University of Groningen Biology of acute myeloid leukemia stem cells Mattes, Katharina

(1)

Biology of acute myeloid leukemia stem cells

Mattes, Katharina

DOI:

10.33612/diss.98637951

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2019

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Mattes, K. (2019). Biology of acute myeloid leukemia stem cells: the role of CITED2 and mitochondrial activity. Rijksuniversiteit Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.98637951

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

535611-L-sub01-bw-Mattes 535611-L-sub01-bw-Mattes 535611-L-sub01-bw-Mattes 535611-L-sub01-bw-Mattes Processed on: 23-9-2019 Processed on: 23-9-2019 Processed on: 23-9-2019

Processed on: 23-9-2019 PDF page: 145PDF page: 145PDF page: 145PDF page: 145

Appendices

Dutch summary

Acknowledgements

About the author

List of publications

(3)

Processed on: 23-9-2019 PDF page: 146PDF page: 146PDF page: 146PDF page: 146 146

A

Dutch summary

Nederlandse samenvatting

D

e huidige prognose van

patiënten met acute myeloïde leukemie (AML), een vorm van bloedkanker, is over het algemeen nog somber, voornamelijk vanwege de terugkeer van de ziekte na een behandeling met celdodende medicijnen ofwel chemotherapie. De huidige behandeling met chemotherapie leidt initieel tot een vermindering van leukemische blast cellen in bloed en beenmerg bij de meerderheid van de patiënten, maar een kleine populatie van leukemische cellen wordt blijkbaar niet efficiënt geraakt en blijft bestaan, hetgeen leidt tot een terugval van de ziekte. De focus van dit proefschrift is het in kaart brengen van cellen die therapieresistent zijn en in staat zijn deze ziekte te initiëren. Inzicht in deze processen is essentieel om de effectiviteit van AML-therapieën te verbeteren.

Bij AML veroorzaken verschillende mutaties en genetische veranderingen een rijpingsstop in bloedvormende cellen aanwezig in het beenmerg, wat leidt tot een ophoping van onrijpe blast cellen. AML ontstaat gewoonlijk door een stapsgewijze accumulatie van verscheidene mutaties. De eerste genetische veranderingen vinden plaats in bloedvormende ofwel hematopoietische stam- en voorloper cellen, die normaal gesproken kunnen uitrijpen tot verschillende soorten bloedcellen met specifieke functies. Deze veranderingen leiden tot de vorming van zogenaamde pre-leukemische

stamcellen, welke nog steeds het vermogen hebben om normaal uit te rijpen, maar die wel een groeivoordeel hebben. Latere gebeurtenissen in de AML-evolutie veroorzaken differentiatie- en proliferatie-afwijkingen en resulteren in de vorming van leukemische stamcellen, welke voor een langdurige productie van onrijpe blast cellen zorgen waarbij deze het verlies hebben van normale functies. Leukemische stamcellen hebben andere eigenschappen dan de meerderheid van de leukemische blast cellen. Met name wordt aangenomen dat zij chemoresistent zijn en een terugval van de ziekte kunnen veroorzaken. Onderzoek naar factoren die bijdragen aan het ontstaan van leukemische stamcellen of naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hun specifieke eigenschappen zou behulpzaam kunnen zijn voor de verbetering van AML-therapieën.

Het behoud van hematopoietische stamcellen en hun differentiatie tot rijpe bloedcellen wordt gereguleerd door een complex netwerk van verschillende eiwitten. Een van deze eiwitten is CITED2, dat een belangrijke rol heeft bij het behoud van zowel normale- als leukemische stamcellen. Eerder is aangetoond dat in een deel van AML-patiënten CITED2 verhoogd tot expressie komt en dat het verminderen van CITED2 de expansie van AML-cellen verstoort, maar de moleculaire mechanismen achter deze observatie zijn tot heden onduidelijk. In dit proefschrift zijn veranderingen in de signaaltransductiepaden als gevolg van verminderde CITED2 expressie geanalyseerd. Transplantatie studies tonen aan dat downregulatie van CITED2 de verspreiding van AML-cellen remt en in een significant langere overleving

(4)

A

resulteert. Dit kan samenhangen met het feit dat een verminderde CITED2 expressie tot een snellere celdood leidt waarbij de signaal eiwitten p53 en AKT een rol spelen. We hebben namelijk laten zien dat de afname van CITED2 leidt tot een verminderde interactie van p53 met zijn remmer MDM2, resulterend in verhoogde expressie van het p53-eiwit. Deze resultaten tonen aan dat CITED2 essentieel is voor de overleving van leukemische cellen, deels door het reguleren van genen en signaleringsroutes die de activering van p53 verstoren.

Een ander belangrijk eiwit voor de regulatie van het bloedvormende systeem is de transcriptiefactor PU.1, dat belangrijke functies heeft voor zowel het behoud van hematopoietische stamcellen als de differentiatie tot myeloïde cellen. Hoewel mutaties in PU.1 zeldzaam zijn in AML, wordt de expressie of activering ervan vaak verstoord door AML-geassocieerde mutaties. PU.1-knockdown-muizen (PU.1KD/KD_{), een model met verminderde}

PU.1-activiteit, ontwikkelen AML na een pre-leukemische fase van enkele maanden. Dit suggereert dat additionele veranderingen nodig zijn voor de vorming van maligne cellen. Potentiële kandidaten die de transformatie van pre-leukemische cellen met lage PU.1 expressie faciliteren, zijn factoren die het stamcelbehoud verhogen of de proliferatie versnellen. Onlangs werd aangetoond dat CITED2 een cruciale speler is in het stamcelbehoud, en negatief wordt gereguleerd door PU.1, wat suggereert dat beide factoren in hetzelfde signaleringsnetwerk werken. In dit proefschrift is daarom een mogelijk synergistisch effect van een gelijktijdige PU.1-afname en

CITED2-toename op het stamcelbehoud en AML-pathogenese onderzocht. We hebben laten zien dat simultane PU.1/CITED2 deregulering in stam- en voorloper cellen geïsoleerd uit navelstrengbloed het onrijpe fenotype van deze cellen versterkt. Een vergelijkbaar fenotype werd gevonden wanneer CITED2 tot overexpressie wordt gebracht in pre-leukemische beenmergcellen geïsoleerd uit PU.1KD/KD _{muizen. Bovendien konden}

wij laten zien dat wanneer PU.1KD/KD

worden getransplanteerd naar andere muizen, cellen met verhoogde CITED2-expressie met een hoger percentage in de ontvanger-muizen kunnen worden gedetecteerd.

Beter behoud van stamcellen zonder een uitrijping stoornis is beschreven als een vroege gebeurtenis in de AML-evolutie, wat suggereert dat de gecombineerde PU.1/CITED2-deregulering hierbij betrokken kan zijn. Genexpressie analyse toonde ook aan dat veranderingen veroorzaakt door PU.1/CITED2 deregulering ook wordt teruggevonden bij AML-patiënten. Dit ondersteunt de betrokkenheid van PU.1/ CITED2 deregulering bij AML evolutie. Samenvattend, wijzen de resultaten erop dat een gelijktijdige afname van PU.1 en toename van CITED2 een synergistisch effect heeft op de zelfvernieuwings-eigenschappen van hematopoietische stamcellen, een proces dat vaak voorafgaat aan een kwaadaardige transformatie.

Eerder is aangetoond dat het verlies van stamcel-eigenschappen in hematopoietische cellen zonder CITED2 expressie gepaard gaat met veranderingen in cel metabolisme. Het metabolisme van een cel omvat alle processen die betrokken zijn bij de Dutch summary

(5)

A

chemische productie van stoffen ten dienste van cel behoudt, maar ook gericht op energieproductie. Een belangrijke rol hierbij is voor mitochondria, die energie produceren in de vorm van ATP, waardoor het signaalmolecuul ROS (reactive oxygen species) vrijkomt als bijproduct. Aangetoond is dat een verlies van CITED2-expressie in het hematopoietische systeem leidt tot een verhoogde mitochondriale activiteit. In dit proefschrift middels een overzicht artikel beschrijven we de ROS-regulerende signaaltransductie routes en hun relevantie voor de functionaliteit van zowel normale als leukemische stamcellen. Bovendien wordt benadrukt dat de metabole toestand van leukemische stamcellen deze cellen op een bepaalde manier paradoxaal genoeg kwetsbaarder maakt. Leukemische stamcellen zijn namelijk sterk afhankelijk van hun resterende niveaus van mitochondriale activiteit en van signaalroutes die de mitochondria activiteit reguleren. Het anti-apoptotisch eiwit BCL2 speelt een belangrijke rol bij het behoud van de mitochondriale activiteit onder stress omstandigheden, en hoge BCL2 expressie bevordert het behoud van leukemische stamcellen. Ook zijn eiwitten die betrokken zijn bij mitofagie, een proces dat leidt tot de afbraak van mitochondriën, essentieel voor het overleven van leukemische stamcellen. Een therapeutische ontregeling van deze signaaltransductie routes wordt gezien als een veelbelovende nieuwe strategie voor de behandeling van AML.

Hoewel eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat leukemische stamcellen lagere ROS-niveaus hebben in vergelijking met de totale AML-cel populatie, was het niet duidelijk of ROS-niveaus in de stamcel-verrijkte

CD34+_{AML sub-fractie indicatief}

kan zijn voor stamcel-eigenschappen. Daarom onderzochten we in detail hoe ROS-niveaus binnen de CD34+

AML-cel populatie correleren met AML-cellulaire kenmerken zoals morfologie, metabole activiteit, genexpressie en de gevoeligheid voor bepaalde geneesmiddelen. In onze studie vergeleken we kenmerken van CD34+_{AML-cellen met lage en hoge}

ROS-niveaus (aangeduid als ROS-low en ROS-high). De resultaten tonen aan dat ROS-low cellen opmerkelijk kleiner zijn in vergelijking met ROS-high cellen en dat deze verrijkt zijn voor cellen met de oppervlakte eiwitten CD34+_/CD38

-. Verder hebben ROS-low cellen een verminderde metabole activiteit en een significant lager aantal mitochondriën en activiteit. Onderzoek door middel van RNA-sequencing van ROS-low en -high cellen maakte het mogelijk om processen te herkennen die verrijkt zijn in de ROS-low cellen. Genen die hoger tot expressie komen in ROS-low cellen zijn geassocieerd met negatieve regulatie van signaaltransductie routes, mogelijk samenhangend met de rustende fase van deze cellen, en verrijkt zijn voor genen die samenhangen met het onrijpe karakter van de cel. Aanvullende experimenten hebben laten zien dat CD34+_AML-cellen

met lage ROS-niveaus een verhoogde gevoeligheid hebben voor de BCL2-remmer Venetoclax, ondanks het feit dat we vergelijkbare niveaus van BCL2-expressie in ROS-low en ROS-high cellen hebben gevonden. Deze bevindingen suggereren dat de lage mitochondriale activiteit in ROS-low cellen de cellen kwetsbaarder maakt voor remming van belangrijke mitochondriale regulatoren. Samenvattend wijzen deze resultaten erop dat CD34+_AML-cellen

met lage ROS-niveaus kenmerken hebben van stamcellen, en daardoor

(6)

A

hoogstwaarschijnlijk samenvallen met de leukemische stamcel-populatie en die efficiënt geraakt kunnen worden door BCL2-remming.

(7)

A

Acknowledgments

The chapters of this thesis illustrate the scientific outcome of my PhD. This could only be achieved through the contribution of my supervisors, colleagues and co-authors. In addition, my PhD was far more than just an instructive period in academic research. The 5 years in Groningen represent an exciting chapter in my life, and it has become an important part of me thanks to the friends I found here. I therefore would like to acknowledge and thank these people.

My co-promotor Dr. H. Schepers: Dear Hein, you have made this thesis possible. Your enthusiasm for research has brought me to Groningen, where you have taught me a lot. Although we faced tough times and not all things went as planned, I didn’t want to miss this experience. Thank you for your utmost dedication.

My promotor Prof. Dr. Edo Vellenga: Dear Edo, thank you for your supervision and your full commitment for our projects at any time. Despite being a busy person, you always managed to make time for your students - no matter what time of day, I always received a response to emails immediately. I am impressed by your professionalism, your broad knowledge and your composure, also in difficult situations. I learned a lot from you.

For my research projects, I had the opportunity to study primary patient material. I therefore want to thank all the patients who donated material, and also all the people who work for an effective collaboration between lab and clinic in the Department of Hematology. I especially want to acknowledge Prof. Dr. G. Huls, Prof. Dr. J.J. Schuringa and Prof. Dr. E. Bremer: Dear Gerwin, JJ and Edwin, I appreciate your commitment beyond the borders of your own research projects and your support and critical advice for all members of the department.

I want to thank the members of the reading committee, Prof. Dr. P.J. Coffer, Prof. Dr. W. Helfrich and Prof. Dr. G. de Haan, for taking the time to critically read my thesis.

The experimental chapters of this thesis would not have been possible without the contribution of co-authors and collaborators, I want to thank them for their support. My special thanks go to my colleagues from the Hematology Lab, who provided a welcoming atmosphere from the start, which was continued by all the new members that joined over the years. Thanks to our regular after-work-events, I felt home in Groningen soon, and never regretted moving all alone abroad.

My paranymphs Aida, Gerbrig and Harm Jan, I dedicate this book to you. You have not only been incredible supportive colleagues, but also great friends. The road towards my PhD sometimes felt long and difficult, but with you by my side I managed to hold on. Thank you for the great time we spent together, I feel lucky to

(8)

A

have you in my life!

Gerbrig, I’m very happy with the cover of this book, I’m proud to have such a talented friend.

During the early days of my PhD I could count on the support of the “senior people” in- and outside the lab: Marta, Susan, Matthieu, Lieke, Antonella, Jeanet, Jenny, Hendrik and Henny, thank you for the warm welcome to the group. Marco, thank you for organizing great parties and cooking for us. Pallavi, thank you for an unforgettable India-adventure. Many thanks to the “basis” of Experimental Hematology: Vincent, Annet, Robin, Fiona, Carolien, you always provided help and advice when needed. Marjan, thank you for your help on all the experimental chapters. Bart Jan, your enormous expertise paired with your generous helpfulness is unique, thank you for your collegiality.

Carin, thank you for the good times at the ASH in San Diego. Mylène, thank you for the good collaboration on my last project. Ayşegül, thank you for our tea-sessions and many talks. Bauke, thank you for your refreshing enthusiasm and openness. Sonya, Maurien, Janine, Alan, Martijn, Evelien, Nienke, Valerie, Ewa, Yuan, thank you for the relaxed working atmosphere and for being such supportive colleagues. Tjerk Jan, Laura and all the students, thank you for the many nice conversions. It was a great pleasure to be part of team room 113: Roos and Renee, I enjoyed it a lot having you as my office neighbors, you are amazing. Harm Jan, Shanna, Isabelle, Isabel and Nisha, the great atmosphere in our room was a huge support for me during the last months of my PhD- thank you for that and the good times we had outside the lab.

My party committee members: Anouk, Sergi, Irena and Thijs, thank you for the good times during the Happy Helix year. My colleagues from Pediatric Oncology: Sophia, Kim, Frank, Tiny, Waldrik, Naomi, Irena, Marlinde, Tosca, thank you for the fun at work and all the after-work events. Marlinde, thank you for our joyful hours on the dance floor, your positive nature and your friendship.

Special thanks go to my colleagues from Medical Oncology and Gynecological Oncology: Thank you for being always helpful and for the many nice chats in the western blot room, corridors and at the borrels.

Henk, Theo, Roelof-Jan, Geert, Wayel and Johan, thank you for making my many hours at the FACS-facility as entertaining as possible. Henk, thank you for laying the foundation of my Dutch knowledge.

A lot of support also came from people outside my working-environment: Josefine und Christian, ihr zwei seid ein wichtiger Bestandteil meiner Zeit in Groningen. Bei unseren gemütlichen und manchmal feucht-fröhlichen Treffen konnte ich abschalten und neue Energie tanken. Danke euch, und auch Leo und Joost, für die Acknowledgments

(9)

A

vielen schönen Stunden. Thank you Pepijn and your lovely friends from Picuna for the entertaining time at concerts and birthday parties. Thijs, bedankt voor de gezelligheid op de pronkjewailpad. Jacob en Marja, jullie zijn de beste huisbaas die je kunt wensen. Heel erg bedankt dat ik altijd voor een kopje thee welkom was. Bedankt Anandi voor onze gesprekken en voor het luisteren als ik iets kwijt moest. Many thanks to the members of Sugarspin, who even made me having fun during the stressful final phase of my PhD. Vielen Dank an meine Freunde, die mich über die letzten Jahre in Groningen besucht haben.

Vielen lieben Dank an Christian Seiser und meine LAB7 Gruppe, insbesondere Astrid und Mirjam, ihr habt mir sehr viel beigebracht und mich bestmöglich auf meinen PhD vorbereitet. Ein großes Danke auch an meine Molbio Gang, die mich seit vielen Jahren auf meinem beruflichen Weg, und darüber hinaus, begleitet: Eure Freundschaft bedeutet mir viel.

Danke an meine lieben Freunde in Mistelbach. Obwohl ich mich die letzten Jahre nicht so oft habe blicken lassen, seid ihr nach wie vor für mich da. Besonders bedanken möchte ich mich bei Tine, Ricci, Stubi und Tom - ihr gebt mir das Gefühl als wäre ich nie weg gewesen.

Zu guter Letzt möchte ich ein großes „Danke“ an meine Familie aussprechen. Der Weg bis zu meinem PhD war lang, aber ich konnte immer mit eurer Unterstützung rechnen. Vor allem konnte ich mich dank euch in den letzten Monaten voll und ganz auf den Abschluss meiner Dissertation und meiner letzten Publikation konzentrieren, das war eine große Hilfe. Lieber Bruder, vielen Dank für deine Hilfe bei meinen diversen Umzügen, liebe Schwester, danke dass du immer für mich da bist.

(10)

A

Katharina Mattes was born on 13th_{of June 1986 in}

Mistelbach, Austria. After graduating from her high school BORG Mistelbach in 2004, she started her training as a Biomedical Scientist at the Vienna General Hospital. During her graduation project on allergic reactions to Cyperus esculentus, supervised by Prof. Dr. Barbara Bohle, she gained her first research experience, and completed the education in 2007. In the same year, Katharina’s interest for medical research motivated her to start her studies in Molecular Biology at the University of Vienna, where she received her Bachelor of Science degree in 2010. Katharina continued her studies with the master’s program Molecular Medicine

at the University of Vienna. In 2011, she participated at the ERASMUS exchange program and spent six months in Umeå, Sweden, where she got the opportunity to work on a research project in the group of Prof. Dr. Leif Carlsson at the Umeå Center for Molecular Medicine. During this project, she investigated the role of the Lhx2 gene in regulating stem cells and organ development. For her master thesis project, Katharina joined in 2012 the lab of Prof. Dr. Christian Seiser in the Department of Medical Biochemistry at the Max F. Perutz Labs (MFPL) in Vienna, Austria. For a period of 14 months, she worked on analyzing tissue-specific roles of the epigenetic regulators HDAC1 and HDAC2 and their involvement in tumorigenesis. With her work in the Seiser lab she could contribute to two publications, and defended her master thesis in October 2013. In 2014, Katharina started her PhD project under supervision of Dr. Hein Schepers and Prof. Dr. Edo Vellenga at the Department of Hematology at the University Medical Center Groningen (UMCG) in Groningen, the Netherlands. The result of this work is represented by the chapters of this book. During the annual PhD student meeting of the Cancer Research Center Groningen (CRCG) in 2016, she was awarded for the best poster presentation. In 2019, Katharina moved back to Mistelbach, Austria and currently dances a lot.

About the author

(11)

A

List of publications

K. Mattes, M. Gerritsen, H. Folkerts, M. Geugien, F.A. van den Heuvel, A. Flohr

Svendsen, G. Yi, J.H.A. Martens, E. Vellenga. CD34+_{acute myeloid leukemia cells}

with low levels of reactive oxygen species show increased expression of stemness-genes and can be targeted by the BCL2 inhibitor Venetoclax. Submitted

K. Mattes, E. Vellenga, H. Schepers. Differential redox-regulation and mitochondrial

dynamics in normal- and leukemic hematopoietic stem cells: A potential window for leukemia therapy. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2019, in press

K. Mattes, M. Geugien, P.M. Korthuis, A.Z. Brouwers Vos, R.S.N. Fehrmann, T.I.

Todorova, U. Steidl, E. Vellenga, H. Schepers. Transcriptional regulators CITED2 and PU.1 cooperate in maintaining hematopoietic stem cells. Experimental Hematology, 2019

K. Mattes*, G. Berger*, M. Geugien, E. Vellenga, H. Schepers. CITED2 affects

leukemic cell survival by interfering with p53 activation. Cell Death & Disease, 2017 A. Hagelkruys, K. Mattes, V. Moos, M. Rennmayer, M. Ringbauer, A. Sawicka, C. Seiser. Essential Nonredundant Function of the Catalytic Activity of Histone Deacetylase 2 in Mouse Development. Molecular and Cellular Biology, 2016 M. Winter, M.A. Moser, D. Meunier, C. Fischer, G. Machat, K. Mattes, B.M. Lichtenberger, R. Brunmeir, S. Weissmann, C. Murko, C. Humer, T. Meischel, G. Brosch, P. Matthias, M. Sibilia, C. Seiser. Divergent roles of HDAC1 and HDAC2 in the regulation of epidermal development and tumorigenesis. The EMBO Journal, 2013

(12)