immunodiagnosis and correlates of protection
Leyten, E.M.S.
Citation
Leyten, E. M. S. (2008, October 8). Cellular Immune responses during latent tuberculosis : immunodiagnosis and correlates of protection. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/13137
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/13137
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Chapter 10 ALGEMENE INLEIDING
Tuberculose (TB) is een besmettelijk infectieziekte en wordt veroorzaakt door het ina- demen van kleine druppeltjes die Mycobacterium tuberculosis bevatten, afkomstig van hoestende of niezende TB patiënten. De meest voorkomende uitingsvorm van TB is een (chronische) longontsteking, gepaard gaande met een aanhoudende productieve hoest, soms met het opgeven van bloederig slijm en vaak met koorts, nachtelijk transpireren en gewichtsverlies. Op de longfoto worden afwijkingen gezien passend bij een longontstek- ing, soms gaat deze gepaard met holtevorming. M. tuberculosis kan zich vanuit de longen verspreiden en praktisch overal in het lichaam ontstekingen veroorzaken; bijvoorbeeld in de lymfeklieren, de rugwervels en de buik. TB komt wereldwijd nog steeds veel voor, met jaarlijks ongeveer 9 miljoen nieuwe gevallen van actieve TB. In Nederland wordt TB jaarlijks bij ongeveer 1200 mensen vastgesteld. Ondanks het feit dat al ruim 50 jaar ef- fectieve medicijnen tegen TB beschikbaar zijn, overlijden er nog iedere minuut 3 mensen aan TB. Een overzicht van de belangrijkste ontdekkingen op het gebied van TB is terug te vinden in tabel 1 van hoofdstuk 1.
Na een besmetting met M. tuberculosis, die doorgaans zonder symptomen verloopt, blijven bij de meeste mensen de mycobacteriën ongemerkt aanwezig (‘besmet, maar niet ziek’). De ziekte TB ontwikkelt zich bij ongeveer 10% van de besmette individuen.
Meestal ontstaat TB binnen enkele jaren na de besmetting, maar de ziekte kan zich in sommige gevallen pas na tientallen jaren openbaren. Wanneer personen besmet zijn met M. tuberculosis maar niet, of nog niet, ziek zijn spreekt men van een latente tuberculose infectie.
Sinds de term “latente tuberculose” voor het eerst werd geïntroduceerd door Von Pir- quet in 1909, zijn latente infecties met M. tuberculosis grotendeels een goed bewaard geheim gebleven. Zo is niet precies bekend waar de mycobacteriën zich schuil houden in het lichaam tijdens een latente infectie. Ook was er tot voor kort maar weinig bekend over de veranderingen die M. tuberculosis ondergaat om zo lang te kunnen overleven in de mens, en welke afweer precies in rol speel bij het onder controle houden van de infectie en het voorkomen van reactivatie. In de afgelopen eeuw was de tuberculine huidtest (tu- berculin skin test, afgekort TST), ook wel Mantoux test genoemd, de enige beschikbare methode om een latente tuberculose infectie te kunnen vaststellen, terwijl deze test vele beperkingen heeft.
Naar schatting heeft 1 op de 3 mensen wereldwijd een latente tuberculose infectie; dit komt overeen met 2 miljard mensen. Uit dit enorme reservoir van latente infecties zullen vele nieuwe gevallen van actieve TB voortkomen. Bovendien zal het aantal nieuwe geval- len van TB dat uit dit reservoir voortkomt verder toenemen door de HIV pandemie. Dit komt doordat het risico op reactivatie van de ziekte bij HIV-geïnfecteerde individuen erg hoog is; ongeveer 8-10% per jaar.
Het voorkomen van latente tuberculose infecties vormt een belangrijke verklaring voor het beperkte succes van de wereldwijde TB preventie programma’s die zich tot op heden voornamelijk gericht hebben op vroege opsporing en adequate behandeling van actieve TB. In principe is het mogelijk om een latente infectie te behandelen en zo het ontwikkelen van TB te voorkómen, maar deze preventieve behandeling met isoniazide (INH) moet langdurig, tenminste 6 maanden, volgehouden worden en kan ernstige bi- jwerkingen hebben. Bovendien zal zonder preventieve INH behandeling maar een klein gedeelte van de mensen met een latente infectie uiteindelijk ziek zal worden; je zult dus veel personen met latente TB moet behandelen om 1 geval van TB te voorkomen. Zo- lang er geen betrouwbare test beschikbaar is, is opsporing en behandeling van latente infectie in veel omstandigheden niet haalbaar. Het beschikbare vaccin tegen TB, M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) beschermt tegen ernstige vormen van TB bij kinderen, maar biedt slechts beperkte bescherming tegen TB op volwassen leeftijd. Evenmin kan door vaccinatie met BCG worden voorkomen dat een latente infectie ontstaat of dat TB ontwikkelt ten gevolge van reactivatie van een latente infectie.
Om de TB epidemie te kunnen keren is er behoefte aan nieuwe strategieën waarmee voorkomen kan worden dat een latente infectie reactiveert en actieve TB ontstaat. Dit zou enerzijds bereikt kunnen worden door betrouwbare diagnostiek voor het vaststellen van latente tuberculose infectie, om daarmee latent geïnfecteerde personen gericht te kun- nen behandelen. Anderzijds kan een nieuw vaccin dat veilig is voor latent geïnfecteerde personen en reactivatie van TB kan voorkomen, een belangrijke bijdrage leveren aan het terugdringen van het aantal nieuwe gevallen van TB.
De onderzoeken in dit proefschrift richten zich op de cellulaire afweer tegen mycobacte- riën zoals die aanwezig is bij mensen met een latente infectie met M. tuberculosis, met het doel de diagnostiek van latente tuberculose infectie te verbeteren en inzicht te verkrijgen in de specifieke cellulaire afweer die een rol speelt bij het voorkómen van actieve TB.
DIAGNOSTIEK VAN LATENTE TUBERCULOSE INFECTIES
Bij patiënten met actieve TB kan de aanwezigheid van M. tuberculosis, bij voorbeeld in het sputum, in veel gevallen aangetoond worden door middel van kweek. Aangezien het kweken van M. tuberculosis geduld vraagt en 6 weken in beslag kan nemen, kan ook geprobeerd worden de mycobacteriën direct aan te tonen met behulp van microscopie en speciale technieken om de bacteriën te kleuren (Ziehl-Neelsen (ZN) kleuring). Helaas slaagt men er in veel gevallen niet in mycobacteriën aan te tonen terwijl er later toch sprake blijkt van TB infectie, m.a.w., de diagnose TB kan niet uitgesloten worden als de eerste diagnostiek negatief uitvalt.
Chapter 10 Het vaststellen van een latente tuberculose infectie wordt gecompliceerd door het feit
dat mycobacteriën zelden direct kunnen aangetoond worden. Immers, het betreft meestal gezonde individuen die geen klinische symptomen van een ontstekingshaard hebben. Tot op heden is het niet precies bekend waar en in welke toestand de mycobacteriën precies verblijven tijdens een latente infectie. Zo kunnen er bij een lijkschouwing oude ontstek- ingshaarden (granulomen) in het longweefsel of lymfeklieren aangetroffen worden die wijzen op de aanwezigheid van een M. tuberculosis infectie, maar de bacteriën zelf zijn meestal niet aan te tonen. Dat er in deze granulomen wel levensvatbare mycobacteriën aanwezig kunnen zijn, werd aangetoond door granulomateus-veranderd weefsel aan proefdieren toe te dienen: deze kregen daarop soms TB. Omdat het al zeer ingewikkeld is om M. tuberculosis aan te tonen in weefselgranulomen verkregen uit overleden patiënten, laat staan vast te stellen bij levenden, heeft men gezocht naar andere methoden om een latente TB infectie te diagnostiseren, indirect door vast te stellen dat een individu een specifieke afweerreactie heeft opgebouwd tegen M. tuberculosis. Op dit principe is de TST gebaseerd die door Von Pirquet in 1907 werd ontwikkeld voor de diagnostiek van TB (zie tabel 1 van hoofdstuk 1). Bij deze methode wordt een kleine hoeveelheid tuberculine (een niet-infectieus extract van M. tuberculosis) in de huid gespoten. Als iemand in het verleden in contact is geweest met M. tuberculosis (‘besmet, maar niet ziek’), zal er een specifieke afweer tegen mycobacteriën zijn opgebouwd, en zullen specifieke T cellen het tuberculine herkenen en een ontstekingsreactie op gang brengen. Als bewijs van deze afweerreactie ontstaat 48 tot 72 uur na de injectie van tuberculine een ontstekingsinfil- traat (‘bultje’) op de injectieplaats. In 1909 werd door Von Pirquet voor het eerst de term latente tuberculose geïntroduceerd, toen hij ontdekte dat sommige kinderen zonder tek- enen van actieve TB toch een positieve TST reactie hadden. Een deel van deze kinderen ontwikkelde later TB.
De TST kent vele beperkingen. Ten eerste is de gevoeligheid van de TST beperkt, voor- namelijk wanneer er sprake is van een verminderde afweer door gebruik van afweeron- derdrukkende geneesmiddelen of onderliggende ziekte zoals HIV. Verder kan de TST ook negatief zijn wanneer individuen een uitgebreide vorm van TB hebben. Het belangrijkste bezwaar van de TST is dat de test niet specifiek is voor M. tuberculosis. De TST is vaak fout-positief bij mensen die zijn ingeënt met BCG, het enige beschikbare en algemeen toegepaste vaccin tegen TB. Hierdoor is de TST niet geschikt voor het vaststellen van een latente tuberculose infectie bij BCG gevaccineerde personen, terwijl zij wel risico lopen op het ontwikkelen van TB omdat BCG maar in geringe mate beschermt tegen TB. De TST kan ook positief worden door contact met andere, minder pathogene mycobacteriën die overal in de natuur kunnen voorkomen. Contact met deze zo genoemde omgevings- mycobacteriën komt vaak voor in landen waar TB endemisch is.
In de afgelopen jaren zijn er bloedtesten ontwikkeld voor de diagnostiek van M. tu- berculosis infectie, die net als de TST, berusten op het aantonen van een afweerreactie
tegen M. tuberculosis. De bloedtesten zijn gebaseerd op het incuberen van mononu- cleaire cellen (witte bloedcellen) in aanwezigheid van eiwitten van M. tuberculosis. Als er M. tuberculosis-specifieke T-cellen in het bloed aanwezig zijn zullen deze cellen de eiwitten herkennen en de signaalstof interferon-gamma (IFN-γ) produceren (tabel 1).
Naar dit soort bloedtesten wordt verwezen als “IFN-γ release assays” (IGRA). Initieel werd bij deze nieuwe bloedtesten gebruik gemaakt van purified protein derivative (PPD), het extract van M. tuberculosis dat tegenwoordig wordt gebruikt voor de TST. PPD bevat vele stukjes eiwit die ook aanwezig zijn in andere mycobacteriën, zoals in BCG en in omgevings-mycobacteriën. Deze “gemeenschappelijke” mycobacteriële eiwitten zullen dus ook herkend kunnen worden door personen die een afweer hebben opgebouwd tegen BCG na vaccinatie of na contact met omgevings-mycobacteriën. Deze herkenning leidt dan tot productie van IFN-γ met als gevolg een fout-positieve bloedtest, immers van expositie aan M. tuberculosis is geen sprake. Om dit probleem te omzeilen kan gebruik gemaakt worden van eiwitten die wel in M. tuberculosis, maar niet in BCG of omgev- ingsmycobacteriën aanwezig zijn. In de afgelopen jaren zijn na uitgebreid onderzoek ei- witten van M. tuberculosis ontdekt die specifiek lijken voor de tuberkelbacil en bovendien goed herkend worden door T cellen. De eerste onderzoeken geven aan dat bloedtesten die gebaseerd zijn op deze eiwitten, ESAT-6 en CFP-10, inderdaad specifiek zijn voor de diagnostiek van M. tuberculosis infecties.
De recente ontdekking en ontwikkeling van nieuwe M. tuberculosis-specifieke bloedtesten is een belangrijke stap voorwaarts in het gevecht tegen TB. De onderzoeken beschreven in het eerste deel van dit proefschrift dragen bij aan de verdere ontwikkeling van deze testen en verschaffen inzicht in de praktische toepasbaarheid van deze testen ten behoeve van diagnostiek van latente TB infecties.
De onderzoeken die worden beschreven in hoofdstuk 2 en 3 zijn uitgevoerd om de sen- sitiviteit van de nieuwe bloedtesten te optimaliseren. Idealiter heeft een diagnostische test voor latente TB niet alleen een hoge specificiteit maar ook een hoge sensitiviteit.
Immers een fout-negatieve testuitslag heeft tot gevolg dat behandeling van latente infectie achterwege zal blijven en het risico op het ontwikkelen van actieve TB blijft bestaan.
Alhoewel de nieuwe bloedtesten op basis van ESAT-6 en CFP-10 zeer specifiek zijn voor TB zou de gevoeligheid van deze testen verder verbeterd kunnen worden door andere M. tuberculosis specifieke eiwitten toe te voegen. Nadat enkele jaren geleden de complete genetische code van zowel M. tuberculosis als M. bovis BCG bekend is geworden, werd het mogelijk om deze genetische codes met elkaar te vergelijken. Hieruit is gebleken dat er nog meer stukjes van het genoom van M. tuberculosis ontbreken in dat van BCG. In het onderzoek beschreven in hoofdstuk 2 hebben we de bruikbaarheid getest van vier verschillende eiwitten van M. tuberculosis, die worden gecodeerd op stukjes genoom
Chapter 10 welke in BCG niet aanwezig zijn, voor de diagnostiek van infecties met M. tuberculosis.
Uit de resultaten kwam naar voren dat een aantal peptides (korte stukjes van een eiwit) van drie van zulke eiwitten toch werden herkend door T-cellen uit het bloed van BCG- gevaccineerde personen die hoogstwaarschijnlijk niet besmet waren met M. tuberculosis.
Door alle peptide van de eiwitten afzonderlijk te testen, kon uiteindelijk een combinatie van peptiden worden samengesteld die herkend werd door 57% van de geteste TB patiënten maar niet door BCG- gevaccineerde individuen. Uit de resultaten kwam verder nog naar voren dat het toevoegen van deze nieuwe cocktail van M. tuberculosis-specifieke peptiden aan ESAT-6 and CFP-10 leidde tot een verbetering in de sensitiviteit tot 90%
met behoud van een hoge specificiteit van 95%. Een van de peptiden uit dit onderzoek (TB7.7, p4) wordt inmiddels gebruikt in de meest recente versie van een commercieel verkrijgbare bloedtest (QFT-GIT). De toevoeging van dit nieuwe peptide aan ESAT-6 en CFP-10 heeft geleid tot een verbetering van de sensitiviteit van deze test. Verder zou de nieuw geïdentificeerde, M. tuberculosis-specifieke peptiden-cocktail in de toekomst goed van pas kunnen komen voor de diagnostiek van latente TB, bijvoorbeeld in het geval dat toekomstige TB vaccins ESAT-6 zouden bevatten zodat dit eiwit niet langer bruikbaar is voor diagnostische doeleinden.
Tabel 1. BLOEDTESTEN VOOR DE DIAGNOSTIEK VAN M.TUBERCULOSIS INFECTIES.
1. 6-daagse lymfocyten stimulatie test (6-daagse LST)
- Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit volbloed.
- PBMC worden geincubeerd bij 37°C met M. tuberculosis-specifieke eiwitten.
- Duur van incubatie: 6 dagen.
- In de kweekvloeistof wordt de door geactiveerde T-cellen geproduceerde IFN-γ gemeten.
- IFN-γ concentratie wordt gemeten met behulp van een ELISA test.
2. IFN-γ- enzym-linked immunospot (ELISPOT) test - Isolatie van PBMC uit volbloed.
- PBMC worden geincubeerd bij 37°C met M. tuberculosis-specifieke eiwitten
- Incubatie in welletjes met een speciale bodem waarop IFN-γ antilichamen zijn vastgezet.
- Duur van incubatie: 16-20 uur.
- IFN-γ dat geproduceerd wordt door T-cellen hecht direct aan antilichamen op de bodem.
- Iedere IFN-γ producerende T-cel wordt zichtbaar gemaakt als gekleurd stipje op de bodem.
- Er kan één specifieke T-cel aangetoond worden tussen 250.000 witte bloedcellen.
> b.v “de T-SPOT™.TB test”
3. Volbloed IFN-γ release assay (IGRA)
- Volbloed wordt geincubeerd bij 37°C met M. tuberculosis-specifieke eiwitten.
- Duur van incubatie: 24 uur.
- Na incubatie wordt volbloed afgedraaid.
- IFN-γ concentratie wordt gemeten in het serum met behulp van een ELISA test.
> b.v. QuantiFERON®-TB Gold (QFT-G) obv ESAT-6 en CFP-10 en
QFT-G in tube (QFT-GIT): bloed-afname-buisje met ESAT-6, CFP-10 en TB7.7 (p4)
In hoofdstuk 3 hebben we de toepasbaarheid onderzocht van een nieuwe M. tuberculosis- specifieke bloedtest om besmetting vast te stellen onder personeel van een microbiolo- gisch laboratorium. In dat laboratorium was een ongeval gebeurd (een kweekbuis vol met mycobacteriën was op de grond kapot gevallen) waarbij de medewerkers waarschijnlijk blootgesteld waren aan M. tuberculosis. Personeel dat werkt in een microbiologisch labo- ratroium is vrijwel altijd met BCG gevaccineerd, zodat de TST niet geschikt was voor screening van het personeel. In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van een IFN-γ- ELISPOT test (zie tabel 1) gebaseerd op de twee meest belovende peptide-mixen uit het onderzoek beschreven in hoofdstuk 2, t.w., TB7.7 and TB37.6 (p2-6), in combinatie met ESAT-6 and CFP-10. Uit het onderzoek bleek dat twee van de negen laboranten een sterk positieve reactie op ESAT-6 en CFP-10 ELISPOT hadden. Juist deze laboranten waren het nauwst betrokken geweest bij het ongeluk met de kweekbuis. Een van hen had ook een positieve TST terwijl hij een jaar eerder nog negatief was getest, het beste bewijs voor een recente expositie aan M. tuberculosis. De peptide mix van TB37.6 (p2-6) werd uit- sluitend herkend door T-cellen van deze twee laboranten. Andere laboranten en controle personen met een positieve TST of behandelde TB patiënten herkenden TB37.6 niet, terwijl zij wel een positief ESAT-6 en CFP-10 ELISPOT resultaat hadden. Verder bleek dat een jaar nadat de twee laboranten besmet geraakt waren, de ELISPOT response tegen TB37.6 negatief was geworden terwijl de response tegen ESAT-6 en CFP-10 onveranderd positief bleef. Een mogelijke (en optimistische) verklaring is dat een ELISPOT response tegen TB37.6 specifiek is voor recente besmetting met M. tuberculosis, en snel daarop weer negatief wordt.
Dit onderzoek illustreert het nut van een ELISPOT gebaseerd op ESAT-6, CFP-10 en de peptiden 2-6 van TB37.6 voor het aantonen van recent verworven latente infectie, in het bijzonder wanneer veel van de te onderzoeken personen ingeënt zijn met BCG of mogelijk reeds eerder aan mycobacteriën waren blootgesteld.
De onderzoeken die beschreven zijn in hoofdstuk 4 tot en met 6 evalueren de bruik- baarheid van nieuwe bloedtesten (korte-kweek-IGRA) voor de diagnostiek van latente TB in de dagelijkse praktijk. Rond 2005 werden er twee M. tuberculosis-specifieke IGRAs op de markt gebracht, de Quantiferon-TB gold in-tube (QFT-GIT), een vol-bloed test, en de T-SPOT.TB, een ELISPOT test (tabel 1). In een nieuwe Engelse TB richtlijn werd een twee-stappen strategie geadviseerd waarbij de eerste screening plaatsvindt met een TST gevolgd door een IGRA in het geval van een positieve TST. Op dat moment was het echter niet bekend of dit een betrouwbare strategie is. Bijvoorbeeld, van herhaalde TST testen is bekend dat het toedienen van tuberculine voor een TST de immuunreactie (afweerreactie) kan versterken en zo kan leiden tot een toename van de huidreactie bij een volgende TST. Daarom zijn in hoofdstuk 4 nagegaan of een TST voorafgaande aan een IGRA, de immuunreactie tegen M. tuberculosis-specifieke eiwitten in vitro versterkt
Chapter 10 en zo de uitslag van een eventuele latere IGRA kan beïnvloeden. Bij 66 vrijwilligers (TST
negatieve controles, aan TB blootgestelde, TST positieve personen, en enkele behan- delde TB patiënten) werd bloed afgenomen voor QFT-GIT en werd direct hierna een TST gedaan. Vervolgens werd op de dag 3e dag, bij het aflezen van de TST, de QFT-GIT herhaald.
Uit analyse van de data kwam naar voren dat de TST de uitslag van de QFT-GIT niet significant beïnvloedde. In een enkel geval leek de TST een reeds positieve QFT-GIT reactie te kunnen versterken, met name wanneer het interval tussen de TST en de QFT- GIT langer was dan 3 dagen. Deze observatie werd in ander onderzoek bevestigd. Men kan concluderen dat, wanneer de IGRA wordt afgenomen op de dag van aflezen van de TST, een 2-stappen strategie, met een TST gevolgd door een IGRA, de specificiteit van de IGRA niet nadelig beïnvloedt.
Hoofdstuk 5 beschrijft onderzoek dat door ons werd uitgevoerd tijdens een grootschalig screening op latente TB onder klanten van een supermarkt. De reden was dat een medewerker van deze supermarkt een zeer besmettelijke, open TB had opgelopen, en klanten had aangehoest. Tijdens dit onderzoek werden de commerciële IGRA, de T-SPOT™.TB en de QFT-GIT, voor het eerst met elkaar, en met de TST, vergeleken in een groot contactonderzoek bij mensen zonder BCG vaccinatie. In het totaal werd bij 15.515 klanten een TST verricht. De QFT-GIT en de T-SPOT.TB werden verricht bij 785 supermarkt klanten. 469 personen werden ongeselecteerd gerekruteerd op de dag waarop de TST geplaatst werd en op de dag waarop de TST werd afgelezen werden nog eens 316 personen gerekruteerd uit de groep personen met een TST uitslag van > 0 mm. Aangezien er voor de diagnose latente TB geen gouden standaard test bestaat waarmee je een nieuwe test kunt vergelijken is het niet eenvoudig de sensitiviteit en de specificiteit van de nieuwe IGRA testen te berekenen. Als alternatieve benadering zijn we de correlatie nagegaan tussen de testuitslag en de mate van blootstelling aan M. tuberculosis, door het berek- enen van het totaal aantal gewinkelde uren in de periode dat de persoon met open TB werkzaam was geweest in de supermarkt. Een positief IGRA resultaat, vooral die van de QFT-GIT, was significant geassocieerd met de cumulatieve winkeltijd, terwijl een positief TST voornamelijk was geassocieerd met een oudere leeftijd. De uitslagen van de twee IGRA bleken zeer goed met elkaar overeen te komen. Een opmerkelijke en onverwachte bevinding was dat bij mensen met een TST ≥ 15 mm de QFT-GIT en T-SPOT.TB slechts in respectievelijk 42% en 51% positief waren. Aangezien het hier ging om mensen zonder BCG vaccinatie, kon deze discrepantie tussen de TST en de twee IGRA niet worden toegeschreven aan een fout positieve TST door kruisreactiviteit ten gevolge van BCG.
Uit dit onderzoek kan enerzijds geconcludeerd worden dat IGRAs beter lijken te correleren aan de mate van blootstelling aan TB dan de TST, en anderzijds dat de TST test ’gevoeliger’ lijkt voor het aantonen van een latente infectie dan IGRA. Aan de hand
hiervan hebben we de volgende hypothese opgesteld: met behulp van de TST kunnen de meeste latente infecties worden aangetoond, ook die welke in het verre verleden werden opgelopen (wanneer de TST éénmaal positief is blijft dit meestal levenslang zo), terwijl de QFT-GIT and T-SPOT.TB voornamelijk recent verworven latente TB infecties aan- tonen.
Om deze hypothese te testen hebben we in hoofdstuk 6 twee korte-kweek IGRAs, de QFT-GIT en een huisgemaakte IFN-γ-ELISPOT vergeleken met een “klassieke” 6-daagse lymfocyten stimulatie test (LST) en met de TST voor de diagnostiek van latente TB (tabel 1). Voor alle drie de IGRA werd gebruik gemaakt van de zelfde M. tuberculosis-specifieke peptiden (ESAT-6, CFP-10 and TB7.7). Bij TST positieve personen met een TB contact in het verleden was de 6-daagse LST significant vaker positief (92%; P<.01) dan zowel de QFT-GIT (33%) als de ELISPOT (46%). De QFT-GIT en de ELISPOT kwamen goed met elkaar overeen, maar er was een opvallende discrepantie tussen de uitslagen van deze twee korte-kweek IGRA enerzijds en de 6-daagse LST en de TST anderzijds. Dit opmerkelijke verschil in test uitslag, dat voornamelijk bestaat uit een negatieve QFT-GIT en ELISPOT bij positieve LST, is meest waarschijnlijk terug te voeren op het verschil in de duur van de kweek en daarmee met het soort T cellen dat kan reageren. Zo is uit heel andere onderzoeken gebleken dat “effector T cellen”, die vooral aanwezig zijn tijdens en kort na een actieve infectie, binnen 24 uur een eiwit kunnen herkenen en IFN-γ kun- nen produceren, terwijl geheugencellen ofwel “central memory T cellen”, die langdurig aanwezig blijven na het verdwijnen van de infectie, meer tijd nodig hebben om IFN-γ te kunnen produceren.
Op basis van deze bevindingen is het dan ook aannemelijk om te veronderstellen dat kort-kweek IGRAs, zoals de QFT-GIT en de ELISPOT, met name effector T cellen detec- teren die circuleren bij recente of chronische actieve infecties met M. tuberculosis, terwijl IGRA met een langere kweek duur, net als de TST, in staat zijn om ook geheugen cellen te detecteren en hierdoor dus gevoeliger zijn voor het aantonen van latente infectie die langer geleden werd opgelopen.
De patiëntencasus in hoofdstuk 7 beschrijft een 24 jarige jonge man die tijdens be- handeling met anti-TNF-α (voor de ziekte van Crohn) TB ontwikkelde nadat hij was blootgesteld aan M. tuberculosis door een collega met open TB. Aangezien anti-TNF-α behandeling een sterk verhoogd risico geeft op het ontwikkelen van actieve TB, is ac- curate diagnostiek van latente M. tuberculosis infecties in deze situatie van groot belang.
De beschreven casus illustreert een aantal belangrijke valkuilen rondom de diagnostiek van M. tuberculosis infecties bij personen met een verminderde afweer ten gevolge van anti-TNF-α behandeling. Ten eerste kan bij deze groep patiënten de presentatie van TB atypisch zijn en kunnen gebruikelijke symptomen van de ziekten ontbreken. Dit werd
Chapter 10 geïllustreerd in het feit dat de beschreven patiënt een normale longfoto had terwijl hij
uiteindelijk wel een kweek positieve long-TB bleek te hebben. Ten tweede laat deze patiëntencasus zien dat IGRAs kunnen bijdrage aan het vaststellen van recente M. tuber- culosis infectie zelfs bij patiënten met een verminderde afweer, aangezien in dit geval de QFT-GIT sterk positieve was terwijl zowel de TST als de directe kleuring en PCR voor M. tuberculosis van de longspoeling negatief waren. Ten derde demonstreert deze casus dat TNF-α antagonisten niet alleen een verhoogd risico geven op reactivatie van een latente infectie, maar ook op het ontwikkelen van primaire TB direct na blootstelling aan iemand met open TB. Ten slotte laat deze casus ook zien dat het stoppen van de TNF-α antagonisten en gelijktijdig behandeling met tuberculostatica, kan leiden tot een toename van ziekte verschijnselen. Dit fenomeen is vergelijkbaar met het immuunreconstitutie syndroom zoals we dat kennen bij HIV-geïnfecteerde personen met TB na het starten van behandeling tegen het HIV virus. Het door de HIV-behandeling geïndiceerde herstel van de afweer leidt tot intensivering van een ontstekingsreactie tegen de mycobacteriën, zodat de patiënt paradoxaal genoeg aanvankelijk zieker wordt alvorens te herstellen.
CELLULAIRE IMMUNITEIT TIJDENS LATENTE INFECTIE
In tegenstelling tot de meeste bacteriën, kiezen mycobacteriën een niche binnen cellen, in het bijzonder macrofagen. Macrofagen zijn afweercellen die normaliter in staat zijn om bacteriën op te nemen en vervolgens te doden. Echter, M. tuberculosis kan overleven en zelfs uitgroeien in macrofagen. Met behulp van specifieke T cellen en IFN-γ, dat gepro- duceerd wordt door geactiveerde T cellen, worden macrofagen aangezet tot verhoogde microbicide activiteit en kunnen zo mycobacteriën toch doden of tenminste onderdruk- ken in hun uitgroei. Uit onderzoek is gebleken dat T cellen (CD4 en CD8 cellen) en IFN-γ een centrale rol spelen in de afweer tegen M. tuberculosis. De meeste individuen met latente tuberculose infectie hebben na de primaire infectie een natuurlijke immu- niteit ontwikkeld tegen M. tuberculosis, en de meerderheid zal geen actieve TB krijgen.
De onderzoeken die worden beschreven in hoofdstuk 8 en 9 zijn erop gericht om een beter inzicht te verkrijgen in de cellulaire afweer tegen M. tuberculosis zoals die aanwezig is bij deze gezonde latent geïnfecteerde personen.
Aangezien het niet bekend is exact waar M. tuberculosis zich bevindt in het lichaam tijdens een latente infectie, is de bacterie onder deze omstandigheden moeilijk te onder- zoeken. Daarom zijn er laboratorium modellen ontwikkeld waarin de omstandigheden waaronder M. tuberculosis zich waarschijnlijk bevindt tijdens een latente infectie zo goed mogelijk worden nagebootst. Hieruit is gebleken dat onder invloed van onder andere zuurstof tekort M. tuberculosis veranderingen ondergaat waarbij specifieke eiwitten
aangemaakt worden en de mycobacteriën uiteindelijk stoppen met delen en metabool goeddeels in ruste gaan. Deze “slapende” fase van M. tuberculosis is reversibel; onder inv- loed van verandering in omgevingsfactoren, zoals de zuurstofspanning in het granuloom, zal de bacterie weer metabool actief worden en gaan uitgroeien. Door het gedrag van M. tuberculosis in dergelijke in vitro “latentie modellen” te bestuderen, is onder andere gebleken dat tijdens de “slapende fase” van M. tuberculosis er een toegenomen productie is van het 16kDa-α-crystallin eiwit (Rv2031c).
In hoofdstuk 8 wordt de specifieke T cel reactiviteit gemeten tegen dit “latentie eiwit”
α-crystallin en tegen ESAT-6, een eiwit dat geproduceerd wordt tijdens de groeifase van M. tuberculosis. Hiervoor werd bloed afgenomen bij TB patiënten, huisgenoten van TB patiënten, personen met een bekend TB contact in het verleden, en bij gezonde vrijwil- ligers. De deelnemers waren afkomstig uit Nederland, Ethiopië of de Gambia, de laatste twee zijn landen waar TB endemisch is. Uit de resultaten van ELISPOT gebaseerd op α-crystallin is gebleken dat dit eiwit vaak wordt herkend door T cellen van mensen met een latente TB. Met deze bevinding hebben we aannemelijk kunnen maken dat α-crystallin door M. tuberculosis wordt geproduceerd tijdens een latente infectie bij de mens. Het is klaarblijkelijk niet alleen een fenomeen dat gevonden wordt in een in vitro model in het laboratorium. Het meerdeel van onderzochte Afrikaanse vrijwilligers bleek een in het verleden verworven latente TB te hebben, en hadden vaak een positieve ESAT-6 reactie (maar waren voor zover bekend niet recent geëxposeerd geweest aan M. tuberculosis).
Deze personen met een “oude” latente TB hadden een significant hogere IFN-γ productie in reactie op α-crystallin dan TB patiënten of hun huisgenoten. Verder hebben we voor iedere persoon de verhouding berekend van de IFN-γ productie in reactie op ESAT-6 en die op α-crystallin. Uit deze analyse kwam in alle drie de cohorten (Ethiopië, de Gambia en Nederland) naar voren dat deze ratio hoog was bij patiënten met actieve TB (d.i., de re- activiteit tegen ESAT-6 domineert), terwijl bij personen met een “oude” latente infectie de verhouding laag was (d.i., de T-cel reactiviteit tegen α-crystallin domineert). Personen die recent aan M. tuberculosis waren blootgesteld maar geen klinisch-manifeste TB ontwik- keld hadden, zaten wat betreft hun T-cel profiel hier tussen in. Deze bevindingen sug- gereren dat in de verschillende fasen van infectie met M. tuberculosis, achtereenvolgens andere eiwitten van M. tuberculosis zichtbaar worden voor het immuunsysteem, hetgeen zich reflecteert in een differentieel repertoire aan M. tuberculosis-specifieke T-cellen.
Recent laboratorium onderzoek maakt duidelijk dat niet alleen het gen van α-crystallin, maar een hele groep van 48 genen, versterkt wordt afgelezen wanneer M. tuberculosis als gevolg zuurstof tekort over gaat in een “slapende fase”. De zelfde 48 genen bleken ook ver- hoogd afgeschreven te worden na blootstelling van M. tuberculosis aan lage concentraties van stikstof oxide (NO), een stof die in het lichaam geproduceerd wordt door geactiveerde macrofagen en schadelijk is voor bacteriën. Het is dan ook niet verwonderlijk dat deze
Chapter 10 genen eveneens verhoogd tot expressie gebracht worden als M. tuberculosis zich in geac-
tiveerde macrofagen bevindt. Deze set van 48 genen werd “dormancy regulon” genoemd, immers ze komt tot uiting wanneer M. tuberculosis ‘slapend’ is en zich in een omgeving bevindt die vergelijkbaar is met die tijdens latente infectie in de mens. Waarschijnlijk speelt dit dormancy regulon een rol bij de aanpassing van M. tuberculosis aan zijn in- tracellulaire niche en de mogelijkheid langdurig te kunnen overleven in de mens. Er is nog weinig bekend over de precieze functie van de eiwitten die gecodeerd worden in het dormancy regulon. Evenmin is het bekend of deze eiwitten daadwerkelijk in de mens door M. tuberculosis geproduceerd worden tijdens een latente infectie en of deze eiwitten wel immunogeen zijn (d.w.z. of ze herkend kunnen worden door T-cellen).
In hoofdstuk 9 hebben we met behulp van 6-daagse LST onderzocht of eiwitten van dit “dormancy regulon” worden herkend door T cellen. Hiervoor zijn eerst de eiwitten opgezuiverd die gecodeerd worden door de 25 genen van het dormancy regulon die het sterkst tot expressie gebracht worden. Door deze genen in een E. coli bacterie tot expressie te brengen konden de eiwitten gezuiverd worden. Uit een eerste screening bleek dat ge- kweekte T-cel lijnen met reactiviteit tegen M. tuberculosis de dormancy latentie-eiwitten inderdaad konden herkennen en in reactie IFN-γ gingen produceren. Hierna werden de latentie-eiwitten getest in een 6-daagse LST, waarbij de reactiviteit van bloedcellen afkomstig van 20 TB patiënten, 23 latent geïnfecteerde personen en 21 niet besmette con- trole personen vergeleken werd. De resultaten maakten duidelijk dat 18 van de 25 geteste latentie-eiwitten goed worden herkend door individuen met een M. tuberculosis infectie.
Hieruit blijkt dat deze eiwitten worden aangemaakt door M. tuberculosis tijdens infectie bij mensen, en dat deze eiwitten daadwerkelijk beschikbaar zijn voor herkenning door T cellen. Er konden vier latentie-eiwitten (Rv1733c, Rv2029c, Rv2627c and Rv2628) geïden- tificeerd worden die door een grote groep personen met latente TB herkend werden en leiden tot hoge IFN-γ productie. Personen met latente TB konden een breder repertoire aan latentie-eiwitten herkennen en hadden een hogere totale IFN-γ productie in reactie op deze eiwitten dan de TB patiënten. Het tegengestelde patroon werd gevonden voor het eiwit CFP-10, een eiwit dat juist veel geproduceerd wordt tijdens de actieve groeifase M. tuberculosis. Een relatief sterke IFN-γ productie in reactie op de groep van dormancy latentie-eiwitten lijkt daarmee geassocieerd met een adequate natuurlijke afweer tegen M.
tuberculosis. Mogelijk kan zo’n brede reactiviteit bijdragen aan het voorkómen van reac- tivatie van infectie. Deze hypothese houdt in dat de eiwitten van het “dormancy-regulon”, of te wel de latentie-eiwitten, kandidaten zouden kunnen zijn voor de ontwikkeling van een nieuw vaccin gericht op het voorkomen van reactivatie van TB.
CONCLUSIES
Nieuwe strategieën waarmee reactivatie van TB vanuit een latente infectie kan worden voorkomen, zullen in belangrijke mate bijdragen aan de controle over de TB epidemie en uiteindelijk het uitroeien van de ziekte. Het eerste deel van dit proefschrift richtte zich op de verdere ontwikkeling en evaluatie van de immuundiagnostiek voor latente TB met het doel om gerichte opsporing en behandeling van mensen met een latente TB infectie beter mogelijk te maken. De nieuwe bloedtesten voor de diagnostiek van M. tu- berculosis infecties (IGRAs gebaseerd op de M. tuberculosis-specifieke eiwitten ESAT-6, CFP-10 en TB7.7) hebben een zeer hoge specificiteit en zijn in dat opzicht een duidelijke verbetering ten opzichten van de oude TST. Dit geldt vooral wanneer de te onderzoeken personen ingeënt zijn met BCG. Uit de onderzoeken van dit proefschrift is naar voren gekomen dat korte-kweek IGRAs met name geschikt zijn voor screening van mensen die recent zijn blootgesteld aan TB. Zo bleek uit de resultaten van hoofdstuk 5 dat de uitkomsten deze IGRAs beter correleerden met de mate van blootstelling aan TB, als een indicator voor een recent verworven latente infectie, dan de TST, zelfs bij mensen zonder BCG vaccinatie. De suggestie dat korte-kweek IGRAs voornamelijk recente infec- ties aantonen, maakt deze testen mogelijk zeer geschikt voor opsporing en behandeling van latente TB bij mensen met een normale afweer. Dit hangt samen met het feit dat bij personen met een normale afweer het risico op het ontwikkelen van actieve TB snel minder wordt naar mate de infectie langer geleden is opgelopen. Hierdoor zou een test die voornamelijk recent verkregen infecties detecteert, het risico op ziekte beter kunnen voorspellen waardoor het aantal mensen dat behandeld moet worden om één geval van TB te voorkomen aanzienlijk kan worden verminderd. In hoofdstuk 2 en 3 zochten we nieuwe M. tuberculosis-eiwitten om de sensitiviteit van IGRA verder te kunnen verbe- teren. De aanwezigheid van een cellulaire immune response tegen een van deze nieuwe eiwitten, TB37.6, lijkt geassocieerd te zijn met een recent opgelopen M. tuberculosis infec- tie. Met dergelijke eiwitten zou dan ook mogelijk een IGRA ontwikkeld kunnen worden die uitsluitend recente infectie kan detecteren.
Een opmerkelijke nieuwe bevinding uit verschillende onderzoeken van dit proefschrift was dat de korte-kweek IGRAs niet erg gevoelig bleken te zijn voor het opsporen van een latente TB infectie die al enige tijd geleden verworven was. Ongeveer de helft van de mensen met een positieve TST die in het verleden in contact waren geweest met TB hadden een negatieve test uitslag in de korte-kweek IGRA terwijl een 6-daagse IGRA gebaseerd op de zelfde M. tuberculosis-specifieke eiwitten wel positief was. Zolang de voorspellende waarde van deze verschillende IGRAs voor het ontwikkelen van klinisch manifeste TB niet duidelijk is, moet dan ook geconcludeerd worden dat korte-kweek IGRA niet ge- schikt zijn voor het uitsluiten van een latente infectie bij mensen met een verminderde afweer, zoals HIV patiënten en mensen die behandeld worden met medicijnen die de
Chapter 10 afweer verlagen. Immers, in deze omstandigheden is het risico op reactivatie van TB sterk
verhoog, ook wanneer de latente tuberculose infectie in het verre verleden is opgelopen.
In hoofdstuk 8 en 9 werden een aantal nieuwe eiwitten geïdentificeerd die gecodeerd worden door het recent ontdekte “dormancy regulon” van M. tuberculosis en die herkend worden door mensen met een latente infectie. Het gebruik van deze latentie-eiwitten in een 6-daagse IGRA zou de diagnostiek van latente TB verder kunnen verbeteren en zou een mogelijkheid kunnen zijn om de aanwezigheid van een beschermende immune re- spons bij mensen met een normale afweer te meten, iets wat eerder nog niet mogelijk was en beschouwd kan worden als de ‘heilige graal’ van de TB diagnostiek.
Het tweede doel van dit proefschrift was gericht op de cellulaire afweer tegen M. tuber- culosis zoals die aanwezig is bij mensen die na een primaire infectie met M. tuberculosis niet ziek geworden zijn maar een natuurlijke immuniteit hebben ontwikkeld waardoor de infectie latent is gebleven. In de laatste 2 hoofdstukken hebben we de immuunreac- tie bestudeerd tegen een aantal eiwitten van het dormancy regulon van M. tuberculosis.
Deze onderzoeken laten zien dat TB patiënten en mensen met een latente TB infectie een verschillend repertoire aan M. tuberculosis-specifieke T-cellen hebben. Terwijl bij TB patiënten de immuunreactie tegen ESAT-6, CFP-10 en Ag85B (eiwitten die veel gepro- duceerd worden tijdens de actieve groei fase van M. tuberculosis) domineert, wordt bij mensen met een latente TB juist een relatief sterkere IFN-γ productie gemeten in reactie op de eiwitten van het dormancy regulon (latentie-eiwitten). De aanwezigheid van een goede cellulaire immuniteit tegen deze latentie-eiwitten lijkt dus geassocieerd te zijn met een natuurlijke bescherming tegen M. tuberculosis en draagt waarschijnlijk bij aan het voorkómen van reactivatie van de infectie. Toekomstige onderzoeken zullen moeten uitmaken of vaccins die gebaseerd zijn op deze latentie-eiwitten veilig kunnen worden toegediend aan mensen met latente TB en of het versterken van de cellulaire afweer tegen de latentie-eiwitten daadwerkelijk kan bijdragen aan het controleren van de latente infec- tie en het voorkómen van reactivatie.
Door het bestuderen van de cellulaire immuunreactie tegen M. tuberculosis tijdens latente TB heeft dit proefschrift bijgedragen aan beter inzicht in de diagnostiek van latente tuber- culose infectie en laten zien dat de aanwezigheid van een sterke cellulaire immuunreactie tegen “latentie-eiwitten” van M. tuberculosis geassocieerd lijkt te zijn met natuurlijke bescherming tegen reactivatie van TB.
