nitrite reductase
Wijma, Hein Jakob
Citation
Wijma, H. J. (2006, February 9). Catalytic mechanism and protein engineering of
copper-containing nitrite reductase. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/4302
Version:
Corrected Publisher’s Version
License:
Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the
Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from:
https://hdl.handle.net/1887/4302
Summary
The copper-containing nitrite reductase features an electron transfer site (type-1) and a catalytic site (type-2). In the introduction electron transfer and Cu proteins are briefly introduced (chapter 1) while structure, diversity, catalytic mechanism, and other catalytic features of copper-containing nitrite reductases are critically reviewed in chapter 2.
The catalytic mechanism is currently under discussion and therefore this aspect of the enzyme was investigated. The main findings are a) the enzyme is capable of catalyzing forward as well as reverse reaction at a fast rate (chapter 3); b) under physiological conditions, the equilibrium of the catalyzed reaction strongly favors the substrates (chapter 3); c) the rate of internal electron transfer from type-1 to the type-2 site is rate-limiting (chapter 4 and chapter 5); d) the kinetics as function of pH and [NO2-] can be understood assuming that the free coordination position at the type-2 copper can be occupied by water, hydroxide or nitrite, and that the rate of internal electron transfer decreases according to H2O > NO2- > OH- (chapter 4); e) nitrite binds both to the oxidized and to the reduced type-2 site which results in two parallel catalytic routes (random-sequential mechanism, chapter 4); f) consequently, the steady state kinetics are characterized by two M ichaelis constants, and two velocity constants; g) the reduced type-2 site has two conformations one of which is inactive (chapter 5); h) the isomerization between the inactive reduced state and the active reduced state is far slower (§ 0.2 s-1, chapter 5) than the turnover rate of the NiR (1.5 × 103 s-1 at pH 6). These findings are new or are at variance with earlier ideas about the catalytic mechanism. In a broader sense, these results contribute to a better understanding of copper-assisted catalysis by enzymes.
(chapter 8). The most remarkable finding is that a copper-containing redox site could be brought under allosteric control.
Gearfetting
De gemyske prosessen dy’t yn de libbene natuer plakfine wurde mooglik makke troch ensimen. Ensimen hearre ta de katalysators: guon gemyske omsettings wurde dêrtroch fersneld. Ensimen bine in útgongsstof wêrnei’t de persys definiearre omjouwing yn it ensym de gemyske reaksje mooglik makket. Nei reaksje lit it foarme produkt wer los fan it ensym. It ensym kin dan wer in nije molekule fan de útgongsstof bine.
It ûndersyk oan ensimen hat laat ta in soad medyske en technyske tapassings en it is ûnwierskynlik dat wy al oan ‘e ein fan dizze ûntwikkeling kaam binne. Op himsels jout dit genôch oanlieding ta fierder ûndersyk. Fierder is it mooglik om nije funksjes te yntrodusearjen yn ensimen troch de feroaring fan de struktuer fan it ensym. Dizze technyk is bekend ûnder de namme “protein engineering”.
Koperhâldend nitrytreduktase (NiR) katalysearret de ien-elektron reduksje fan nitryt ta stikstofmonokside (NO2- + 2H+ + e-ĺ NO + H2O). De twa koper atomen yn NiR komme sawol foar yn de Cu1+ as yn ‘e Cu2+ foarm. Hjirby kinne hja dus ien elektron tydlik opnimme. Ien fan ‘e koper atomen yn NiR is bûn yn in saneamde type-1 biningsplak dat noadich is om oan elektronen te slagjen en troch te jaan oan it twadde koper atoom. It twadde koper atoom is bûn yn in “type-2 plak” en hjirre kryt de reaksje syn beslach. Yn haadstik ien wurdt elektronoerdracht en koper yn ensimen koart yntrodusearre, wylst yn haadstik twa in kritysk oersicht jûn wurdt fan ‘e literatuer op it mêd fan koperhâldend nitrytreduktase.
Hoe’t NiR de omsetting fan nitryt ta stikstofmonokside katalysearret is noch net folslein dúdlik. Dêrom is dit ûndersocht lykas beskreaun yn haadstik 3 o/m 5. De befinings wiene: a) NiR kin ek de tebekreaksje katalysearje. b) Nitryt kin sawol bine oan ‘e Cu1+ foarm as oan ‘e Cu2+ foarm fan in type-2 plak. c) de Cu1+ foarm fan in type-2 plak bestiet yn twa ferskillende tastannen, dêr’t ien fan gjin nitryt bynt. Dizze befinings binne nij of stridich mei besteande ideeën oer it katalytysk meganisme fan NiR. De nije kennis soe brûkt wurde kinne by de ûntwikkeling fan nitryt bepalings. Yn wider ferbân drage dizze ûntdekkings by ta it begripen fan de troch koper assistearre katalize yn ensimen.
Samenvatting
De chemische processen die in levende wezens plaatsvinden, worden mogelijk gemaakt door enzymen. Enzymen zijn katalysators: ze versnellen bepaalde chemische omzettingen. Enzymen binden een uitgangsstof waarna de nauwkeurig gedefinieerde omgeving in het enzym de chemische reactie mogelijk maakt. Na reactie laat het gevormde product weer los van het enzym. Het enzym is dan beschikbaar voor het binden van een nieuw molecuul van de uitgangsstof.
Het onderzoek aan enzymen heeft geleid tot vele medische en technische toepassingen en het is onwaarschijnlijk dat we al aan het einde van deze ontwikkeling zijn gekomen. Op zichzelf is dit voldoende aanleiding voor verder onderzoek. Verder is het mogelijk om nieuwe functies te introduceren in enzymen door de structuur van het enzym aan te passen. Deze techniek staat bekend als “protein engineering”.
Koperbevattend nitrietreductase (NiR) katalyseert de één-elektron reductie van nitriet tot stikstof monoxide (NO2- + 2H+ + e-ĺ NO + H2O). De twee koperatomen in NiR komen zowel voor in de Cu1+als in de Cu2+ vorm. Hierbij kunnen ze dus één elektron tijdelijk opnemen. Eén van de koperatomen is gebonden in een zogenaamde type-1 bindingsplaats (“site”) die nodig is om elektronen te verwerven en over te dragen aan het tweede koperatoom. Het tweede koperatoom is gebonden in een zogenaamde type-2 site en hier is het dat de reactie plaatsvindt. In hoofdstuk 1 word elektronoverdracht en de eigenschappen van koper in enzymen kort geïntroduceerd waarna in hoofdstuk 2 een kritisch overzicht wordt gegeven van de literatuur over koperbevattend nitrietreductase.
