University of Groningen
Nonribosomal peptide synthetases
Zwahlen, Reto Daniel
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Zwahlen, R. D. (2018). Nonribosomal peptide synthetases: Engineering, characterization and biotechnological potential. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
CHAPTER VII
Summary and outlook
181
Summary
and outlook
7
Microbial bioactive compounds like antibiotics and anti-cancer drugs have significant economic value in global food and health markets and there is a continuous need for more efficient and sustainable methods for their pro-duction. In addition, microbial bioactive compounds play an important role in the advancement of many scientific disciplines, including medicine and biol-ogy. Especially in the context of the rapid global spreading of microbial resis-tance to antibiotics, the discovery, development and engineering of bioactive compounds with antimicrobial activity has emerged as an extremely high priority issue. Predominantly, bioactive compounds can be attributed to sec-ondary metabolism of microorganisms and plants. Typically, the genes es-sential for secondary metabolite production are linked in the genome and arranged in so called biosynthetic gene clusters (BGC), dedicated to the pro-duction of one or a family of closely related compounds. Each cluster is com-prised of a series of genes that encode proteins needed for the synthesis, modification, and/or activation of the compound ultimately produced. The core element of a BGC is either a nonribosomal peptide synthetase (NRPS), a polyketide synthetase (PKS) or a NRPS-PKS hybrid [1], all large, modular and complex multi-domain enzymes with comprehensive molecular machineries. The multi-modular NRPS enzymes work with a thiotemplate mechanism, in-corporating single amino acids as building blocks stepwise into a growing chain, thereby constructing the backbone of the specific secondary metabo-lite [2]. The sequence of substrate incorporation is closely linked to the mod-ular setup and the domains present within the modules of the NRPS. Gener-ally, every module is responsible for the selection, activation and incorporation of a distinct building block which can be a proteinogenic or non- proteinogenic amino acid in the case of the NRPS [3]. Product formation happens in either a linear synthesis mode, specified by the NRPS modules from its N- to C- ter-minus, a non-linear or an iterative manner. However, the minimal composi-tion of each funccomposi-tional module remains the same and must cover an adenyla-tion domain (A), a thiolaadenyla-tion domain (T/PCP) and in case of a multi-modular setup, a condensation domain (C) [4]. The A domain works in a bifunctional manner, divided into an adenylation and thioesterification reaction, which takes place in this sequence and requires a structural rearrangement [5]. Ini-tially, based upon the A domain specificity, an amino acid is selected and using ATP, an adenyl-amino acid conjugate is formed. Subsequently, the con-jugate is transferred to the T-domain can covalently linked to a phosphopan-tetheine (ppant) moiety attached to a conserved serine residue, by means of a thioesterification reaction. The ppant attachment occurs after NRPS ex-pression as an essential post-translational modification of the NRPS, and is performed by a phosphopantetheinyl transferase (PPTase) [6]. After the
182
7
Summary
and outlook
amino acid is attached to the ppant arm, the dynamic movement of the A domain, reversing to the adenylation position, pushes the ppant arm into the donor active site of the C domain, where proofreading as well peptide-bond formation with the acceptor substrate takes place. Depending on the number of modules, these steps are repeated, until the fully matured polypeptide reaches the termination module, where another proofreading step takes place carried out by a thioesterase domain (Te), which, catalytically releases the compound from the NRPS. The released product may not have reached its bioactive or final state yet. Next to alterations prior or during the assem-bly [7] in reactions carried out by modifying domains or standalone tailoring enzymes, the released product may be further modified in trans [8]. The com-bined complexity is tremendous and the backbone structure may comprise as many as 15 amino acids [9] as well as various side group exchanges or modification, epimerization, side branching or (macro-) cyclization of the compound. However, multi NRPS systems [10–11] as well as product multi-merization add yet an additional layer of complexity to the resulting product, which is fully reflected in the diverse structures and functions of the final secondary metabolites. A more comprehensive explanation with examples of secondary metabolites is described in chapter I. Furthermore, overall the NRPS biochemistry as well as their domain specific biochemistry is discussed, highlighting the incredible complexity of the reactions. In the context of en-gineering the difficulty and bottlenecks encountered working with these large and complex enzymes are discussed including the strategies and avail-able tools and their respective advantages and disadvantages. Some of these tools were selected and applied for the design and engineering of a novel hybrid NRPS projected to synthesize the hpgCV tripeptide, a potential pre-cursor to D-amoxicillin, as discussed in chapters II and III. A series of hpg activating NRPS modules from a variety of genomic and meta-genomic sources were selected (chapter II) and in parallel a semi high throughput pro-cess was developed to sucpro-cessfully identify modules and domains, respec-tively, with the predicted specificity. We also succeeded in implementing a non-radiolabel dependent adenylation activity assay based on pyrophos-phate detection. Additionally, we have demonstrated, that the in some cases essential MbtH-like protein (MLP), an adenylation domain associated chap-eroning protein, is necessary for the activity of selected hpg activating do-mains. This has not been reported in any previous studies, thus representing a novel observation for hpg activating domains and modules. Hereby identi-fied modules were subsequently embedded into a system creating a series of hybrid NRPS or hpgCV-synthetase (Chapter III). Using the two C-terminal modules of the ACVS, specific to cysteine and valine, we developed a system
183
Summary
and outlook
7
for the generation of different hybrid NRPS. Although the system was effi-cient in generating the desired hybrids, the subsequent expression of the obtained hybrids was very difficult. Even though some expression of most hybrid NRPS could be achieved, it required MLP co-expression and resulted in low levels of purified protein. Further biochemical evaluation failed to demonstrate the production of the desired hpgCV tripeptide in vitro. None-theless, an in vitro product formation assay as well as a suitable analytical mass spectrometry methodology to detect product formation were estab-lished, and successfully applied in chapters IV–VI. Extensive in vitro produc-tion assays were employed for the characterizaproduc-tion of the Nocardia
lactamdu-rans ACVS (Chapter VI). In this chapter we established basic kinetic
parameters of this ACVS and its substrate specificity, revealing several novel, non-recorded, tripeptides. In addition to this biochemical evaluation, we es-tablished a two-step purification and stabilization procedure for ACVS sam-ple preparation. Following this procedure, we obtained ACVS enzyme at high purity which allowed us to generate electron microscopic images, data and models, reaching an unprecedented detailed picture for a multi-modular NRPS structure. The crude structure, is in line with a recently proposed multi-modular NRPS model predicting a domain arrangement which resem-bles a helix like structure resolving around a central, T domain lined chan-nel [13]. The cumulative knowledge obtained handling the ACVS was further employed in developing an hpgCV synthetase with another strategy, focus-ing on the implementation of a bi-modular NRPS system, which works on the basis of NRPS communicating domains, or COM domains [14], rather than intrinsically linked hybrid NRPS (Chapter V). In contrast to the in vitro efforts discussed in chapter III, we decided to introduce the entire new pathway in a model production host Penicillium chrysogenum (DS68530) devoid of its en-dogenous penicillin biosynthetic pathway. The developed parts, based on the pre-selection in chapter II, were integrated in the genome and the resulting strains showed indeed the production of a compound of the predicted mass and retention time, as verified with a chemically synthesized standard. Un-fortunately, further characterization of the observed compound revealed that the predicted chemical structure was not formed. The projected peptide bond between the hydroxyphenylglycine and the cysteine residue was in a thioester rather than the desired ester. Nevertheless, we have shown that the implemented COM domains do have the potential to create functional NRPS pairs in an in vivo setup and the suitability of P. chrysogenum as a host for the production and engineering of novel compounds and their pathways. To further evaluate the native secondary metabolite production capacities of
184
7
Summary
and outlook
associated with the modules and domains in chapter II. The results of these experiments, shown in chapter VI display a clear pattern, in which elevated secondary metabolite levels in P. chrysogenum strains with a single penicillin biosynthetic cluster (DS47274) and strongly improved kinetics, leading to earlier penicillin production in strains bearing multiple penicillin biosynthetic clusters (DS17690). Even though this effect seems to be specific for NRPS systems, it represents the first report of a prokaryotic MLP improving fungal NRPS peptide formation. This thesis has shown, that there is an enormous potential for the engineering and production of novel (NRPS derived) sec-ondary metabolites, but also shows that many of the critical requirements for NRPS substrate specificity and modification remain to be resolved. The tools described in this thesis, for engineering of a novel NRPS, are broadly applicable. The described adenylation assay fulfils a very distinct function is very sensitive and specific, while, the genomic MLP integration has the po-tential to improve the yield and kinetics of industrial strains, enhance the production of low abundant metabolites and may even be implemented to overexpress silent or cryptic NRPS clusters. Furthermore, with respect to NRPS engineering, it has become clear, that the exchange of entire domains or modules is very complicated and alternative more directed approaches, targeting sub-domains or distinct sites should be considered for future engi-neering attempts [8]. Presumably, the most straight forward path to suc-cessfully engineer NRPS, requires structural information, including potential interfaces, dynamics and positioning of domains and sub-structures within the multi-modular enzyme. Thus future methods should take potentially specific domain interactions into account. This will require the 3D-solution of multi-modular NRPS structures, preferably in various metabolic intermedi-ate stintermedi-ates. This will remain a significant task for future research, due to the large size and high flexibility of NRPS enzymes. The strategies described in this thesis to obtain a semi-refined structure of the ACVS will undoubtedly aid in solving its complete structure, as well as the structure of other multi-modular NRPS. This will eventually make NRPS engineering easier and more accessible, leading to the development of an entirely new generation of novel enzymes, pathways and bioactive compounds to tackle the challenges of more sustainable manufacturing, new antibiotics and new bioactive com-pounds for a wide range of applications.
185
Summary
and outlook
7
References
1. Wang H, Fewer DP, Holm L, Rouhiainen L, Sivonen K. Atlas of nonribosomal peptide and polyketide biosynthetic pathways re-veals common occurrence of nonmodular enzymes. Proc Natl Acad Sci. 2014;111: 9259–9264. doi:10.1073/pnas.1401734111 2. Marahiel MA, Stachelhaus T, Mootz HD.
Modular Peptide Synthetases Involved in Nonribosomal Peptide Synthesis. Chem Rev. American Chemical Society; 1997;97: 2651–2674. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/11851476
3. Caboche S, Pupin M, Leclère V, Fontaine A, Jacques P, Kucherov G. NORINE: a da-tabase of nonribosomal peptides. Nu-cleic Acids Res. 2008;36: D326-31. doi:10.1093/nar/gkm792
4. Weber T, Marahiel MA. Exploring the domain structure of modular nonribosomal pep-tide synthetases. Structure. 2001;9: R3–R9. doi:10.1016/S0969-2126(00)00560-8 5. Reger AS, Wu R, Dunaway-Mariano D,
Gu-lick AM. Structural characterization of a 140 degrees domain movement in the two-step reaction catalyzed by 4-chloroben-zoate:CoA ligase. Biochemistry. 2008;47: 8016–25. doi:10.1021/bi800696y
6. Beld J, Sonnenschein EC, Vickery CR, Noel JP, Burkart MD. The phosphopan-tetheinyl transferases: Catalysis of a posttranslational modification crucial for life. Nat Prod Rep. 2014;31: 61–108. doi:10.1039/c3np70054b
7. Sundaram S, Hertweck C. On-line en-zymatic tailoring of polyketides and peptides in thiotemplate systems. Curr Opin Chem Biol. England; 2016;31: 82– 94. doi:10.1016/j.cbpa.2016.01.012
8. Winn M, Fyans JK, Zhuo Y, Micklefield J. Re-cent advances in engineering nonribosomal peptide assembly lines. Nat Prod Rep. The Royal Society of Chemistry; 2016;33: 317–347. doi:10.1039/C5NP00099H 9. Bode HB, Brachmann AO, Jadhav KB,
Sey-farth L, Dauth C, Fuchs SW, et al. Structure elucidation and activity of kolossin A, the D-/L-pentadecapeptide product of a giant nonribosomal peptide synthetase. An-gew Chem Int Ed Engl. Germany; 2015;54: 10352–10355. doi:10.1002/anie.201502835 10. Hoertz AJ, Hamburger JB, Gooden DM,
Bednar MM, McCafferty DG. Studies on the biosynthesis of the lipodepsipep-tide antibiotic ramoplanin A2. Bioor-ganic Med Chem. Elsevier Ltd; 2012;20: 859–865. doi:10.1016/j.bmc.2011.11.062 11. Yin X, Zabriskie TM. The enduracidin bio-synthetic gene cluster from Streptomy-ces fungicidicus. Microbiology. 2006;152: 2969–2983. doi:10.1099/mic.0.29043-0 12. Engler C, Gruetzner R, Kandzia R,
Maril-lonnet S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type ils restriction enzymes. PLoS One. 2009;4: e5553. doi:10.1371/journal.pone.0005553 13. Marahiel MA. A structural model for
multimodular NRPS assembly lines. Nat Prod Rep. England; 2016;33: 136–140. doi:10.1039/c5np00082c
14. Hahn M, Stachelhaus T. Harnessing the potential of communication-mediating domains for the biocombinatorial syn-thesis of nonribosomal peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. National Academy of Sciences; 2006;103: 275–80. doi:10.1073/pnas.0508409103
Deutsche
189
Deutsche Z
usammenf
assung
7
Mikrobielle bioaktive Stoffe, sowie Antibiotika oder Krebsmittel, besitzen ei-nen signifikanten Wert innerhalb der weltweiten Lebenmittel- und Gesund-heitsindustrie, wodurch ein fortlaufender Bedarf and nachhaltigeren und effizienteren Herstellungsmethoden dieser Produkte besteht. Zusatzlich spielen diese mikrobiellen, bioaktiven Stoffe eine tragende Rolle in der Wei-terentwicklung einer Vielzahl wissenschaftlicher Bereiche, wie der Medizin oder Biologie. Vor allem im Kontext der globalen Antibiotikaresistenzkrise hat sich die Entdeckung, Entwicklung und das Verändern von bioaktiven Stoffen mit antimikrobiellen Eigenschaften, als alternativloser Ansatz zur Herstellung neür Produkte herauskristallisiert. Bioaktive Stoffe entspringen mehrheitlich dem Sekundärmetabolismus von Mikroorganismen und Pflan-zen. Normalerweise sind die essenziellen Gene fur die Produktion eines Stof-fes in einem biosynthethischen Gen Cluster (BGC) organisiert, welches für die Produktion eines oder mehreren verwandten Stoffen verantwortlich ist. Jedes BGC besteht aus einer Reihe von Genen, welche Proteine für die Syn-these, Veränderung und/oder Aktivierung eines zu produzierenden Stoffes kodieren. Das Herzstück eines jeden BGC ist entweder eine nonribosomale Peptidsynthetase (NRPS), eine Polyketidsynthetase (PKS) oder eine Hybrid NRPS-PKS, alles grosse, komplexe und modulare Enzyme [1].
Diese multimodularen NRPS Enzyme funktionieren auf Basis eines Thi-ol-Gruppen Kopplungs-Mechanismus in welchem schrittweise, einzelne Bausteine in eine längere Kette zusammengefurgt werden und somit das Rückgrat des gewünschten Stoffes ensteht [2]. Die Sequenz der Bausteine innerhalb der Kette ist abhängig vom Setup der Module und Domänen des NRPS und dessen Funktionslogik. Allgemein ist jedes Modul für die Selektion, Aktivierung und die Verkettung eines Bausteines verantwortlich, welcher im Falle der NRPS entweder eine proteinogene oder nicht-proteinogene Ami-nosäure ist [3]. Der Produktionsprozess des Stoffes innerhalb des NRPS ist durch die Modulspezifität vom N- zum C- Terminus des Enzymes bestimmt und folgt entweder einem linearen, nicht-linearen oder iterativen Mecha-nismus. Unabhängig des Mechanismus weist jedes aktive NRPS Modul die-selbe minimale Domänenkomposition auf, bestehend aus einer Adenylie-rungs- (A), Thiolisations- (T/PCP) und im Falle eines multimodularen NRPS, einer Kondnsationsdomäne (C) auf [4]. Die A-Domäne besitzt eine Doppel-funktion bestehend aus zwei separaten Reaktionen, der Adenylierung und Thiolierung, welche schrittweise ablaufen und mit massiven strukturellen Veränderungen der A Domäne einhergehen [5]. Zu Beginn wird eine Amino-säure annhand der A-Domänenspezifität ausgewählt und mit Hilfe von ATP ein Adenyl-Aminosäuren Konjugat hergestellt. Das Konjugat wird danach an eine Thiol-Gruppe gebunden, welche sich am Ende eines Phosphpantheteine
190
7
Deutsche Z
usammenf
assung
Arms (ppant) befindet, welcher wiederum an einem konservierten serin in der T-Domäne verankert ist. Die Befestigung des ppant Armes geschieht posttranslational durch eine PPTase [6] und repräsentiert einen essenziel-len Schritt zur Aktivierung eines NRPS. Nachdem die Aminosäure und den ppant Arm angebracht ist, wird dieser durch die Rückwärtsbewegung der A- Domäne in Richtung des aktiven Zentrums der C-Domäne gedrückt wo falsch angebrachte Aminosäuren entfernt werden und Korrekte der wach-senden Bausteinkette zugefügt werden. Diese Schritte werden so lange wie-derholt bis das wachsende Produkt das letzte, beziehungsweise terminale Modul des NRPSs erreicht. Dort befindet sich ein weiterer Kontrollmechanis-mus, ausgeführt durch eine thioesterasedomäne (Te), welche korrekte Pro-dukte schlussendlich katalytisch vom NRPS entfernt.
Das mittlerweile entfernte Produkt ist jedoch zu diesem Zeitpunkt noch nicht zwangsläufig fertig beziehungsweise aktiv. Zusätzlich zu den Produkt-modifikationen, welche während des NRPS gebundenen Prozesses durch NRPS Modifikationsdomänen oder externen Faktoren enstehen [7], kann ein schon vom NRPS entferntes Produkt in trans weiter modifiziert wer-den [8]. Die Komplexität des daraus resultierenden Produktes ist beeindru-ckend, da alleine der Rückgrat eines Produktes aus 15 Aminosärün bestehen kann [9]. Durch den zusätzlichen Austausch funktioneller Gruppen, der Epi-merisierung, Zyklisierung und weiterer Modifikationen ensteht jedoch eine noch grössere und diversere Auswahl an Produkten. Zusätzlich fügen multi- NRPS-Systeme [10;11] und die Multimerisierung eines Produktes eine wei-tere Komplexitätsebene hinzu, welche sich in den vielfältigen Strukturen und biologischen Eigenschaften der Produkte widerspiegelt. Verschiedene Besispiele von Sekundärmetaboliten und genaüre Erläuterungen zu Produk-tions- und Modifikationsmechanismen finden sich in Kapitel I. Des Weiteren wird die allgemeine und domänenspezifische Biochemie weiter besprochen, welche die ungemein komplexen Abläufe weiter unterstreicht. Im Kontext der Enzymveränderung, werden ausserdem die Schwierigkeiten und limi-tierenden Faktoren dieser grossen und komplexen Enzyme erläutert, sowie Strategien und verfügbare Werkzeuge inklusive deren Vor- und Nachteile diskutiert. Einige der besprochenen Strategien und Werkzeuge wurden da-nach zur Entwicklung eines neuartigen NRPS-Hybrid Enzymes ausgewählt. Dieses System sollte ein hpgCV Tripeptid synthetisieren, welches schluss-endlich in amoxicillin umgewandelt wird, wie besprochen in den Kapiteln II und III. Dazu wurden hpg aktivierende NRPS Module aus genomischen und metagenomischen Qüllen selektiert (Kapitel II). Parallel dazu wurde ein Pro-zess entwickelt der es erlaubt Modul- und Domänenspezifitäten in Medium- bis Hochfrequenz zu analysieren. Zusätzlich wurde ein nicht-radioaktiver
191
Deutsche Z
usammenf
assung
7
Adenlyationsaktivitätstest etabliert und aufgezeigt, dass das fallspezifisch essenzielle MLP protein, welches mit der adenylations Domeane interagiert, unverzichtbar ist um die Aktivität von einigen der getesteten Domänen zu gewährleisten. Da dies eine neuartige Beobachtung darstellt, kann von ei-nem Präzedenzfall ausgegangen werden. Die durch diesen Prozess identi-fizierten Module wurden anschliessend in einem System integriert, welches die Kreation von hpgCV Hybrid NRPS zur Folge hatte (Kapitel III). Mit Hilfe der zwei C-terminalen Module der ACV-Synthetase (ACVS), welche cystein und valin Speizifitäten aufweisen, wurde ein System entwickelt, um ver-schiedene Hybrid-NRPS Varianten zu kreieren [12]. Das System erwies sich als effizient, jedoch war die Herstellung der erlangten NRPS-Hybrid Proteine wesentlich komplizierter. Trotzdem, konnte die Mehrheit der NRPS Hybri-den zur Expression gebracht werHybri-den, wozu jedoch MLP-Proteine nötig wa-ren. Schlussendlich konnten dennoch nur Kleinstmengen an aufgereinigtem Protein isoliert werden. Die in Folge durchgefuhrten biochemischen Expe-rimente, zeigten nichtsdestotrotz keinerlei Produktion des gewünschten hpgCV Tripeptides in vitro. Jedoch wurde ein in vitro-Test entwickelt, welcher im Verbund mit einer massenspektrometrischen Analyse die Herstellung von Produkten nachweisen kann und dadurch auch in Experimenten der Kapitel IV–VI angewendet wurde. Ausführliche in vitro Teststudien wurden vor allem zur Charakterisierung des Nocardia lactamdurans ACVS durchgeführt (Kapi-tel VI). Im selben Kapi(Kapi-tel wurden die fundamentalen biochemischen Para-meter dieser ACVS Variante festgestellt, sowie dessen Substratspezifität, durch welche auch die Herstellung neuartiger Tripeptide beobachtet werden konnte. Zusätzlich zu den biochemischen Parametern wurde auch eine zwei-stufige Reinigungs- und Stabilisierungsprozedur zur ACVS Präparation eta-bliert. Durch die Anwendung dieser Prozedur wurde hochreines ACVS Prä-parat erlangt, welches uns erlaubte elektronenmikroskopische Aufnahmen und Modelle herzustellen die zu einer noch nie dagewesenen Qualität eines multimodularen NRPSs führte. Die erhaltene Struktur scheint das kürzlich vorgestellte Modell eines multimodularen NRPS zu stützen, welches eine helixähnliche Struktur mit einem zentralen Tunnel vorschlägt [13].
Das gesammelte Wissen, welches aus den ACVS Studien enstand, wurde darauffolgend auch angewandt um ein Zwei-Komponenten NRPS System zu entwickeln, welches NRPS Kommunikationsdomänen verwendet (COM) [14] anstatt eines kovalent-integralen NRPSs (Kapitel V). Im Gegensatz zu den in vitro Versuchen aus Kapitel III, wurde dieses System und die dazuge-hörenden Faktoren in dem Produktionsorganismus Penicillium chrysogenum (DS68530) getestet, welcher kein Penizillin BGC enthält. Die entwickelten Zwei-Komponenten NRPS Systeme, basierend auf der Selektion in Kapitel II,
192
7
Deutsche Z
usammenf
assung
wurden in das Genom integriert und die daraus resultierenden Stämme zeig-ten die Produktion eines Stoffes, welcher in Masse und Rezeig-tentionszeit dem chemisch hergestellten hpgCV Produktestandard entsprach. Leider ergab eine Folgeanalyse, dass das Produkt in seiner Struktur inkorrekt war. Das hergestellte Produkt wies eine Thioester- anstatt der Estervebindung zwi-schen hpg und cystein auf. Nichtsdestotrotz, wurde aufgezeigt, dass die ausgewählten COM Domänen das Potential haben, erfolgreiche NRPS zwei Komponenten Systeme zu ermöglichen, welche mit Hilfe des P.chrysogenum (DS68530) Stammes weiter verfeinert werden könnten. Um das weitere Po-tenzial von P.chrysogenum als Produktionsplattform für Sekundärmetaboli-ten zu eruiren, haben wir die in Kapitel II evaluierSekundärmetaboli-ten MLP-Proteine geno-misch in P.chrysogenum Stämme integriert. Die Resultate dieser Experimente werden in Kapitel VI geschildert und weisen ein klares Muster auf.
P.chryso-genum Stamme DS47274 mit einem Penizillin BGC weisen höhere Penizillin
Produktionsraten auf und P.chrysogenum Stämme DS17690 mit acht Penizil-lin BGC zeigen frühere Produktionsspitzen, nachdem jeweils ein MLP in den respektiven Stämm integriert wurde. Obwohl sich dieser Effekt höchstwahr-scheinlich auf NRPS beschränkt, stellt es den ersten Fall dar, in welchem ein prokaryotisches MLP den sekundären Metabolismus eines Pilzes begünstigt. In dieser Arbeit wurde das Potenzial für das re-Design von NRPS aufge-zeigt, zur Produktion neuer, potentiell interessanter Stoffe und die damit einhergehenden Schwierigkeiten in Bezug auf NRPS Strategien für die Eruie-rung und Bestimmung derer Spezifität. Die hier vorgestellten Werkzeuge zur Veränderung von NRPS sind allgemein für ein grosses Spektrum von Appli-kationen geeignet, nicht nur hinsichtlich NRPS Anwendungen sondern auch zur Veränderung von verwandten Enzymen. Nichtsdestotrotz variiert die An-wendungsbreite massiv, zum Beispiel ist der Adnylationstest dazu ausgelegt ausnahmslos Reaktionen zu messen, welche Pyrophosphat generieren. Die genomische Integration eines MLP Helferproteines kann jedoch nicht nur die Produktionsraten von aktiven Stoffen erhöhen sondern zusätzlich deren Pro-duktionskinetik verbessern und unter Umständen sogar dafür sorgen, dass kryptische Gene aktiviert werden, welche potenziell neue Stoffe produzie-ren könnten. Des Weiteproduzie-ren hat sich hinsichtlich des NRPS-Designs bestätigt, dass sich der Austausch ganzer Domänen und Module als äußerst schwie-rig herausstellt, was ebenfalls in einer Vielzahl anderer Studien beobachtet wurde. Daher sollte künftig von einem solchen Ansatz abgesehen werden und eine verstärkt punktülle Strategie bevorzugt werden, die sich auf den Aus-tausch von integralen Substrukturen beschränkt. Der Ansatz sollte weiter-hin Subdomänen oder spezifische Interaktionspunkte und zusätzlich die vor- und nachgelagerten Domänen und deren Dynamik in Betracht ziehen. Dafür
193
Deutsche Z
usammenf
assung
7
ist es essentiel, dass 3-D NRPS Strukturen eruiert werden, die die Enzyme in einem multi-modularen Kontext darstellen und vorzugsweise in diversen metabolisch-intermediären Zustanden zur Verfügung stehen. Jedoch ist und bleibt dies vorerst eine enorme Herausforderung, auf Grund der massiven Grösse und Flexibilität der NRPS Komplexe. Nichtsdestotrotz können die in dieser Arbeit aufgezeigten Methoden zur Bestimmung von NRPS Strukturen, ohne Zweifel den weiteren Forschungsprozess signifikant vereinfachen und beschleunigen. Dies sollte schlussendlich dazu führen, dass die Entdeckung, Veränderung und die Anwendung neür NRPS vereinfacht wird, was zur Ent-wicklung einer neün Generation von Enzymen, genetischer Netzwerke und neür bioaktiver Produkte führen sollte welche nicht nur auf die Behandlung diverser Erkrankungen abziehlt sondern auch zur nachhaltigen Produktion von bereites etablierten Produkten beitragen könnte.
Quellen
1. Wang H, Fewer DP, Holm L, Rouhiainen L, Sivonen K. Atlas of nonribosomal peptide and polyketide biosynthetic pathways reveals common occurrence of nonmod-ular enzymes. Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of America. 2014. pp. 9259–9264. doi:10.1073/pnas.1401734111
2. Marahiel MA, Stachelhaus T, Mootz HD. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis. Chem Rev. American Chemical Society; 1997;97: 2651–2674. doi:10.1021/cr960029e 3. Caboche S, Pupin M, Leclère V,
Fon-taine A, Jacques P, Kucherov G. NORINE: a database of nonribosomal peptides. Nucleic Acids Res. 2008;36: D326-31. doi:10.1093/nar/gkm792
4. Weber T, Marahiel MA. Exploring the Domain Structure of Modular Nonribo-somal Peptide Synthetases. Structure. 2001;9: R3–R9.
doi:10.1016/S0969-2126(00)00560-8
5. Reger AS, Wu R, Dunaway-Mariano D, Gulick AM. Structural characterization of a 140 degrees domain movement in the two-step reaction catalyzed by 4-chlorobenzoate:CoA ligase. Biochem-istry. 2008;47: 8016–25.
doi:10.1021/bi800696y
6. Beld J, Sonnenschein EC, Vickery CR, Noel JP, Burkart MD. The phosphopan-tetheinyl transferases: catalysis of a posttranslational modification crucial for life. Nat Prod Rep. 2014;31: 61–108. doi:10.1039/c3np70054b
7. Sundaram S, Hertweck C. On-line enzy-matic tailoring of polyketides and pep-tides in thiotemplate systems. Curr Opin Chem Biol. England; 2016;31: 82–94. doi:10.1016/j.cbpa.2016.01.012 8. Winn M, Fyans JK, Zhuo Y, Micklefield J.
Re-cent advances in engineering nonribosomal peptide assembly lines. Nat Prod Rep. The Royal Society of Chemistry; 2016;33: 317–347. doi:10.1039/C5NP00099H
194
7
Deutsche Z
usammenf
assung
9. Bode HB, Brachmann AO, Jadhav KB, Seyfarth L, Dauth C, Fuchs SW, et al. Structure elucidation and activity of kolossin A, the D-/L-pentadecapeptide product of a giant nonribosomal pep-tide synthetase. Angew Chem Int Ed Engl. Germany; 2015;54: 10352–10355. doi:10.1002/anie.201502835
10. Yin X, Zabriskie TM. The enduracidin biosynthetic gene cluster from Strep-tomyces fungicidicus. Microbiology. 2006;152: 2969–2983.
doi:10.1099/mic.0.29043-0
11. Hoertz AJ, Hamburger JB, Gooden DM, Bednar MM, McCafferty DG. Studies on the biosynthesis of the lipodepsipeptide antibiotic ramoplanin A2. Bioorganic Med Chem. Elsevier Ltd; 2012;20: 859–865. doi:10.1016/j.bmc.2011.11.062 12. Engler C, Gruetzner R, Kandzia R,
Maril-lonnet S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type ils restriction enzymes. PLoS One. 2009;4: e5553.
doi:10.1371/journal.pone.0005553 13. Marahiel MA. A structural model for
multimodular NRPS assembly lines. Nat Prod Rep. England; 2016;33: 136–140. doi:10.1039/c5np00082c
14. Hahn M, Stachelhaus T. Harnessing the potential of communication-mediating domains for the biocombinatorial syn-thesis of nonribosomal peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. National Acad-emy of Sciences; 2006;103: 275–80. doi:10.1073/pnas.0508409103
Nederlandse
samenvatting
199
N
ederlandse samenvatting
7
Microbiële biologisch actieve stoffen, zoals antibiotica en anti-kanker medicij-nen, hebben significante economische waarde in de wereldwijde voedsel- en gezondheidsindustrie. Vandaar dat er een constante vraag is naar efficiëntere en duurzamere productiemethoden voor deze moleculen. Daarnaast spelen deze verbindingen een belangrijke rol in het wetenschappelijk onderzoek bin-nen de geneeskunde en biologie. Daar de microbiële resistentie tegen antibio-tica wereldwijd snel toeneemt en verspreidt, is de ontdekking en ontwikkeling van biologisch actieve stoffen met antimicrobiële werking van uitermate groot belang. Deze biologisch actieve componenten zijn hoofzakelijk secundaire me-tabolieten die afkomstig zijn van micro-organismen en planten. Over het alge-meen liggen de genen die essentieel zijn voor de productie van een secundair metaboliet gekoppeld in een gezamenlijk bio- synthetisch genen cluster (BCG). Zo’n BCG representeert de productie van één, of een familie van sterk gerela-teerde, stof(fen). Elk cluster bestaat uit een set genen die coderen voor eiwit-ten betrokken bij de synthese, modificatie en/of activatie van de uiteindelijk geproduceerde stof. Het centrale element van een BGC is ofwel een niet-ribo-somaal peptide synthetase (NRPS) een Polyketide synthetase (PKS) of een NRPS-PKS hybride. Deze grote, modulaire en complexe multi- domein enzy-men [1] functioneren via een thio-template mechanisme. Bij NRPS enzyenzy-men fungeren losse aminozuren als bouwstenen die stapsgewijs worden inge-bouwd in een groeiende keten, wat uiteindelijk resulteert in de vorming van de backbone van een specifiek secondaire metaboliet [2]. De volgorde waarin het substraat wordt ingebouwd is sterk gekoppeld aan de organisatie van de ver-schillende modules en de sub-modules (domeinen) van de NRPS. Over het al-gemeen is elke module verantwoordelijk voor de selectie, activatie en inbouw van een specifieke bouwsteen. In het geval van NRPS enzymen kunnen deze bouwstenen proteinogenic of non-proteinogenic aminozuren zijn [3]. Het pro-duct kan tot stand worden gebracht via lineaire (gereguleerd door de NRPS modules van de N- naar de C- terminus), niet-lineaire of iteratieve synthese. Echter, de samenstelling van elke functionele module moet minimaal bestaan uit een Adenylatie domein (A), een Thiolatie domein (T/PCP) en, in het geval van een multi-modulaire organisatie, een Condensatie domein (C) [4]. De wer-king van het A domein kan verder worden onderverdeeld in een adenylatie en een thio-esterficatie reactie [5]. Voor laatst genoemde reactie is een structu-rele reorganisatie binnen het eiwit nodig. Als eerste wordt er, afhankelijk van de specificiteit van het A domein, een specifiek aminozuur geselecteerd en, via de hydrolyse van ATP, gebonden aan het enzym. Vervolgens wordt de ge-vormde adenyl-aminozuur intermediair overgedragen aan het T-domein, waar het covalent wordt gebonden aan een geconserveerde Serine residu via de eerdergenoemde thio-esterificatie. Deze serine maakt deel uit van de
200
7
N
ederlandse samenvatting
phosphopantetheine (Ppant) arm, een apart onderdeel van het enzym, dat pas na de synthese van het NRPS via een post-translationele phosphopantetet-heine transferase (PPTase) afhankelijke modificatie wordt verbonden met het eiwit [6]. Na de koppeling van het aminozuur aan de Ppant arm zorgt een dy-namische beweging van het A domein voor een draaiing van de adenylatie po-sitie, waarbij de Ppant arm wordt weggeduwd naar de actieve bindingsplaats van het C-domein. In dit domein vindt vervolgens een controle plaats, waarna het aminozuur aan het acceptor substraat wordt gekoppeld middels een pep-tide-binding. Afhankelijk van het aantal modules, worden deze stappen her-haald, totdat het volledige polypeptide is gevormd. Vervolgens wordt de keten overgedragen aan het Thio-esterase (Te) domein. Hier vindt nog een laatste controle plaats, waarna het gevormde peptide katalytisch kan worden ontkop-peld van het NRPS. Na deze ontkoppeling is het gevormde product in sommige gevallen nog niet in zijn uiteindelijke (bio)actieve toestand [7]. Vandaar dat ook na de ontkoppeling het product nog verder in trans gemodificeerd kan worden [8]. Afhankelijk van het NRPS, kunnen deze extra modificaties echter ook al tijdens of voorafgaand aan de aminozuurkoppeling plaatsvinden. Uiteindelijk kan dit resulteren in een peptide skelet bestaande uit wel 15 aminozuren [9], waarbij er verschillende zijketens, modificaties, epimerizaties, vertakkingen en (macro-) cyclisaties kunnen worden toegevoegd aan de gesynthetiseerde ver-binding. Vandaar dat de complexiteit van het uiteindelijke product aanzienlijk kan zijn. Desalniettemin voegen vele NRPS systemen nog eens een extra laag van complexiteit toe door de vorming van multi-meren van het geproduceerde product [10;11]. Dit alles tezamen resulteert in een enorme diversiteit in de structuur en functie van de secundaire metabolieten. In hoofdstuk I staat een uitgebreide uitleg van secundaire metaboliet productie beschreven aan de hand van specifieke voorbeelden. Daarnaast wordt zowel de algehele NRPS biochemie, als de specifieke domein biochemie uitvoerig besproken. In het ka-der van engineering worden ook de moeilijkheden en knelpunten die men te-genkomt tijdens het werken met deze grote en complexe enzymen benoemd, waarbij ook de voor- en nadelen van bepaalde strategieën en tools uitvoerig worden besproken. Enkele van deze tools zijn vervolgens geselecteerd en toe-gepast voor het ontwerpen en ontwikkelen van een nieuw hybride-NRPS pro-ject, met als doel de synthese van de HpgCV tri-peptide: een potentiele pre-cursor van D- Amoxicillin (hoofdstuk II en III). Doormiddel van een nieuw ontwikkelde semi-high throughput methode zijn meerdere hydroxyphenylgly-cine (Hpg) activerende NRPS modules, afkomstig van verscheidene genomi-sche en meta- genomigenomi-sche bronnen, geselecteerd aan de hand van de voor-spelde werking van deze specifieke modules en domeinen (hoofdstuk II). Daarnaast zijn we er ook in geslaagd een radiolabel vrije adenylatie activiteit
201
N
ederlandse samenvatting
7
test te implementeren op basis van vorming van pyrofosfaat uit de hydrolyse van ATP tot AMP. Bovendien, hebben we aangetoond dat het in sommige ge-vallen een MbtH-achtig eiwit (MLP) dat fungeert als een adenylatie domein geassocieerd chaperonne eiwit, noodzakelijk is voor de activatie van de gese-lecteerde Hpg activerende domeinen. Aangezien dit nog niet eerder benoemd is in voorgaande studies, is dit een geheel nieuwe waarneming aangaande Hpg activerende domeinen en modules. Vervolgens zijn de geselecteerde modules en domeinen ingebouwd in een systeem met het uiteindelijke doel een serie van hybride NRPS enzymen als HpgCV-synthetases te creëren (hoofdstuk III). Door gebruik te maken van de twee C-terminale modules van de ACVS, speci-fiek voor cysteïne en valine, hebben we een systeem ontwikkeld voor de pro-ductie van verschillende hybride NRPS [12]. Ondanks dat het systeem de ge-wenste hybride NRPS efficiënt kon fabriceren, was de daaropvolgende over-expressie erg moeilijk. Hoewel de meeste hybride NRPS wel gedeeltelijk tot expressie konden worden gebracht, resulteerde dit in lage hoeveelheden gezuiverd eiwit, waarbij de co-expressie met MLP noodzakelijk was. Helaas resulteerde een verdere biochemische evaluatie niet in de in vitro productie van de gewenste HpgCV tri-peptide. Desondanks zijn zowel een methode voor de in vitro synthese van product, als een geschikte massaspectrometrie ana-lyse methode voor het gesynthetiseerde product ontwikkeld (hoofdstuk IV-VI). Uitgebreide in vitro experimenten zijn toegepast voor de karakterisatie van de
Nocardia lactamdurans ACVS (hoofdstuk VI). In dit hoofdstuk hebben we de
kinetische parameters en de substraat specificiteit vastgesteld van dit ACVS, wat uiteindelijk heeft geleid tot de ontdekking van nieuwe tri-peptiden. Tevens hebben we ook een twee-staps zuivering en stabilisatie methode ontwikkeld voor het ACVS enzyme. Het toepassen van deze methode heeft geresulteerd in extreem zuiver ACVS geschikt voor elektron microscopie, wat uiteindelijk heeft geleid tot een zeer gedetailleerde structuur van een multi-modulaire NRPS. Deze ruwe structuur komt overeen met een recentelijk gepubliceerd mul-ti-modulair NRPS model, waarbij er wordt gesuggereerd dat de domeinen in een helix-achtige structuur gerangschikt liggen rond een centraal liggend ka-naal bestaande uit T-domeinen [13]. De vergaarde kennis aangaande het ge-bruik van ACVS is verder toegepast voor het ontwikkelen van een HpgCV syn-thetase via een andere strategie, die meer toegespitst is op de implementatie van een bi-modulair NRPS systeem. Dit systeem werkt via het principe van NRPS communicatie (COM)- domeinen [14] en niet via intrinsiek gekoppelde hybride NRPS (hoofdstuk V). In tegenstelling tot de in hoofdstuk III eerder ondernomen in vitro pogingen, hebben we nu besloten de ontwikkelde route volledig te reconstitueren in de productie stam Penicillium chrysogenum (DS68530), die geen eigen bio-synthetische penicilline productie route meer
202
7
N
ederlandse samenvatting
heeft. Aldus, zijn de eerder geselecteerde en ontwikkelde onderdelen, be-noemd in hoofdstuk II, geïntegreerd in het genoom. Dit resulteerde in de syn-these van een nieuw product, dat na massaspectrometrie analyse, exact de-zelfde massa en retentie tijd had als de standaard. Uit verdere karakterisatie bleek dat de chemische structuur van het gesynthetiseerde product niet volle-dig overeenkwam met de voorspelde structuur. De ontworpen peptide binding tussen de hydroxyphenylglycine en de cysteïne was een thio-ester in plaats van een ester. Desalniettemin hebben we aangetoond dat de implementatie van COM-domeinen voor secundaire metaboliet productie heeft geleid tot een
in vivo functioneel hybride NRPS enzyme in P. chrysogenum. Om de natuurlijke
capaciteit van P. chrysogenum verder te onderzoeken hebben we het al eerder gekarakteriseerde MLP (betrokken bij de modules en domeinen uit hoofdstuk II) geïntroduceerd in dit organisme. De resultaten van deze experimenten, be-sproken in hoofdstuk VI, laten een duidelijk patroon zien. Waar met de intro-ductie van MLPs een verhoogde concentraties van secundaire metaboliet wor-den geproduceerd in de stammen waarin één penicilline cluster is geïntroduceerd (DS47274), leidt de aanwezigheid van meerdere bio-syntheti-sche clusters tot vervroegde penicilline productie via sterk verbeterde kinetiek. Dit effect lijkt specifiek te zijn voor NRPS systemen en is de eerste waarne-ming van verbeterde NRPS peptide formatie in schimmels na co-expressie met een prokaryotische MLP.
In dit proefschrift hebben wij aan de ene kant laten zien dat er een enorm potentieel zit in de engineering en productie van nieuwe (van NRPS afkom-stige) secundaire metabolieten, maar dat er aan de andere kant vele kritieke vereisten zijn voor NRPS substraat specificiteit, waardoor vele modificaties nog onbekend zijn. De technieken beschreven in dit proefschrift die gebruikt zijn voor de engineering van een nieuwe NRPS zijn zeer breed toepasbaar. De beschreven adenylatie experimenten laat zien dat de domeinen zeer specifiek zijn en gevoelig voor modificatie waardoor al snel de activiteit verloren gaat. Daarnaast kan de genomische integratie van MLP potentieel de opbrengst en kinetiek van secundaire metaboliet vorming in industriële stammen ver-hogen, de productie van metabolieten verbeteren en zou zelfs kunnen wor-den geïmplementeerd voor de over-expressie van slapende of versleutelde NRPS clusters. Bovendien heeft ons werk aangaande de engineering van NRPS laten zien dat de vervanging van gehele domeinen en/of modules erg gecompliceerd is. Vandaar dat in de toekomst een meer directe aanpak van de sub-domeinen of specifieke plaatsen in deze sub-domeinen tot beter re-sultaat zou kunnen leiden. Uiteraard zal de beschikbaarheid van structurele informatie van een bepaald NRPS, zoals potentiele interfaces, dynamiek en positionering van de domeinen en substructuren binnen een multi-modulair
203
N
ederlandse samenvatting
7
enzym, het mogelijke succes van dergelijke benaderingen kunnen faciliteren. Oftewel, toekomstige methoden zouden de potentieel specifieke interacties tussen domeinen moeten betrekken bij de engineering. Hiervoor zal een 3D weergave van de structuur van een multi-modulair NRPS nodig zijn, bij voor-keur van meerdere metabolische intermediaire varianten. Dit zal in de toe-komst echter een uitdagende taak blijven, aangezien NRPS grote dynamische complexen zijn, waardoor het achterhalen van de structuur gecompliceerd is. Echter, de methoden beschreven in dit proefschrift, die geleid hebben tot een semi-verfijnde structuur, zullen ongetwijfeld bijdragen aan de ophelde-ring van een complete structuur van deze en andere multi-modulaire NRPS. Uiteindelijk zullen deze nieuwe inzichten de NRPS engineering versimpelen en waardoor deze op den duur toegankelijk worden voor de ontwikkeling van een geheel nieuwe generatie van nieuwe enzymen, synthese routes en bioac-tieve stoffen. Hiermee ligt de duurzame productie van nieuwe antibiotica en andere bioactieve stoffen met brede toepasbaarheid in het verschiet.
Referenties
1. Wang H, Fewer DP, Holm L, Rouhiainen L, Sivonen K. Atlas of nonribosomal peptide and polyketide biosynthetic pathways reveals common occurrence of nonmod-ular enzymes. Proceedings of the Na-tional Academy of Sciences of the United States of America. 2014. pp. 9259–9264. doi:10.1073/pnas.1401734111
2. Marahiel MA, Stachelhaus T, Mootz HD. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis. Chem Rev. American Chemical Society; 1997;97: 2651–2674.
doi:10.1021/cr960029e
3. Caboche S, Pupin M, Leclère V, Fontaine A, Jacques P, Kucherov G. NORINE: a da-tabase of nonribosomal peptides. Nu-cleic Acids Res. 2008;36: D326-31. doi:10.1093/nar/gkm792
4. Weber T, Marahiel MA. Exploring the Domain Structure of Modular
Nonribosomal Peptide Synthetases. Structure. 2001;9: R3–R9.
doi:10.1016/S0969-2126(00)00560-8 5. Reger AS, Wu R, Dunaway-Mariano D,
Gulick AM. Structural characterization of a 140 degrees domain movement in the two-step reaction catalyzed by 4-chlorobenzoate:CoA ligase. Biochem-istry. 2008;47: 8016–25.
doi:10.1021/bi800696y
6. Beld J, Sonnenschein EC, Vickery CR, Noel JP, Burkart MD. The phosphopan-tetheinyl transferases: catalysis of a posttranslational modification crucial for life. Nat Prod Rep. 2014;31: 61–108. doi:10.1039/c3np70054b
7. Sundaram S, Hertweck C. On-line enzy-matic tailoring of polyketides and pep-tides in thiotemplate systems. Curr Opin Chem Biol. England; 2016;31: 82–94. doi:10.1016/j.cbpa.2016.01.012
204
7
N
ederlandse samenvatting
8. Winn M, Fyans JK, Zhuo Y, Micklefield J. Recent advances in engineering non-ribosomal peptide assembly lines. Nat Prod Rep. The Royal Society of Chemis-try; 2016;33: 317–347.
doi:10.1039/C5NP00099H
9. Bode HB, Brachmann AO, Jadhav KB, Seyfarth L, Dauth C, Fuchs SW, et al. Structure elucidation and activity of kolossin A, the D-/L-pentadecapeptide product of a giant nonribosomal pep-tide synthetase. Angew Chem Int Ed Engl. Germany; 2015;54: 10352–10355. doi:10.1002/anie.201502835
10. Yin X, Zabriskie TM. The enduracidin biosynthetic gene cluster from Strep-tomyces fungicidicus. Microbiology. 2006;152: 2969–2983.
doi:10.1099/mic.0.29043-0
11. Hoertz AJ, Hamburger JB, Gooden DM, Bednar MM, McCafferty DG. Studies on
the biosynthesis of the lipodepsipeptide antibiotic ramoplanin A2. Bioorganic Med Chem. Elsevier Ltd; 2012;20: 859–865. doi:10.1016/j.bmc.2011.11.062 12. Engler C, Gruetzner R, Kandzia R,
Maril-lonnet S. Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type ils restriction enzymes. PLoS One. 2009;4: e5553.
doi:10.1371/journal.pone.0005553 13. Marahiel MA. A structural model for
multimodular NRPS assembly lines. Nat Prod Rep. England; 2016;33: 136–140. doi:10.1039/c5np00082c
14. Hahn M, Stachelhaus T. Harnessing the potential of communication-mediating domains for the biocombinatorial syn-thesis of nonribosomal peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. National Academy of Sciences; 2006;103: 275–80. doi:10.1073/pnas.0508409103
