Polair venster GC-MSscreening. RWZI-effluenten

Hele tekst

(1)

Ministerie van Verkeer en Waterstaat

opq

Polair venster GC-MS- screening van

RWZI-effluenten

GC-MS-screening van polaire HPLC-fracties in opdracht van RIWA Rijn

22 december 2005

(2)

Ministerie van Verkeer en Waterstaat

opq

Polair venster GC-MS- screening van

RWZI-effluenten

GC-MS-screening van polaire HPLC-fracties in opdracht van RIWA Rijn

22 december 2005

Werkdocumentnummer: 2005.186X Auteur: Gina Rinia

(afd. WILO)

Uitgevoerd door:

Opdrachtgever : Peter Stoks (RIWA Rijn) Onderzoeksleider : Joan Staeb

Uitvoerende : Rob Berbee en Gina Rinia Reviewer : Joan Staeb

Dit rapport is gereviewd door Joan Staeb en voldoet aan de criteria gesteld in het projectplan.

Paraaf Joan Staeb :

(3)

Samenvatting

. . . Om inzicht te krijgen in het voorkomen van polaire stoffen in effluenten nabij RWZI’s is een methode ontwikkeld. De methode bestaat uit een fractionering, extractie van de fracties bij pH 2 en pH 10 en screening met behulp van GC-MS en AMDIS.

Bij 3 RWZI’s, te weten RWZI Arnhem Nieuwgraaf, RWZI Culemborg en RWZI Renkum, zijn in twee verschillende weken monsters genomen en deze monsters zijn behandeld volgens de ontwikkelde methode.

In totaal zijn in de fracties 343 verschillende stoffen geïdentificeerd.

(4)

Inhoudsopgave

. . .

Samenvatting 5 Inhoudsopgave 7

1. Inleiding 5

2. Werkwijze 6

6 2.1 Bemonstering

6 2.2 HPLC-preconcentrering en fractionering

6 2.3 Extractie van fracties

6 2.4 Screening

3. Resultaten 7

7 3.1 Bemonstering

8 3.2 HPLC-preconcentrering en fractionering

8 3.3 Extractie van fracties

9 3.4 Screening

4. Conclusie en aanbevelingen 11

5. Referenties 12

6. Bijlagen 13

(5)

1. Inleiding

. . .

In het verantwoord kunnen gebruiken van rivierwater als bron voor de drinkwaterbereiding ligt voor RIWA en RIZA een gezamenlijk belang.

In eerdere projecten ziet RIWA polaire persistente verbindingen die moeilijk verwijderbaar zijn bij de drinkwaterbereiding. Dit project richt zich dan ook op de problematiek rond polaire stoffen en in het bijzonder de rol die emissies uit communale RWZI’s daarin spelen. De uitvoering van het project ligt bij de afdelingen WIA en WILO van het RIZA.

Voor dit project is men met name geïnteresseerd in polaire stoffen.

Daarom wordt een methode ontwikkeld voor HPLC-preconcentratie en fractionering op basis van log Kow. De fractie met laagste log-Kow bevat de meest polaire stoffen.

De fracties worden opgevangen, doorlopen vervolgens een screening met behulp van GC-MS en AMDIS en worden vervolgens ingelezen in de RIZA-GCMS-database. Het projectplan is bijgevoegd in bijlage 1.

De ontwikkelde methode zal worden toegepast op in totaal 6 monsters (representatieve monsters op 2 verschillende tijdstippen bij 3 RWZI’s).

(6)

2. Werkwijze

. . .

2.1 Bemonstering

Voor het project worden op vier aaneensluitende dagen monsters genomen bij 3 RWZI’s in 2 verschillende weken. Per RWZI en per week worden mengmonsters gemaakt, zodat uiteindelijk 6 monsters overblijven, waarmee het project wordt uitgevoerd.

2.2 HPLC-preconcentrering en fractionering

Doel van het project is een overzicht te krijgen van het voorkomen van polaire stoffen in effluenten van RWZI’s. Hiertoe wordt een methode ontwikkeld waarbij een HPLC-kolom wordt beladen met monster. De beladen kolom wordt geëlueerd met een water/methanol-gradiënt.

Gekozen wordt voor een grote kolom en een pompsysteem, die grote hoeveelheden kan verpompen. Voordeel hiervan is dat een grotere intake van het monster in bewerking kan worden genomen. Hierdoor worden ook grotere fracties verkregen.

2.3 Extractie van fracties

Na het verkrijgen van de fracties is het overbrengen van de polaire stoffen van de fracties naar een ander oplosmiddel nodig om de extracten geschikt te maken voor screening met GC-MS. De extractie zal plaatsvinden met dichloormethaan, eventueel bij verschillende pH.

Tevens vindt een vergelijking plaats met een dichloormethaan-extractie van het totale monster (methode: afvalwater GC-MS (W 8140 5.396, W 8140 5.398[3,2])).

2.4 Screening

De geëxtraheerde fracties worden gemeten met GCMS in de full scan mode en vervolgens worden de chromatogrammen gedeconvolueerd met AMDIS. De resultaten worden ingelezen in de RIZA-GCMS- database. Op deze manier is een semi-automatische identificatie van componenten mogelijk.

(7)

3. Resultaten

. . .

3.1 Bemonstering

Voor het project zijn monsters genomen bij RWZI Culemborg, RWZI Arnhem Nieuwgraaf en RWZI Renkum in week 16 en week 21 van 2005. Voor een mengmonster zijn gelijke hoeveelheden van betreffende deelmonsters samengevoegd. Tabel 3.1 laat zien hoe de mengmonsters zijn samengesteld.

. . . Tabel 3.1

Samenstelling mengmonsters van 3 RWZI’s

Bemonstering dag

Datum Bemonstering

Nummers Labinfos

RWZI Arnhem Nieuwgraaf

(mengmonster 1)

RWZI Culemborg (mengmonster 2)

RWZI Renkum

(mengmonster 3) . . .

1 18 april 2005 2005110080 2005110047 2005110087 2 19 april 2005 2005110081 2005110048 2005110088 3 20 april 2005 2005110082 2005110049 2005110089 4 21 april 2005 2005110083 2005110050 2005110090

Bemonstering dag

Datum Bemonstering

Nummers Labinfos

RWZI Arnhem Nieuwgraaf

(mengmonster 4)

RWZI Culemborg (mengmonster 5)

RWZI Renkum

(mengmonster 6) . . .

1 23 mei 2005 2005111785 2005111770 2005111790 2 24 mei 2005 2005111786 2005111771 2005111791 3 25 mei 2005 2005111787 2005111772 2005111792 4 26 mei 2005 2005111788 2005111773 2005111793

(8)

3.2 HPLC-preconcentrering en fractionering

Een preparatieve HPLC-kolom wordt met behulp van een externe pomp beladen met 100 ml monstermateriaal. Vervolgens wordt de beladen kolom in een HPLC-systeem geplaatst en geëlueerd middels een water/methanol-gradiënt. De gradiënt is weergegeven in figuur 3.1.

. . . Figuur 3.1

Overzicht van gradiënt bij HPLC-

fractionering Gradiënt HPLC-fractionering

0 20 40 60 80 100 120

0 10 20 30 40

Tijd in m inuten

%Methanol

Gradiënt

In het systeem bevindt zich een fractioneringtoestel, waarmee op gezette tijdstippen fracties worden afgevangen. De fractionering is zo ingesteld dat van 2 tot 21 minuten één fractie per minuut wordt afgevangen en er dus 19 fracties ontstaan van 30 ml (flow is 30 ml/min). Een aantal fracties worden samengevoegd zodat uiteindelijk 3 eindfracties worden verkregen, nl. tot ca. log Kow 2 (f1 t/m f5), van log Kow 2 tot ca. log Kow 4 (f6 t/m f12) en hoger dan log Kow 4 (f13 t/m f19). De meest polaire stoffen zullen als eerste van de kolom af komen, omdat ze meer affiniteit met het eluens hebben. Meer apolaire stoffen zijn sterker aangetrokken tot de stationaire fase en zullen daarom langer in de kolom blijven. Om de fracties op basis van log Kow te bepalen worden 2 referentiestoffen toegevoegd, te weten metoxuron (log Kow = 2,11) en fluoreen (log Kow = 4,02) (log Kow-waarden zijn bepaald met behulp van het programma Episuite[1]). Deze stoffen geven een piekmaximum bij respectievelijk 6,3 en 13,5 minuten. Bijlage 2 bevat een voorbeeldchromatogram, waarbij de fractionering is aangegeven.

3.3 Extractie van fracties

Er wordt gebruik gemaakt van vloeistof-vloeistof-extractie met dichloormethaan bij pH 2 en pH 10. Er is gekozen voor een lage en hoge pH om ook geladen stoffen (zowel zuur als basisch) te kunnen extraheren. Deze extracten zijn niet samengevoegd, maar afzonderlijk gemeten. Zo zijn van elke samengevoegde fractie twee extracten verkregen, nl. per pH. De hoeveelheid dichloormethaan is ongeveer een derde van de totale hoeveelheid in de fractie. De verkregen extracten zijn nog uitgeschud met water om de methanol te verwijderen. Het eindvolume van de fracties is ongeveer 1 ml. Een gedetailleerde werkwijze is opgenomen in bijlage 3.

(9)

3.4 Screening

In de chromatogrammen is duidelijk matrix aanwezig. Dat klopt, omdat feitelijk een equivalent van 5 ml afvalwater wordt geïnjecteerd. Dat is 5000x zo veel als bij de normale afvalwateranalyse (AWCOMP- methode) en 2x zo veel als bij de oppervlaktewateranalyse (MPV- methode) feitelijk geïnjecteerd wordt. In tabel 3.2 zijn de equivalente injectiehoeveelheden op een rij gezet. Deze zijn berekend uit de concentreringsfactor (van intake naar eindextract) maal de GC-injectie.

. . . Tabel 3.2

Equivalente injectiehoeveelheden in µl Methode Intake

monster

Volume eindextract

GC-injectie Equivalente injectie

(ml) (ml) (µl) (µl) . . .

Fractionering (per fractie) 100 1 50 5000

MPV 200 4 50 2500

AWCOMP 10 10 1 1

Opvallend is de afwezigheid van metoxuron in de chromatogrammen.

Deze stof is als referentie voor de fractionering toegevoegd en zou in fractie 1 moeten zitten. Oorzaak voor de afwezigheid van metoxuron is afbraak door verhitting, waardoor 1-isocyano-3-chloor-4- methoxybenzeen ontstaat. Het afbraakproduct zou wel zichtbaar moeten zijn, maar hier is niet specifiek naar gekeken, omdat uit de HPLC- chromatogrammen toch al duidelijk is dat de juiste fracties zijn uitgevangen.

Tabel 3.3 geeft een overzicht van het aantal geïdentificeerde componenten in de fracties. In bijlage 4 is een lijst van de aangetroffen stoffen opgenomen.

. . . Tabel 3.3

Aantal geïdentificeerde componenten (pH2 en pH10 opgeteld)

Aantal componenten Week 16 Week 21 Naam RWZI Fractie Per fractie Totaal Per fractie Totaal . . .

1 45 44

2 48 43

RWZI Arnhem Nieuwgraaf

3 32 125

31

118

1 45 48

2 38 42

RWZI Culemborg

3 25 108

27

117

1 47 40

2 61 44

RWZI Renkum

3 30 138

16

100

(10)

Op voorhand bestond het vermoeden dat in de eerste fractie minder stoffen zouden worden aangetroffen. Dit wordt door de resultaten niet bevestigd. In de eerste 2 fracties (tot log Kow 2 en tot log Kow 4) worden de meeste stoffen geïdentificeerd. Dit zijn ook de meest interessante in dit project. Voor meer inhoudelijke discussie betreffende de aangetroffen stoffen wordt verwezen naar de eindrapportage van dit project[4]. Een aantal stoffen zullen zowel bij pH2 als pH10 zijn gerapporteerd, maar dit is niet uitgezocht. Grotendeels worden de stoffen bij of de ene pH of de andere pH geëextraheerd. De getallen in de tabel geven een indicatie.

Bijlage 5 geeft een vergelijking in resultaten van de fractioneringsmethode met de AWCOMP-methode[2,3] op basis van totalen van de basepeaks. Tabel 3.4 is hiervan een samenvatting. Door middel van de kolom met percentages is aangegeven hoe de verdeling van de aangetroffen stoffen over de fracties is.

. . . Tabel 3.4

Totale basepeaks in de fracties en de LLE-extracten (pH2 en pH10 opgeteld)

Totalen aan basepeaks

Week 16 Week 21 Methode LLE Naam RWZI Fractie Base-

peaks

% van totaal

Base- peaks

% van totaal

Basepeaks gecorrigeerd naar equivalente injectie . . .

1 1.0E+07 28 3.8E+06 12 2 1.2E+07 34 1.7E+07 56 RWZI Arnhem

Nieuwgraaf

3 1.4E+07 38 1.0E+07 32

1.4E+10

1 6.8E+06 13 7.7E+06 17 2 1.1E+07 21 1.5E+07 34 RWZI Culemborg

3 3.6E+07 66 2.2E+07 49

4.5E+09

1 1.2E+07 31 2.2E+07 38 2 2.0E+07 52 2.5E+07 43 RWZI Renkum

3 6.5E+06 17 1.1E+07 19

6.0E+09

De getallen in tabel 3.4 zijn ter informatie. Het is niet reëel een vergelijking te maken tussen de fractioneringsmethode en de methode met vloeistof-vloeistof-extractie (LLE). Derhalve worden hieraan geen conclusies verbonden.

(11)

4. Conclusie en aanbevelingen

. . .

Aanbevolen wordt om de HPLC-methode en –fractionering uit te voeren met een kleinere intake. Waarschijnlijk is 5 ml voldoende en kan gebruik worden gemaakt van een fractioneringsysteem voor kleinere hoeveelheden. Voordeel hiervan is dat de extractie van de fracties minder arbeidsintensief is dan bij een intake van 100 ml. Dit levert dus tijdswinst op.

Wat betreft extractie bij lage en hoge pH is aan de resultaten te zien dat er stoffen zijn die zowel bij pH2 als bij pH10 in de chromatogrammen voorkomen. Maar de meeste stoffen worden alleen bij pH2 of pH10 geïdentificeerd. Dit is echter niet één op één te vergelijken met extractie bij neutrale (of ongebufferde) pH. Indien het wenselijk is om zo veel mogelijk stoffen te identificeren kan het zinvol zijn om extracties bij diverse pH uit te voeren en de gevonden stoffen apart op te tellen. Of dit veel toevoegt, gezien het beperkte polariteitsvenster van de GC, valt te betwijfelen.

Met de fractioneringmethode worden door AMDIS een flink aantal stoffen aangetroffen in al de fracties. Per fractie worden 16 tot 61 stoffen geïdentificeerd. Bij de LLE-methode (AWCOMP) worden per RWZI ongeveer 35 stoffen geëdentificeerd.

Veel interessante polaire verbindingen zijn niet zichtbaar op de GC. Een optie is de extracten in te vriezen en eventueel later te analyseren met LC-DAD en/of LC-MS. Identificatie van onbekenden met LC is echter nog veel complexer en arbeidsintensief.

(12)

5. Referenties

. . .

1. Programma Episuite, te downloaden via Internet

2. Van Delden, E., van Kuijck, S., van Duijn, P., 2004. “De bepaling van SIVEGOM componenten in AW met GC-MS.”, W8140- 5.398

3. Van Kuijck, S., van Delden, E.F., 2003. “De bepaling van enkele organische componenten in AW met GCMS.”, W8140-5.396 4. Berbee, R., Rinia, G., 2005. Eindrapport voor RIWA betreffende

dit project → in voorbereiding, titel en nummer zijn nog onbekend.

(13)

6. Bijlagen

. . .

1. Projectplan “Polaire stoffen RWZI’s”

2. Voorbeeldchromatogram met fractionering 3. Werkwijze voor de extractie van fracties 4. Lijst van aangetroffen stoffen in de fracties

5. Resultatenvergelijk van fracties met methode AWCOMP

(14)

Bijlage 1 Projectplan

. . .

(15)
(16)
(17)

Bijlage 2 Voorbeeldchromatogram fractionering (DAD-signaal 245 nm en 260 nm)

. . .

<—————— ><—————————><—————————>

fractie 1 fractie 2 fractie3

(1 t/m 5) (6 tm 12) (13 t/m 19)

tot log Kow2 log Kow2 tot log Kow4 > log Kow4

(18)
(19)

Bijlage 3 Werkwijze voor de extractie van fracties

. . .

Voer de volgende handelingen uit voor blanco en monsters:

- Voeg fractie 1 t/m 5 samen in een scheitrechter van 500 ml.

Extract hiervan is fractie 1.

- Voeg fractie 6 t/m 12 samen in een scheitrechter van 500 ml.

Extract hiervan is fractie 2.

- Voeg fractie 13 t/m 19 samen in een scheitrechter van 500 ml.

Extract hiervan is fractie 3.

- Breng met ca. 200 µl HCl (6N) op pH2.

* - Voeg aan de fracties 1,2 en 3 respectievelijk 50 ml, 70 ml en 70 ml dichloormethaan toe (komt overeen met ongeveer een derde deel van de totale hoeveelheid in de fractie).

- Ontlucht de scheitrechter en extraheer de fracties door 10 minuten te schudden in de schudmachine bij 150 slagen per minuut.

- Laat de scheitrechter, zonder stop, circa 2 minuten in de houder staan zodat de lagen kunnen ontmengen. Als er sterke emulievorming optreedt, wordt het extract gecentrifugeerd.

- Voeg aan fractie 3 ca. 100 ml water toe om de laag dichloormethaan te kunnen onderscheiden (methanol mengt met dichloormethaan).

- Laat de onderste (dichloormethaan)laag overlopen in een erlenmeyer van 100 ml, waarin zich een schep natriumsulfaat bevindt. De hoeveelheid natriumsulfaat moet zodanig zijn dat het gaat zweven in het extract. Pas dan is het extract voldoende vrij van water (water zorgt voor klontering).

- Breng met ca. 600 µl NaOH (2.5M) op pH10.

- Voer nogmaals een extractie uit vanaf *. Let op: Laat bij deze stap de laag dichloormethaan overlopen in een schone erlenmeyer van 100 ml.

- Damp de extracten in met behulp van de Kuderna-Danish opstelling tot ca. 10 ml.

- Plaats vervolgens de reageerbuizen in de turboevaporator en damp in tot ca. 1 ml.

- Schud alle fracties 2 en 3 nog eens uit met 1 ml water. Dit omdat het extract ook nog methanol bevat.

- Vul alle extracten aan tot 1 ml en breng over in een vial, waarin zich natriumsulfaat bevindt.

- Analyseer de extracten met GC-MS in de full scan mode

(20)
(21)

Bijlage 4 Lijst van aangetroffen stoffen in de fracties

. . .

(22)
(23)
(24)
(25)
(26)
(27)
(28)
(29)
(30)
(31)
(32)
(33)
(34)
(35)

Bijlage 5 Vergelijking van fractionering met LLE

. . .

Afbeelding

Updating...

Referenties

Updating...

Gerelateerde onderwerpen :