilibrium. Th e compounds bers  can  be 

ed  an  ampli e  affinity  of  . This means red.  

ercially  avai

growing is  .^[11]  In  all  th

esign is high‐thr

— will bind. Mid o  form  a  poten fragment may

ary  of  dynam library  mem he library wi s that bind (F

used  as  a  fication  fact the  binder,  , that in orde

ilable  drugs.

not so clear hese  cases,  c

roughput scree ddle panel: if tw nt  inhibitor  in  y be grown into

mically  inter mbers  can  ill then re‐eq Figure 4). Th measure  for tor.^[12–14]  It  s

the  concent er to see a s

.^[7–10]  See 

‐cut. It is  computer 

ning; many  wo or more  an  elegant  o an empty 

rchanging  bind  this  quilibrate  he degree  r  binding  hould  be  tration  of  ignificant 

DCC  has building  efficient significa member be  desig (few) dif target pr Because there are

Figure 4: A protein be

Since th connecti forming  Diels‐Ald conditio aqueous stopped  To these can  rev equilibra nucleoph of condit

s  the  advant blocks can b  screening o ntly accelera r has to be sy gned  around

fferent ways  rotein.  

 of this, dyn e numerous 

A schematic re est, it is selected

e only requi ions  can  be  reactions  c der  reaction ns  which  ca s environme

at will by ch e ends we h versibly  com

ation  occurs hilic catalyst tions (Schem

tage  that  rel be synthesise of large libra

ates both the ynthesised,  d  one  or  mo the system 

amic combin examples in

presentation o d from the libra

irement for  used  betwe an  be  used, ,  etc.  The  o an  be  tolera nt that is sli hanging the r ave opted fo mbine  to  fo   at  an  acidi t such as ani me 1). 

latively  few  ed in paralle ries with rel e synthesis a

purified and  re  fragment will show wh

natorial chem  which this t

of dynamic com ary. Figure take

DCC is that t een  the  bui ,  such  as  im only  prerequ

ted  by  the  ghtly acidic  reaction cond or acylhydra orm  an  acy

c  pH.  Addit line,^[20] allow

building  blo el, or may ev atively little  and analysis 

 analysed se ts.  For  exam hich linker ha

mistry is inc technique ha

mbinatorial che en from Mamid

the library c lding  blocks mine  format uisite  is  that 

template.^[12 or basic. La ditions, since zones as lin ylhydrazone tionally,  acyl wing this rea

ocks  need  to ven be comm

effort,^[12,14] 

of potential  eparately; pa mple,  if  two  f as the best o

reasingly be as been used

mistry. Since th yala and Finn.^[1

constituents  s.  In  principl ion,  transac the  reactio

,14,19]  In  case stly, it is des e this facilita king group. 

e.  Acylhydra hydrazone  e action to also

o  be  synthes mercially avai which mean inhibitors, si rticularly if a fragments  ca orientation a

ing used in d d successfully

he compound A

13] 

can intercha e,  all  revers ylation,  disu on  runs  at  a

e  of  a  prote sirable that t ates analysis.

Here an alde azones  are 

exchange  ca o be used un

sised,  and  th ilable. This a ns that this t

ince not eve a dynamic lib

an  link  toge and propertie

drug design, y.^[15–18] 

A2‐B3 binds th

ange, many  sible,  covale ulfide  forma n  acceptabl ein  this  is  u the equilibri .^[12,14]  

ehyde and h rather  sta an  be  cataly nder a broad

hat  these  allows for  echnique  ry library  brary can  ether  in  a  es for the 

[12,14] and 

e template 

different  nt  bond‐

tion,  the  e  rate  in  sually  an  ia can be 

hydrazide  ble,  and  sed  by  a  der range 

Scheme 1:

Classical (LC‐MS).

be stopp and  a  lo some of 

NMR te

Quantit NMR spe

1H‐NMR  sensitive structura abundan Secondly result in  An  alter addition sensitive from –20 solvents referenc In order  so, two  of  releva spectra. 

required Saturat An altern measure (STD‐NM which  is been sat the  nucl saturate

: The formation

ly,  DCLs  are . These tech ped, separat ot  of  protein these drawb

echnique

tative NMR ectroscopy i spectroscop e nucleus, an al informatio nt, many solv y, ¹H‐NMR si

overlapping rnative  to ¹H

, its gyroma e  as ¹H‐NMR

00 to 20 ppm  do not cont ce might be d to analyse a spectra are  ant  peaks  a

Since the ch d. 

tion‐transfe native to me e  the  bindin MR)  was  dev s  not  of  inte turated, this ear  Oberhau ed, and no lo

n of an acylhydr

e  analysed  u niques have tion may be    is  required  backs by usin

es

s a common py.  There  ar nd ¹H atoms on. Unfortun vents also co ignals span o g signals. 

H‐NMR  may  gnetic ratio  R.  Furthermo m. This mean

tain ¹⁹F atom desirable. 

a DCL with th recorded, on are  normalis

hange in equ

er differenc easuring the  g  of  ligands veloped.  The rest,  and  th s saturation c

user  effect  ( onger give a 

razone from an

using  metho e some draw hard to ach since  the  eq ng NMR spec

n analytical m re  good  reas

 are abunda nately, ¹H‐NM

ontain them, only a narrow

be ¹⁹F‐NMR is 83% as la ore, ¹⁹F‐NM ns that ¹⁹F sig ms, no isotop

hese techniq ne with tem

ed  against  a uilibrium is m

ce NMR change in e s  to  the  tem e  template,  i

is  saturation can transfer  (NOE).^[21]  As  signal in NM

n aldehyde and 

ods  such  as  wbacks since  ieve, all libra quilibrium  is ctroscopy. 

method in s sons  why ¹H ant in most o MR has some , demanding w spectral ra

R  spectrosco arge as that 

R  signals  sp gnals are oft pically enric

ques, a chan mplate and on

an  internal  measured dir

quilibrium c mplate.  To  th

in  this  case  n  spreads  th to a bound  a  result,  inh MR. This mea

a hydrazide un

liquid  chro they are de ary member s  measured 

ynthetic org H  is  so  popu

organic com e drawbacks g the use of (

ange: roughl

opy. ¹⁹F  is  1 of ¹H. This m pan  a  much 

en well sepa hed solvent 

ge in equilib ne without, 

reference  a rectly, large 

aused by ad his  end,  sat a  protein,  i hrough  the  p

inhibitor by hibitors  that ans that whe

der influence o

matography estructive, th s need to ha directly.  We

ganic chemis ular  in  NMR 

pounds, wh . Firstly, beca (expensive) d y from –2 to

00%  natura means that ¹

broader  spe arated. Also, 

is needed;^* 

brium is mea after which  nd  compare amounts of 

dition of a te uration‐tran s  saturated  protein.  Onc means of sp   bind  to  the en a regular   

of catalytic anili

y  mass  spec he equilibriu ave a differe e  hope  to  cir

stry, and in p since  it  is  t ich results in ause ¹H atom deuterated s o 12 ppm, w

lly  abundan

19F‐NMR is a ectral  range

since many  although an

asured direct the signal in ed  between 

template ar

emplate is to sfer  differen in  a  spectra ce  the  active pin diffusion e  protein  wi

1H‐NMR spe

ne. 

ctrometry  m has to  ent mass,  rcumvent 

particular  the  most  n a lot of  ms are so  solvents.^*  hich may 

t,  and  in  almost as  :  roughly  common  n internal 

tly. To do  ntensities  the  two  re usually 

o directly  nce  NMR  al  region,  e  site  has  n through  ll  also  be  ectrum is 

compare decrease Because many lig methods analysed problem

Figure 5: a protein  to multiple lig

Unfortun spectros circumve saturate the ¹H  c explicitly using  an capable  Of cours least one

ed to one wh e in intensity

  of  the  dyna gand molecu

s. For this to d.^[19]  Also,  ra m. 

a schematic dep o  ligands  that 

gand molecule

nately,  ¹H‐S scopy:  a  sm ent these hu ed  as  before, channel,  it  y  transferrin n  INEPT‐like 

of measurin se, when ana

e ¹⁹F atom. 

here the prot y; compound

amic  binding les, meaning o work howe apid  ligand  e

piction of STD‐

bind.  Due  to  d s. 

TD‐NMR  sp all  spectral  urdles, the te

,  and  the  sa is  decouple ng  the  satura

sequence.^[22 g ¹⁹F  whilst  alysing a DCL

tein was satu ds that do no

g  and  unbind g that this te ever, extensi exchange  is 

NMR spectrosc dynamic  bindin

ectroscopy range  and  echnique has

turation  is  t d,  and ¹⁹F  i ation  from  h

2]  This  techn saturating ¹H L using any ¹⁹

urated, the s ot bind the te ding  of  com echnique req

ive measure required,^[21

copy. Saturation ng  and  unbind

suffers  from the  require s been modif transferred  t is  observed hydrogens  n nique  howev

H.  

9F‐NMR tech

signals corre emplate will  pounds,  one quires far les ement times 

]  but  for  we

n is depicted in ing,  one  prote

m  the  same ment  for  is fied to ¹⁹F‐ST to  the  ligand .  Additional  nuclei  in  the ver,  does  req

hnique all lib

sponding to  not be affec e  protein  mo ss protein th

are required eak  binders 

 blue. Saturatio ein  molecule  ca

e  problems  otopically  e TD‐NMR, in w d.  However, 

sensitivity  e  inhibitor  to

quire  an  NM

rary membe

 bound inhib cted (Figure 5 olecule  may  an quantitat d when mixt this  is  usua

on is transferre an  transfer  sat

as  normal  nriched  solv which the te

instead  of  o can  be  obt o  the  fluorin MR  instrumen

ers need to c

bitors will  5).^[21]   

saturate  tive NMR  tures are  ally  not  a 

  ed from the  turation  to 

1H‐NMR  vents.  To  mplate is  observing  ained  by  ne  nuclei  nt  that  is 

ontain at 

Endoth

In  order attempt  fungus E This clas several s bonds,^[23 catalytic These as Some  of binding.^[

Figure  6: 

cartoon. T blue). The 

As  a  mo research complex which is  chemistr

hiapepsin

r  to  demons to design an Endothia par ss of enzyme

serious disea

3–25]  and  the c  dyad:  two 

spartic acids f  the  know

[19] 

  X‐ray  crystal  The catalytic dya

 water molecul

odel  enzyme h  group  of  K x  with  a  seri

beneficial fo ry is compat

[19]

n

strate  the  a n inhibitor fo asitica, and  es is widespr ases such as e  inhibitors 

aspartic  aci s are tightly 

n  inhibitors 

structure  of  e ad (aspartic aci le closely bound

e,  endothiap Klebe  et  al.^[2 ies  of  fragm or acylhydraz tible with en

advantages  D or the enzym it is a model 

ead, and has s malaria and known  toda id  residues 

bound to a w displace  th

ndothiapepsin d residues 32 a d to the catalyt

pepsin  is  re

28]  has  previ ents;  its  me zone exchan ndothiapepsi

DCC  can  off me endothia

enzyme for  s varied biol d AIDS.^[23–25]

ay  block  the (Asp‐32  and water molec his  catalytic 

(PDB  code:  1E and 215) is dep tic dyad is show

eadily  availab iously  publis echanism  is 

ge;^[23,26] it ha n;^[19] and las

fer  in  fragm pepsin. This  aspartic pro ogical functi  Its function e  active  site d  Asp‐215)  o

cule through water  mole

ER8^[27]).  The  pr icted as a stick  wn as a red sphe

ble  and  crys shed  co‐crys

fully  elucida as been show stly, our grou

ment‐based  d protein is o teases.^[23]  

ions and play n in nature is

.^[23,26]  This  a of  which  one h hydrogen b

ecule,  but  o

rotein  backbon model (Colour  ere. 

stallises  eas stal  structure ated;^[23,25]  its wn in the pas

up is current

drug  design, originally fou

ys a causativ s to hydroly active  site  fe

e  is  protona bonds (Figur others  requi

ne  is  depicted  r code: C: green

sily.  Addition es  of  this  en s  pH  optimu

st that acylhy tly also wor

,  we  will  nd in the 

ve role in  se amide  eatures  a  ated.^[23,25] 

e 6).^[23,25] 

ire  it  for 

as  a  green  n, O: red, N: 

nally,  the  nzyme  in  m  is  4.5,  ydrazone  king with 

Based on analysis  designed developm

Librar

A library by  the  g their  ori structure order to Fragmen substitut Since it  would  h acylhydr construc (Scheme Predicte found in

Figure  7:  T Colour cod surface is  water mol

S4 S2 

n the require and  contai d  a  library  o

ment can be

ry design

y of compou group  of  G.  K

iginal  paper es in Schem o accommod nt  F284  was ted with an e is hard to de have  to  be  o razone  moie cted by syste e 3). 

d  binding  m  the support

The  binding  m de: O: red, N: b depicted in gre lecule bound to

S1  

4 

ements that n  at  least  of  compoun e greatly acce

n

nds was des Klebe.^[28]  The r.  The  bindin e 2. Since th ate an acylh s  reduced  to ethylamine m esign the ide oriented,  a  t ety,  and  fo ematically inc

modes  for  al ting informat

odes  of  the  tw blue, F: pale cya ey. It can be see o the active site

 all potentia one  acylhyd ds  based  on elerated usin

signed based e  fragments  ng  modes  o he fragments hydrazone lin o  a  fluoroph moiety to pre eal linker an total  of  eigh our  featurin cluding meth

l  these  com tion. 

wo  fragments  c an, Caspartic dyad: en that the frag e upon binding 

S2'

al inhibitors s drazone  mo n  computer  ng DCC and S

d on fragmen   used  will  b of  these  frag

s overlap wh nker, whilst  henyl  moiety

event interfe d predict ex ht  inhibitors ng  a  "backw

hylene space

mpounds,  alo

co‐crystallised  w green, CF109: te gments bind in d (translucent re

  '

S3 S1

should conta iety  to  ena

models  in  o STD‐NMR spe

nts in comple e  referred  t gments  are  hen binding, preserving k y,  and  the  h erence with  xactly in wha

  were  desig ward"  acylh ers at either 

ong  with  cal

with  endothiap eal, CF284: hot p different pocke

d sphere). 

ain at least o ble  the  dyn order  to  de ectroscopy.

ex with endo o  as  F109  an depicted  in  they had to key interactio hydrazide  in  the acylhydr at way the a gned:  four  fe hydrazone  m

end of the a

culated  bind

pepsin  (PDB  co pink. Endothiap ets, and that fra

one fluorine  namic  excha

monstrate  t

othiapepsin  nd  F284,  in  n  Figure  7  a

o be made s ons with the   fragment  F razone excha acylhydrazon

eaturing  a  "

moiety.  The acylhydrazon

ding  energie

odes:  3PBZ  and pepsin's solvent agment F109 di

atom for  ange,  we  that  drug 

reported  line  with  and  their  smaller in  e protein. 

F109  was  ange.  

e moiety  forward" 

ese  were  ne moiety 

es  can  be 

  3PMU).^[28] 

t‐accessible  splaces the 

Scheme  2 acylhydraz moiety. 

Scheme  3

"forward" 

of the acyl

Due to p second l The  R'  endothia and F284 the  pos substitue These  ni crystal  s accelera done  fo enabling

2:  After  obtain zone  linker;  red

3:  The  designed (1–4) or "back lhydrazone mo

problems wi ibrary was d fragment  w apepsin in u

4, a new libr sition  of  the

ents were al ine  building  structures  of te  the  drug r  many  com g non‐destru

ing  binding  m ducing  F284  to

d  inhibitors.  Th kward" (5–8) ac iety, and is dep

th the synth esigned, this was  replace npublished  rary was des e  fluorine  w so designed 

blocks  were f  endothiape g‐developme mpounds  in 

ctive analysi

modes  for  fragm o  a  fluoropheny

hey  were  form cylhydrazone m picted in red. 

hesis of the  s time consis ed  for  imid work by M. 

signed. Since was  varied 

(Figure 8 an e  obtained  c epsin  in  orde

nt  process  s one  experim s of the DCL

ments  F109  an yl  moiety,  and

med  from  fragm moiety. A methy

R' fragment  sting of comm dazole  alde

Mondal, N.

e there was a (10–15),  a nd Scheme 4,

commercially er  to  demon since  both  t ment.  The  a L.  

nd  F284,  they    exchanging  th

ments  F109  an ylene spacer w

in Scheme 3 mercially ava hyde  (9),  w

Radeva, A.

ample space nd  some  co , 16–18). 

y  and  used  t nstrate  that  the  synthesi nalysis  was 

were  modifie he  hydrazide  of

d  F284  (Schem was systematica

3 (see Suppo ailable comp which  was 

Hirsch and G e around F28

ompounds  w

to  construct the  use  of  D s  and  biolog

done  using

ed  to  make  ro f  F109  for  an 

me  2)  by  addin ally included at 

orting Inform pounds.  

co‐crystallis G.  Klebe. Ba 84 inside the with  trifluo

t  a  DCL  base DCC  can  sig gical  analysi g  NMR  spect

oom  for  an  ethylamine 

ng  either  a  either end 

mation) a 

sed  with  ased on  9  e protein,  romethyl 

ed  on  co‐

nificantly  s  can  be  troscopy, 

Figure 8: C cyan,  Caspa

grey. It ca site via hy  

* Work of

S  

Co‐crystal struc

artic  dyad:  green,  n be seen that  drogen bonds (

       f M. Mondal, 

S

S4  S2 

ctures of F284  Cimidazol  aldehyde: imidazole alde (dashed yellow

        N. Radeva, A.

S1'  

(PDB code: 3PM :  orange,  CF284: ehyde requires 

lines).  

Hirsch and G  

MU)^[28] and imi :  hot  pink.  End a water molecu

. Klebe. To be

S2'

dazole aldehyd othiapepsin's  s ule (red sphere

e published. 

   S1

de.^* Colour cod solvent‐accessib e) in order to bi

de: O: red, N: b ble  surface  is  d ind to the prot

lue, F: pale  depicted  in  ein's active 

Scheme 4:

F284  was  hydrazides

: The building b varied,  and  p s 19–27. 

blocks used. The otentially  subs

e compounds a stituted  for  a  t

are based on F2 trifluoromethyl

284 and 9, but t l  group  in  ord

he position of t er  to  yield  acy

the fluorine sub ylhydrazones  1

  bstituent in  10–18  from 

Model

The  des inhibitor Modellin acylhydr stationa acylhydr Accordin mediate der Waa 15  are  Supporti Each  acy suite.^[30] 

isomeris visually i

Figure 9: T yellow  line water mol

S S2 

lling

igned  librari rs and would ng  was  perf razone  insid ry. Water m razone. 

ng to Moloc, d by a wate als interactio shown  in  F ing Informat ylhydrazone  Aspartic aci sm was cons inspected.  

The predicted b es.  Favourable lecule bound cl

4 

ies  were  firs d bind to the  formed  usin

e  the  prote olecules we

, all acylhydr r molecule; 

ons were gen igure  9  and tion. 

was  docked id residue 21 idered. The 3

binding mode o   Van  der  Waa osely to the cat

S1'   

st  studied  in enzyme like g  the  softw ein,  and  the

re reset to t

razones sho and occasion nerally very f d  10,  respec

d  inside  the  19 was proto 30 poses wh

of 13. Colour co ls  interactions  talytic dyad is s

n  silico,  to  s e the fragme ware  program

en  optimisin their position

uld bind  to  nally form a favourable. A ctively.  Bind

enzyme  us onated and  hich were mo

ode: O: red, F: 

involving  fluor shown as a red 

S2'

see  if  the  de nts upon wh m  Moloc^[29]

ng  its  posit ns according

the catalytic dditional hy As an examp ding  modes 

ing  the  Flex key water m ost promising

pale cyan, Cprot

rine  atoms  are sphere. 

esigned  com ich they wer by  first  gen ion  whilst  k  to the cryst

c dyad throu drogen bond ple, the bind

for  10–18 

X  docking  m molecules we g according t

tein: green, C13:  depicted  as  d

S1

mpounds  we re based. 

nerating  the keeping  the tal structure

ugh a hydrog ds. Furtherm ding modes o are  provide

module  in  th ere unrestra to the softw

purple, H‐bond dashed,  salmon

1 

re  viable 

e  desired    enzyme   for each 

gen bond  more, Van  of 13 and  ed  in  the 

he  LeadIT  ined; E/Z  ware were 

ds: dashed,  n  lines.  The 

Figure 10: 

yellow  line water mol

Unfortun was  bou FlexX  re scored b more im To  furth poses in yet,  it  is bound to  

S S2 

The predicted  es.  Favourable lecule bound cl

nately, FlexX und  to  the  c sults  were  d by  Hyde^[30] d mportantly, th

er  analyse  t  which the li s  unknown  w

o the catalyt

S4 

binding mode    Van  der  Waa osely to the cat

X produced n catalytic  dya discarded.  So directly; how

he ligand wa this  anomaly

igand was bo why  the  soft tic dyad. 

S1'   

of 15. Colour c ls  interactions  talytic dyad is s

no poses for  d  with  a  hy ome  ligands, wever, the re s not bound  y,  9  was  doc ound to the  tware  would

code: O: red, F: 

involving  fluor shown as a red 

any of the a drogen  bon ,  which  wer esulting  calcu

 to the cataly cked  using  F

catalytic dya d  not  produ

S2

pale cyan, Cpro

rine  atoms  are sphere. 

cylhydrazon d  via  a  wate e  most  prom ulated  energ

ytic dyad. 

FlexX.  In  this ad as indicat ce  poses  in 

'

tein: green, C15:  depicted  as  d

es in which t er  molecule.

mising  accor gy of binding

s  case,  the  s ted by the cr which  the  a

S

purple, H‐bond dashed,  salmon

the imidazol .  For  this  re rding  to  Mol g was very  p

software  did rystal structu

acylhydrazon

S1 

ds: dashed,  n  lines.  The 

le moiety  eason  the  loc,  were  poor, and 

produce  ure. As of  nes  were 

Discussion

Quantitative

F‐NMR

Two  spectra  were  recorded,  one  of  a  sample  containing  a  high  protein  concentration,  and  one  without protein (experimental details can be found in the Supporting Information). Peaks were well  separated, although less so for trifluoromethylated compounds. The integrals of the peaks from the  library  members  were  normalised  against  the  integral  of  peak  from  trifluoroacetic  acid  and  compared.  Since  sum  of  the  concentration  of  acylhydrazone  and  the  concentration  the  corresponding hydrazide should be constant, their respective peak areas were summed to 100%. The  result  is  plotted  in  Figure  11.  Unfortunately,  upon  addition  of  protein,  no  significant  change  in  concentrations is observed. This means that none of the compounds bind to the protein according to  these data. The raw data and spectra are provided in the Supporting Information. 

Figure 11:The difference in peak area for separate library members between a sample containing protein (plus), and one  without (minus).  

1

H‐STD‐NMR

No signal could be observed from the ¹H‐STD‐NMR spectrum, not even one originating from 9 (the  spectrum is provided in the Supporting Information). Since 9 is a known inhibitor this could indicate a  problem with library, and it is hypothesised that the trifluoroacetic acid interferes with the binding of  library members to the protein by either denaturing the protein, blocking the active site, or stopping  the acylhydrazone exchange. Therefore, these experiments should be repeated with either a lower  concentration  of  trifluoroacetic  acid,  a  different  reference  compound,  or  with  a  library  of  known  binders in order to validate the methodology. 

19

F‐STD‐NMR

Despite  our  best  efforts,  no ¹⁹F‐STD‐NMR  spectrum  could  be  recorded  on  the  NMR  spectrometers  available. No machine was available with a probe that could be tuned to ¹⁹F and ¹H simultaneously. 

Tuning a probe to ¹⁹F and saturating ¹H at −1.2 ppm by directly specifying the frequency  produced  too many artefacts to yield a useful spectrum.  

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Hydrazide Acylhydrazone

Conclusions

In  conclusion,  DCC  can  play  a  significant  role  in  both  fragment  linking  and  fragment  growing,  and  should  be  part  of  every  medicinal  chemist’s  toolkit.  However,  analysis  of  the  resulting  mixtures  is  often  challenging,  but  here  a  variety  of  NMR  techniques  can  help,  providing  a  way  to  analyse  an  equilibrating  library  in  a  non‐destructive  manner.  STD‐NMR  is  particularly  interesting  in  this  sense,  since it requires very little protein. 

As demonstrated, ¹⁹F‐NMR could extend these techniques further, granting less background signals  and excellent peak separation. The only additional requirement is that all relevant compounds must  contain at least one ¹⁹F atom. 

Modelling and the NMR studies are in agreement, and no inhibitor was found in this study. It would  be worthwhile to repeat this methodology with a library of known inhibitors, as well as repeating it  with  a  different  reference  compound  to  make  sure  trifluoroacetic  acid  does  not  influence  the  measurements.  Once  it  is  conclusively  proven  that ¹⁹F‐STD‐NMR  and  quantitative ¹⁹F‐NMR  are  suitable for analysing DCLs, it should be explored how little protein is required as a function of the  free energy of binding of the library members. 

Acknowledgements

I  would  like  to  particularly  thank  Pieter  van  der  Meulen  for  his  extensive  help  with  all  the  NMR  measurements,  as  well  as  his  limitless  patience  and  perseverance  in  trying  to  get ¹⁹F‐STD‐NMR  to  work on a machine that is not designed to do so. Furthermore, I would like to thank Milon Mondal  for  his  daily  supervision  and  help  with  the  syntheses;  and  I  would  like  to  thank  Anna  Hirsch  for  supervising this research project in her group.

Bibliography

1.  Erlanson, D. A. Introduction to fragment‐based drug discovery. Top. Curr. Chem. 317, 1–32  (2012). 

2.  Ou‐Yang, S.‐S. et al. Computational drug discovery. Acta Pharmacol. Sin. 33, 1131–1140  (2012). 

3.  Kutchukian, P. S. et al. Inside the mind of a medicinal chemist: the role of human bias in  compound prioritization during drug discovery. PLoS One. 7, e48476 (2012). 

4.  Hajduk, P. J. et al. NMR‐based modification of matrix metalloproteinase inhibitors with  improved bioavailability. J. Med. Chem. 45, 5628–5639 (2002). 

5.  Park, C. M. et al. Discovery of an orally bioavailable small molecule inhibitor of prosurvival B‐

cell lymphoma 2 proteins. J. Med. Chem. 51, 6902–6915 (2008). 

6.  Wada, C. K. The evolution of the matrix metalloproteinase inhibitor drug discovery program at  abbott laboratories. Curr. Top. Med. Chem. 4, 1255–1267 (2004). 

7.  Flaherty, K. T. et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. 

Med. 363, 809–819 (2010). 

8.  Bollag, G. et al. Clinical efficacy of a RAF inhibitor needs broad target blockade in BRAF‐

mutant melanoma. Nature. 467, 596–599 (2010). 

9.  Wyatt, P. G. et al. Identification of N‐(4‐piperidinyl)‐4‐(2,6‐dichlorobenzoylamino)‐1H‐ 

pyrazole‐3‐carboxamide (AT7519), a novel cyclin dependent kinase inhibitor using fragment‐

based X‐ray crystallography and structure based drug design. J. Med. Chem. 51, 4986–4999  (2008). 

10.  Artis, D. R. et al. Scaffold‐based discovery of indeglitazar, a PPAR pan‐active anti‐diabetic  agent. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 262–267 (2009). 

11.  Sandanayaka, V. et al. Discovery of 4‐[(2S)‐2‐{[4‐(4‐Chlorophenoxy)phenoxy]methyl}‐1‐

pyrrolidinyl] butanoic acid (DG‐051) as a novel leukotriene A4 hydrolase inhibitor of  leukotriene B4 biosynthesis. J. Med. Chem. 53, 573–585 (2010). 

12.  Ramström, O. & Lehn, J.‐M. Drug discovery by dynamic combinatorial libraries. Nat. Rev. Drug  Discov. 1, 26–36 (2002). 

13.  Mamidyala, S. K. & Finn, M. G. In situ click chemistry: probing the binding landscapes of  biological molecules. Chem. Soc. Rev. 39, 1252–1261 (2010). 

14.  Mondal, M. & Hirsch, A. K. H. Dynamic combinatorial chemistry: a tool to facilitate the  identification of inhibitors for protein targets. Chem. Soc. Rev. 44, 2455–2488 (2015). 

15.  Erlanson, D. A. et al. In situ assembly of enzyme inhibitors using extended tethering. Nat. 

Biotechnol. 21, 308–314 (2003). 

16.  Maly, D. J., Choong, I. C. & Ellman, J. A. Combinatorial target‐guided ligand assembly: 

identification of potent subtype‐selective c‐Src inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97,  2419–2424 (2000). 

17.  Huc, I. & Lehn, J. M. Virtual combinatorial libraries: dynamic generation of molecular and  supramolecular diversity by self‐assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 2106–2110 (1997). 

18.  Bunyapaiboonsri, T. et al. Dynamic deconvolution of a pre‐equilibrated dynamic combinatorial  library of acetylcholinesterase inhibitors. Chembiochem. 2, 438–444 (2001). 

19.  Mondal, M. et al. Structure‐based design of inhibitors of the aspartic protease endothiapepsin  by exploiting dynamic combinatorial chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, 3259–3263  (2014). 

20.  Bhat, V. T. et al. Nucleophilic catalysis of acylhydrazone equilibration for protein‐directed  dynamic covalent chemistry. Nat. Chem. 2, 490–497 (2010). 

21.  Viegas, A., Manso, J., Nobrega, F. L. & Cabrita, E. J. Saturation‐Transfer Difference (STD) NMR: 

A Simple and Fast Method for Ligand Screening and Characterization of Protein Binding. J. 

Chem. Educ. 88, 990–994 (2011). 

22.  Diercks, T. et al. Fluorinated carbohydrates as lectin ligands: versatile sensors in 19F‐detected  saturation transfer difference NMR spectroscopy. Chemistry. 15, 5666–5668 (2009). 

23.  Coates, L. et al. The catalytic mechanism of an aspartic proteinase explored with neutron and  X‐ray diffraction. J. Am. Chem. Soc. 130, 7235–7237 (2008). 

24.  Davies, D. R. The structure and function of the aspartic proteinases. Annu. Rev. Biophys. 

Biophys. Chem. 19, 189–215 (1990). 

25.  Coates, L., Erskine, P. T., Wood, S. P., Myles, D. A. A. & Cooper, J. B. A neutron laue diffraction  study of endothiapepsin: Implications for the aspartic proteinase mechanism. Biochemistry. 

40, 13149–13157 (2001). 

26.  Coates, L., Erskine, P. T., Crump, M. P., Wood, S. P. & Cooper, J. B. Five Atomic Resolution  Structures of Endothiapepsin Inhibitor Complexes: Implications for the Aspartic Proteinase  Mechanism. J. Mol. Biol. 318, 1405–1415 (2002). 

27.  Pearl, L. & Blundell, T. The active site of aspartic proteinases. FEBS Lett. 174, 96–101 (1984). 

28.  Köster, H. et al. A small nonrule of 3 compatible fragment library provides high hit rate of  endothiapepsin crystal structures with various fragment chemotypes. J. Med. Chem. 54,  7784–7796 (2011). 

29.  Gerber, P. R. & Müller, K. MAB, a generally applicable molecular force field for structure  modelling in medicinal chemistry. J. Comput. Aided. Mol. Des. 9, 251–268 (1995). 

30.  Augustin, B. G. S. LeadIT 2.1.3. at <http://www.biosolveit.de> 

31.  Schrödinger LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7.2. (2010). at 

<http://www.pymol.org> 

32.  McDonald, C. et al. The N‐iodosuccinimide‐mediated conversion of aldehydes to methyl  esters. J. Org. Chem. 54, 1213–1215 (1989). 

33.  Sharma, A. K., Subramani, A. V. & Gorman, C. B. Efficient synthesis of halo indanones via  chlorosulfonic acid mediated Friedel–Crafts cyclization of aryl propionic acids and their use in  alkylation reactions. Tetrahedron. 63, 389–395 (2007). 

34.  Zhou, D. et al. 2‐(Pyrrolidin‐1‐yl)ethyl‐3,4‐dihydroisoquinolin‐1(2H)‐one derivatives as potent  and selective histamine‐3 receptor antagonists. J. Med. Chem. 55, 2452–2468 (2012). 

35.  Surry, D. S. & Buchwald, S. L. Dialkylbiaryl Phosphines in Pd‐Catalyzed Amination: A User’s  Guide. Chem. Sci. 2, 27–50 (2011).  

Supporting Information

All figures in this work featuring endothiapepin are generated using PyMOL.^[31] 

Library A — Compounds 1 to 8 Modelling methods

The target compounds were first designed inside the protein using Moloc,^[29] and their position was  optimised whilst keeping the protein stationary. Each acylhydrazone was docked inside the enzyme  using the FlexX docking module in the LeadIT suite.^[30] Aspartic acid residue 219 was protonated and  key  water  molecules  were  unrestrained;  E/Z  isomerism  was  considered.  30  poses  were  kept  per  ligand.  

The  resulting  poses  were  visually  inspected  to  ensure  they  bound  to  the  protein  like  the  original  fragments, and were otherwise discarded. The most promising pose was used for Hyde scoring^[30] in  order to obtain a predicted free energy of binding (ΔG_Hyde).  

Colour code for the figures: O: red, N: blue, F: pale cyan, C_protein: green, C_ligand: orange. The solvent‐

accessible  surface  of  the  protein  is  shown  in  grey.  Hydrogen  bonds  are  shown  as  dashed,  yellow  lines. 

Modelling results

Table S1 depicts the binding energies as predicted by Hyde. 

Compound  ΔGHyde (kJ/mol) 

1  −30 

2  −39 

3  −21 

4  −30 

5  −32 

6  −39 

7  −19 

8  −17 

Table S1: The binding energies for compounds 1–8, predicted by Hyde. 

1: (E)‐N

ΔG_Hyde =   

N'‐(2‐(2‐Ami

−30 kJ/mol 

S4  S2 

noethyl)‐5‐

S1'   

(diethylami

ino)benzyliddene)‐2‐fluo

S

orobenzohyd

S2' 

S

drazide

3  S1 

2:(E)‐N'

ΔG_Hyde =   

S

'‐(2‐(2‐Amin

−39 kJ/mol 

S4  S2 

noethyl)‐5‐(

S1'   

(diethylamin

no)benzyliddene)‐2‐(2‐fl

S2

luorophenyl

2' 

S3

l)acetohydr

3  S1 

razide

3: (E)‐N

ΔG_Hyde =   

S2  

N'‐(2‐(2‐(2‐A

−21 kJ/mol 

S4   

Aminoethyl)

S1' 

‐5‐(diethylaamino)phen

nyl)ethyliden

S2'

ne)‐2‐fluoro

S3 S

obenzohydra

S1 

azide

4: (E)‐N drazide

ΔG_Hyde =   

S

N'‐(2‐(2‐(2‐A

−30 kJ/mol 

S4  S2 

Aminoethyl)

S1'   

‐5‐(diethyla

amino)phennyl)ethyliden

S2

ne)‐2‐(2‐fluo

2'

S3

orophenyl)a

3  S1 

acetohy

5: (E)‐2

ΔG_Hyde =   

‐(2‐Aminoe

−32 kJ/mol 

S4  S2 

thyl)‐5‐(die

S1'   

ethylamino)‐‐N'‐(2‐fluorobenzyliden

S

ne)benzohyd

S2' 

S

drazide

S3  S1 

6: (E)‐2

ΔG_Hyde =   

‐(2‐Aminoe

−39 kJ/mol 

S4  S2 

thyl)‐5‐(die

S1'  

ethylamino)‐

‐N'‐(2‐(2‐fluuorophenyl)

)ethylidene)

S2' 

S

)benzohydra

S3  S1 

azide

7: (E)‐2

ΔG_Hyde =   

S

‐(2‐(2‐Amin

−19 kJ/mol 

S4  S2 

noethyl)‐5‐(

S1'   

diethylamin

no)phenyl)‐NN'‐(2‐fluoro

S2

obenzylidene

'

S3 

e)acetohydr

S1 

razide

8: (E)‐2 drazide

ΔG_Hyde =   

S

‐(2‐(2‐Amin

−17 kJ/mol 

S4  S2 

noethyl)‐5‐(

S1'   

diethylamin

no)phenyl)‐NN'‐(2‐(2‐flu

S2

orophenyl)e

' 

S3 

ethylidene)a

S1 

acetohy

Synthe

The  plan obtained and  S2).

Library d

Scheme S1 with a box night; rt: r

esis

nned  and  att d starting ma   Since  not  a design). 

1: The used syn x; target compo room temperat

tempted  syn aterials are s all  desired  co

nthetic routes f ounds are in b ure; quant.: qu

nthetic  route surrounded w ompounds  c

or the fluoroph lue; failed reac antitative. 

es  are  depic with a box, a could  be  obt

henyl compoun ctions are show

cted  in  the  f and target co

tained,  a  dif

ds. Commercia wn with a red, c

ollowing  sch ompounds ar ferent  librar

lly obtained co crossed arrow. 

hemes.  Com re in blue (Sc ry  was  desig

ompounds are s  Abbreviations

mercially  cheme S1  gned  (see 

surrounded  : o.n.: over 

Scheme S2 obtained  c crossed ar

2: The used syn compounds  are rrow. Abbreviat

nthetic routes f e  surrounded  w tions: o.n.: over

for the 2‐(2‐am with  a  box;  tar r night; rt: room

minoethyl)‐5‐(di rget  compound m temperature.

ethylamino)be ds  are  in  blue; 

. 

nzohydrazide c failed  reaction

compounds. Co ns  are  shown  w

mmercially  with  a  red, 

Methyl 2 N‐Iodosu in  dry  m stirred  i heptane mixture  saturate solvent i 7.94 (td, δ= −109.

2‐fluoroben uccinimide (1 methanol  (25

n  the  dark  e). Upon com

was  extrac ed  aqueous 

in vacuo yiel , 1H), 7.56 –  .50 – −109.7

nzoate (29)^[3 1.4 g, 6.22 m 5  mL),  and  2 for  2.5  h,  a mpletion, wat cted  with  50 NaCl  solutio ded 29 as a  7.46 (m, 1H 4 (m, 1F). 

32]

mmol, 2.4 eq 28  (0.41  mL, 

and  the  rea ter (16 mL) a 0%  ether  in on,  dried  ov yellow liquid ), 7.20 (td, 1

) and dried K   0.32  g,  2.5 action  was  f

and sodium  n  pentane  (4 ver  magnesiu d (0.44 g, 2.8 H), 7.14 (ddd

K₂CO₃ (1 g, 7 6  mmol,  1  e followed  by  thiosulfate ( 4  ×).  The  o um  sulfate  a 85 mmol, 75 d, 1H), 3.93 

.24 mmol, 2.

eq)  was  adde TLC  (SiO₂;  (1.6 g) were 

rganic  phas and  filtered.

5%). ¹H‐NMR (s, 3H). ¹⁹F‐N

.8 eq) were  ed.  The  mix 20%  ethylac added. The  se  was  wash

.  Evaporatio R(400 MHz, C NMR(376 MH

dissolved  xture  was  cetate  in  resulting  hed  with  on  of  the  CDCl₃): δ= 

Hz, CDCl₃) 

2‐Fluoro 29 (0.4 g Upon ad the reac (aq) wer and  the filtration 2.13 mm 6.84 (td,

obenzohydr g, 2.60 mmo ddition of hyd ction with TL

re added and e  resulting  m n,  and  the  s mol, 82.5%) a

, 1H), 6.79 – 

razide (30)^[1 l, 1 eq) was d drazine the s LC (SiO₂; 30%

d the metha mixture  was olvent  was  as a bright or

6.69 (m, 1H)

19]

dissolved in  solution disc

% ethylacetat nol was rem s  sonicated. 

removed  fro range solid. ¹ ), 2.12 (p, 2H

methanol (1 colored. The  te in heptan moved in vac Compound om  the  resu

1H‐NMR(400 H). ¹⁹F‐NMR(3

1.7 mL) and N solution was e). Upon co cuo. 1.25 M e ds  that  did 

lting  solutio 0MHz, CDCl₃) 376 MHz, CD

N₂H₄∙H₂O (1.0 s refluxed fo mpletion a f ethanolic HC

not  dissolve n  in  vacuo  y ): δ= 7.39 (td DCl₃): δ= −106

05 g, 21 mm or 6 h whilst f few drops of Cl (15 mL) w e  were  rem

yielding  30  d, 1H), 7.12 (

6.54 (p, 1F). 

mol, 8 eq). 

following  f 2 M HCl  as added  moved  by  (329  mg,  (tdd, 1H), 

Methyl 2 31 (1 g,  with a se left  to  s heptane amount  3H),  3.5 121.56, 

2‐(2‐fluorop 6.49 mmol,  eptum and a stir  overnigh e).  Upon  com

of pure 32. 

8  (s,  2H). ¹³ 121.40, 115.

phenyl)aceta 1 eq) was d acetyl chlorid

t  after  whic mpletion  th

1H‐NMR(40

3C‐NMR(101 .64, 115.43, 5

ate (32)^* dissolved in d

de (2.5 mL,  ch  the  conve

e  solvent  w 0 MHz, CDC   MHz,  CDCl 52.31, 34.44

dry methano 35.16 mmol ersion  was  c was  evapora Cl3): δ= 7.21 

l3):  δ=  171.2 4. ¹⁹F‐NMR(3

ol (30 mL) in , 5.4 eq) wa checked  with ated  in  vacu

– 7.12 (m, 2 28,  162.41,

76 MHz, CDC

n a round‐bo s added slow h  TLC  (SiO₂;  uo  which  yie

2H), 7.05  – 6 159.96,  131 Cl₃): δ= −117

ottom flask e wly. The mix

20%  ethyla elded  a  qua 6.90 (m, 2H) 1.57,  129.22 7.21 – −117.4

equipped  xture was  cetate  in  antitative  ), 3.61 (s,  ,  124.26,  46 (m).