Host genes involved in Agrobacterium-mediated transformation
Soltani, J.
Citation
Soltani, J. (2009, January 14). Host genes involved in Agrobacterium-mediated transformation. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/13400
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/13400
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Nederlandse samenvatting
138
Nederlandse samenvatting
Agrobacterium tumefaciens is een bacterie die verantwoordelijk is voor tumor vorming bij planten (‘crown gall’). Bij dit proces worden plantencellen genetisch veranderd, zodat deze gaan delen en specifieke voedingsstoffen gaan maken die door de bacterie gebruikt kunnen worden. Bij dit proces speelt het Ti-plasmide van de bacterie een belangrijke rol. Dit plasmide bevat de genetische informatie voor een aantal virulentie eiwitten die het transformatie proces in gang zetten. Deze eiwitten zorgen ervoor dat een gedeelte van het Ti-plasmide, het T-DNA, wordt overgebracht naar de plantencel. Hier wordt het op een willekeurige plaats in één van de chromosomen ingebouwd. Van deze eigenschap van Agrobacterium wordt in de biotechnologie en in het plantenonderzoek veelvuldig gebruik gemaakt om planten genetisch te veranderen. De bacteriële genen die betrokken zijn bij de transformatie zijn betrekkelijk goed bekend. Daarentegen is er relatief weinig kennis van de processen die zich in de gastheercel afspelen.
Hoewel Agrobacterium in de natuur planten infecteert, kan deze bacterie in het laboratorium ook een groot aantal organismen zoals gisten, schimmels en zelfs humane cellen, transformeren. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de verschillende organismen waarvan bekend is dat ze door Agrobacterium getransformeerd kunnen worden.
De waarneming dat Agrobacterium bakkersgist kan transformeren is belangrijk. Bakkersgist wordt wereldwijd gebruikt in het onderzoek naar cellulaire processen. Onderzoek in onze groep heeft een aantal aspecten van het transformatie proces opgehelderd. Als vervolg op dit onderzoek willen we op een systematische wijze de gistgenen die betrokken zijn bij het transformatieproces identificeren.
Bakkersgist heeft ongeveer 6200 potentiële genen, waarvan er circa 1400 essentieel zijn. De niet-essentiële genen zijn één voor één uitgeschakeld resulterend in een collectie van omstreeks 4800 stammen elk met een deletie in één van de niet- essentiële genen. In Hoofdstuk 2 hebben we een protocol ontwikkeld om grote aantallen verschillende giststammen met Agrobacterium te kunnen transformeren. In Hoofdstuk 3 hebben we dit protocol gebruikt om de 4800 verschillende deletie stammen te transformeren en de transformatie efficiëntie te bepalen. Van deze
Nederlandse samenvatting
139 stammen bleken er 109 minstens twee maal minder transformanten te geven dan de wild type stam en 140 minstens twee keer meer transformanten. De genen die in deze stammen geïnactiveerd zijn, zijn betrokken bij een groot aantal verschillende processen. Opvallend was dat deletie van een aantal genen die betrokken zijn bij de acetylering van histonen resulteerde in een verhoogde transformatie efficiëntie, terwijl deletie van genen die betrokken zijn bij de deacetylering van histonen juist een verlaagde transformatie efficiëntie gaf. In Hoofdstuk 4 is het effect van deletie van genen betrokken bij de acetylering en deacetylering van histonen op de transformatie door Agrobacterium verder uitgezocht. Met name deletie van GCN5, coderend voor een histon acetylase resulteerde in een sterke toename van de transformatie frequentie, terwijl deletie van HDA2, coderend voor een histon deacetylase, tot een sterke afname van de transformatie frequentie leidde.
Het bacteriële virulentie eiwit VirD2 zorgt voor het vrijkomen van het T-DNA uit het Ti-plasmide en wordt samen met het T-DNA overgebracht naar de gastheer cel. Om de rol van dit VirD2 eiwit in de gistcel te bestuderen hebben we dit eiwit in de gistcel tot expressie gebracht als een fusie met GFP (green fluorescent protein). In Hoofdstuk 5 hebben we m.b.v. fluorescentie microscopie laten zien dat dit eiwit zich in de kern van de gistcel bevindt. M.b.v. van het gist ‘two-hybrid’ systeem hebben we twaalf gist eiwitten gevonden waar het VirD2 eiwit mogelijk aan bindt.
Nederlandse samenvatting
