Mela, F.
Citation
Mela, F. (2011, February 22). Genomic analysis of bacterial mycophagy.
Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/16531
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/16531
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting
De bestudering van bacterie-schimmel interacties is essentieel voor een beter begrip van de terretrische microbiële ecologie, en kan aan de basis liggen van nieuwe toepassingen voor de landbouw, de voedingindustrie en geneeskunde. Desalnietemin zijn zowel de stimuli, de genetische determinanten als de onderliggende mechanismen van bacterie-schimmel interacties nog steeds nauwelijks gekend. Bacteriële mycofagie is een trofisch gedrag dat plaatsvindt als bacteriën voedingsstoffen onttrekken aan levende schimmelhyfen, waarbij biomassa van de levende schimmel wordt omgezet in bacteriële biomassa (29). Dit trofisch gedrag is voor het eerst aangetoond bij het bacteriële genus Collimonas, waarbij de bacteriën in een bodem microcosmexperiment in staat bleken te kunnen groeien ten koste van levende schimmels (28, 30). In deze thesis worden de volgende onderzoeksvragen gesteld: (1) Welke van de mechansismen mogelijks betrokken bij Collimonas mycofagie worden geactiveerd tijdens de interactie van Collimonas met een schimmel? (2) Wat is de reactie van de schimmel op de aanwezigheid van de Collimonas bacteriën? (3) Welke rol speelt het pTer331 plasmide, aangetoond in het genoom van de mycofage bacterie C. fungivorans Ter331, in de ecologie van deze bacterie en zijn de genen van het pTer331 plasmide betrokken bij mycofagie? (4) Zijn de potentiële determinanten voor mycofagie uniform verspreid over alle Collimonas soorten?
Het modelorganisme C. fungivorus Ter331 vertoont een antagonistische interactie tegenover de schimmel Aspergillus niger. Wanneer beide organsimen in vitro met elkaar geconfronteerd worden is de schimmelgroei geremd, en wordt groei van de bacteriële biomassa in de vorm van slijm op de petrischaal waargenomen. Voor een beter mechanistisch begrip van het antagonisme van de Collimonas bacteriën tegenover schimmels, de betrokkenheid van het mycofage fenotype en de reactie van de schimmel op de aanwezigheid van Collimonas, werd bacterie- en schimmel-RNA op twee tijdspunten gedurende de interactie geïsoleerd en vervolgens analyseerd met behulp van microarrays. Het experiment leverde een lijst op van genetische determinanten die geactiveerd werden in beide organismen ten gevolge van
hun interactie. De aanwezigheid van de schimmel stimuleerde de expressie van verscheidene bacteriële genen, waaronder genen betrokken bij beweeglijkheid, synthese van exopolysacchariden en potentieel antimicrobiële agentia. Bovendien activeerde de aanwezigheid van de schimmel genen betrokken bij de consumptie van substraten afkomstig van schimmels, wat er op duidt dat de productie van het bacteriële slijm, dat wordt waargenomen op de petrischalen, gevormd is door een conversie van schimmelbiomassa in bacteriële biomassa. Hoewel het verband tussen mycofagie en antischimmelactiviteit nog niet is opgehelderd, ondersteunen deze bevindingen het bestaan van een gemeenschappelijke factor tussen antischimmelactiviteit en mycofagie. In de schimmel werden transcriptionele veranderingen waargenomen bij genen betrokken bij vet- en celwandmetabolisme en celdefensie. Dit resultaat correleert goed met de microscopisch waargenomen misvormingen van de hyfes. De transcriptionele profielen vertonen bij beide partners signalen van stress, wat erop wijst dat de interactie tussen Collimonas en Aspergillus gekarakteriseerd wordt door een complexe wisselwerking van trofie, antibiose en competitie voor nutriënten. Deze bevinding zou kunnen wijzen op de mogelijkheid dat de specifiek in dit experiment gebruikte bacterie- schimmel interactie Collimonas niet toelaat om zijn mycofage determinanten ten volle tot expressie te brengen. Toekomstige experimenten waarbij Collimonas met andere schimmelsoorten wordt geconfronteerd zal ons inzicht in de genetische determinanten van mycofagie vergroten (Hoofdstuk 2).
Plasmide pTer331 werd geïsoleerd uit zijn natuurlijke gastheer C.
fungivorans Ter331. De functie van dit plasmide voor de ecologie van de bacterie en in het bijzonder zijn mycofage fenotype werd onderzocht door het bestuderen van de coderende capaciteit en verspreiding van het plasmide onder de Collimonas stammen, die aanwezig zijn in onze collectie.
Sequentie annotatie van pTer331 leverde 44 potentiële genen op die hoofdzakelijk betrokken zijn bij de replicatie, verdeling en transfer van het plasmide. Dit suggereert dat pTer331 een cryptisch plasmide is dat geen duidelijke fenotypische kenmerken aan zijn gastheer verleent. De
onmogelijkheid tot het detecteren van het pTer331 plasmide bij andere stammen dan C. fungivorans Ter331 wees erop dat het plasmide geen rol speelt bij gemeenschappelijke kenmerken van alle Collimonas stammen, waaronder antischimmelactiviteit en mycofagie, verwering en chitine afbraak. De hypothese dat pTer331 een selectief voordeel voor de kolonisatie van de plantenrhizosfeer kan opleveren werd onderzocht door het verkrijgen van een plasmidevrije stam en het vergelijken van de prestaties van deze stam met die van het wild type bij het koloniseren van de rhizosfeer van tomatenplanten. Het plasmide leverde geen significante bijdrage aan de competentie van C. fungivorans Ter331 tot het groeien in de rhizosfeer. De aanwezigheid op het plasmide van een hot-spot voor insertie van bijkomende genetische modules suggereert dat dit cryptisch plasmide mogelijk incidenteel genen verwerft die nuttig zijn voor de gastheeroverleving, en daardoor zijn eigen voortbestaan en verspreiding binnen de bacteriële populatie versterkt. Het bestaan van pTer331-verwante plasmiden die bijkomende genen bevatten die voordelig zijn voor de gastheer ondersteunt de hypothese dat het pTer331-plasmide mogelijks een minimale plasmidevorm is dat in sommige omstandigheden bijkomende genen verwerft (Hoofdstuk 3).
Collimonas is een genus van bodembacteriën dat drie erkende soorten bevat:
C. fungivorans, C. pratensis en C. arenae. De bacteriën behorend tot dit genus hebben allen de mogelijkheid tot het afbreken van chitine en het zich voeden op levende schimmelhyfae (mycofagie), maar ze verschillen in hun koloniemorfologie, fysiologische eigenschappen en antischimmelactiviteit.
Vergelijkende genomische hybridisatie op microarrays werd gebruikt om inzicht te verwerven in de genetische achtergrond van de fenotypische variabiliteit van de collimonads. Met behulp van microarray technologie werd de genomische inhoud van de referentiestam C. fungivorans Ter331 vergeleken met die van 4 stammen representatief voor de drie Collimonas soorten. Zowel een set van sterk geconserveerde als sterk variabele genen werd geïdentificeerd, wat een lijst opleverde van kandidaat genen onderliggend aan de gemeenschappelijke en variabele kenmerken van de Collimonas bacteriën. Hoewel mycofagie een karakteristiek kenmerk is van
alle Collimonas stammen, vertoonden verscheidene genetische determinanten, die betrokken zijn bij bacteriële mycofagie een onregelmatige verdeling onder de geannalyseerde stammen. Deze determinanten betroffen het bezit van beweeglijkheid, secretie van bioactieve componenten en de mogelijkheid om op van schimmels afkomstige substraten te groeien. Deze bevinding suggereert dat sommige genetische determinanten, die potentieel betrokken zijn bij mycofagy in C.
fungivorans Ter331, mogelijk afwezig zijn in andere stammen, maar dat deze stammen waarschijnlijk andere determinanten voor mycofagie bezitten. Een steeds groter wordende reeks argumenten wijst erop dat verscheidene genen en genfuncties additioneel bijdragen aan het mycofaag gedrag, en dat geen enkele van deze genetische determinanten alleen strict noodzakelijk is voor mycofagie. Onze hypothese is dat het bezit van een verschillende collectie van deze genetische determinanten aan de basis ligt van de specialisatie van de Collimonas stammen voor bepaalde schimmelgastheren (Hoofdstuk 4).
De resultaten verkregen in dit onderzoek leveren een bijdrage aan ons inzicht betreffende de interacties tussen bacteriën en schimmels; een onderwerp dat ondanks zijn potentieel belangrijke toepassingen in natuurbeheer, landbouw en geneeskunde relatief verwaarloosd is.
