University of Groningen Exploring and exploiting bacterial protein glycosylation systems Yakovlieva, Liubov

(1)

University of Groningen

Exploring and exploiting bacterial protein glycosylation systems

Yakovlieva, Liubov

DOI:

10.33612/diss.173544104

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2021

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Yakovlieva, L. (2021). Exploring and exploiting bacterial protein glycosylation systems. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.173544104

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

561536-L-bw-Yakovlievla 561536-L-bw-Yakovlievla 561536-L-bw-Yakovlievla 561536-L-bw-Yakovlievla Processed on: 11-6-2021 Processed on: 11-6-2021 Processed on: 11-6-2021

Processed on: 11-6-2021 PDF page: 237PDF page: 237PDF page: 237PDF page: 237

N

EDERLANDSE

SAMENVATTING

(3)

NEDERLANDSE SAMENVATTING

230

Het overkoepelende doel van het werk zoals beschreven in dit proefschrift was het onderzoeken van de mechanistische aspecten van twee niet-standaard bacteriële N-glycosyltransferases – ApNGT van Actinobacillus pleuropneumoniae en HiNGT van Haemophilus influenzae, en EarP van Pseudomonas aeruginosa. ApNGT en HiNGT hyperglucosyleren het bacteriële adhesine-eiwit, waarbij ze asparagineresiduen decoreren met simpele glucose-eenheden. Dit is belangrijk voor de adhesinestabiliteit en het binden van H. influenzae bacteriën aan menselijke epitheelcellen tijdens kolonisatie. EarP modificeert één specifiek arginineresidu van het cytosolische verlengingsfactor P-eiwit (EF-P) met de bacteriële suiker L-rhamnose. Hierdoor is EF-P in staat het ribosoom te activeren om polyprolineketens te vormen tijdens de eiwitsynthese. Beide glycosyleringssystemen zijn belangrijk voor de virulentie of fitheid van bacteriële pathogenen, en representeren zeer unieke eiwitglycosyleringssystemen. Het begrijpen van de mechanistische basis van de betrokken enzymen zal bijdragen aan het potentiele gebruik van deze systemen voor nieuwe antibacteriële aangrijpingspunten.

Hoofdstuk 1 bestaat uit een algemene introductie van

eiwitglycosylering en dit Proefschrift. In Hoofdstuk 2 wordt het fenomeen van processiviteit in bacteriële glycosyltransferases besproken. Verschillende voorbeelden van glycoconjugaten worden bediscussieerd die door processieve glycosyltransferases gesynthetiseerd worden, met een specifieke focus op de verschillende methoden om processieve mechanismen te bestuderen. Een aparte sectie is gewijd aan processieve eiwitglycosyltransferases, die over het algemeen in eerste instantie meestal niet onderzocht worden op processief gedrag.

In Hoofdstuk 3 wordt het mechanisme van de hyperglycosylering van het adhesine-eiwit onderzocht om te begrijpen of de hyperglycosering van dit eiwit processief of distributief is. Door het onderzoeken van reactieproductprofielen met behulp van intacte-eiwit massaspectrometrie en door het uitvoeren van kinetische- en affiniteitsstudies werd bepaald dat het mechanisme van het NGT-enzym omschreven kan worden als semiprocessief. In het geval van NGT-gekatalyseerde hyperglycosylering van het HMW1ct adhesine verloopt de snelle initiële fase van de reactie volgens een processief mechanisme, dat vervolgens wordt geremd door productinhibitie. Dit leidt tot een switch in het mechanisme en een vertraging in het vormen van het uiteindelijke product. Door het uitvoeren van proteomics experimenten zijn glycosyleringsplaatsen waarvoor NGT een hoge voorkeur heeft geïdentificeerd die vooral aanwezig zijn in de toegankelijke lussen van het substraateiwit en in grote nabijheid van elkaar. Tot slot onthulden de moleculaire dynamica

(4)

231

simulaties van een glycopeptide (gebaseerd op de sequentie van HMW1ct) in het actieve centrum van het NGT-enzym de mogelijkheid voor bi-directe binding van het substraat. Bovendien is er de mogelijkheid voor het substraat om door het actieve centrum te schuiven om modificatie zonder dissociatie te bereiken. Samen kunnen deze bevindingen de moleculaire basis voor processief gedrag van het NGT-enzym verklaren, en tonen voor het eerst het processieve karakter van een N-glycosyltransferase-eiwit aan. Potentieel verklaart dit hoe toereikende niveaus van adhesinehyperglycosylering bereikt worden in vivo en geeft dit nieuwe mogelijkheden voor verschillende biotechnologische toepassingen.

Het NGT-HMW1ct glycosyleringssysteem is verder gebruikt in

Hoofdstuk 4 voor het uitvoeren van azidoglucoselabeling van HMW1ct. Het is

gepostuleerd dat het hypergeglucosyleerde adhesine-eiwit zich gedraagt als een exo-antigeen tijdens het induceren van de auto-immuunrepons in multiple sclerosis (MS).1_{In dit Hoofdstuk werd azidoglucose-HMW1ct in vitro} gegenereerd met als doel het te gebruiken als gereedschap voor het bestuderen van MS antigenopname en -presentatie. Een selectie van UDP-azidoglucoses werd gesynthetiseerd om gebruikt te worden in combinatie met het ApNGT-HMW1ct systeem: UDP-2AzGlc, UDP-3AzGlc, UDP-4AzGlc. UDP-6AzGlc is commercieel verkregen. Terwijl UDP-2AzGlc en UDP-6AzGlc geen geschikte donorsubstraten bleken te zijn voor ApNGT was het met 3AzGlc en

UDP-4AzGlc mogelijk om meerdere azidoglucose-eenheden in het HMW1ct eiwit te

incorporeren. De optimale condities van een 1:1 (molaire) ratio van enzym:eiwit en incuberen voor drie dagen resulteerde in een mengsel van HMW1ct met twee, drie, en vier azidoglucose-eenheden. Proteomics analyse liet zien dat incorporatie van AzGlc gebeurde op de glycosyleringsplaatsen die aanwezig zijn in de toegankelijke lussen van de voorspelde structuur van HMW1ct. Om inzicht te krijgen in de verschillen in reactiviteit van de UDP-AzGlc-analogen in de glycosyleringsreactie werden zogenaamde “docking” en moleculaire dynamica simulaties uitgevoerd. Deze studies onthulden conformationele verschillen in hoe de verschillende UDP-azidoglucoses binden in het actieve centrum van ApNGT. Azidoglucose-gelabeled HMW1ct (een combinatie van twee-, drie-, en vier-keer geïncorporeerd AzGlc) werd geïsoleerd en wordt op het moment bestudeerd in bindingsstudies met MS-antilichamen (ELISA).

Als de binding van MS-antilichamen aan azidoglucose-gelabeled HMW1ct bevredigend is, kunnen verdere studies in antigenopname en -presentatie worden uitgevoerd. Het is gebleken dat glycaaneenheden van glyco-eiwitten een belangrijke rol spelen in het verwerken van een antigen, zowel

(5)

232

indirect via stabilisatie van de peptidestructuur en bescherming tegen proteases, als direct als immunogene epitopen in de T-cell herkenning.2_{De stappen waaruit} het verwerken van antigenen bestaat kunnen gevisualiseerd worden door een klikreactie uit te voeren met een fluorofoor en proteolytische AzGlc-HMW1ct fragmenten kunnen vervolgens geïsoleerd worden door conjugatie met een affiniteitslabel. Om te beginnen zou de in vitro proteolyse van AzGlc-HMW1ct door lysosomale extracten onderzocht kunnen worden om te identificeren welke (azidoglucose)peptidefragmenten worden gegenereerd.3_{Verdere studies met} humane cellen kunnen worden uitgevoerd voor het identificeren van antigene peptiden zoals al eerder beschreven is voor fluorescent-gelabelde subtilisine.4

Hoofdstuk 5 beschrijft preliminaire studies naar het onderzoeken van

de multimere structuren van het ApNGT/HiNGT-HMW1ct systeem. Gebaseerd op de initiële observatie van een molecuulgewicht dat duidde op een dimere structuur van ApNGT in natieve-eiwit MS werden verdere studies gedaan om oligomere structuren van ApNGT, HiNGT, (Glc-) HMW1ct en combinaties daarvan te onderzoeken. Deze studies bestonden uit blauwe natieve PAGE en SEC/SEC-MALLS experimenten. In blauwe natieve PAGE en SEC werden multimeren van ApNGT, HiNGT en (Glc-) HMW1ct gevonden, in vergelijking met eiwitstandaarden die werden opgenomen in dezelfde experimenten. Exacte molecuulgewichten van deze eiwitten werden gemeten door het uitvoeren van SEC-MALLS experimenten. Deze analyses onthulden een dimere structuur van ApNGT, een trimere structuur van HiNGT, en een voornamelijk monomere staat van HMW1ct met een kleine fractie van oligomeren met een ongeïdentificeerd molecuulgewicht. Verdere studies zijn nodig om de precieze architectuur van de NGT en HMW1ct oligomeren en hun functionele relevantie voor eiwitglycosylering te bepalen.

Zoals is beschreven in Hoofdstuk 1 en Hoofdstuk 3 zijn ApNGT en HiNGT niet-veelvoorkomende bacteriële glycosyltransferases die onconventionele N-glycosyering van eiwit uitvoeren in het cytoplasma. Deze eiwitglycosylering is van klinische relevantie omdat het niet-typeerbaar

Haemophilus influenzae (NTHi) adherent maakt.5_{Dit pathogeen is de} voornamelijke veroorzaker van ziektes van de hoge luchtwegen geworden sinds de introductie van het vaccin tegen geëncapsuleerd Haemophilus influenzae type b (Hib).6_{Inzicht in het mechanisme en de structuur van de NGT enzymen is} waardevol omdat het kan zorgen voor het ontwikkelen van nieuwe inhibitoren van eiwitglycosylering en een potentiele behandeling tegen NTHi.

In Hoofdstuk 6 wordt een methode voor palladium-gekatalyseerde

(6)

233

organometaalkatalysator [(neocuproine)PdOAc]2OTf2 werd al eerder gebruikt voor het bereiken van regioselectieve C3-oxidatie van glucosiden7_{en de} resulterende keto-groep kon verder gebruikt worden voor het introduceren van verschillende nuttige functionaliteiten.8,9_{In dit Hoofdstuk wordt beschreven} hoe een selectie van glucopeptides is onderworpen aan oxidatiecondities met als gevolg succesvolle oxidatie van de glucose-eenheid. Selectiviteit voor de oxidatie van glucose werd bevestigd door experimenten met een vergelijkbaar galactopeptide uit te voeren, waarbij conversie naar het geoxideerde product alleen plaatsvond bij significant langere reactietijden en een grotere hoeveelheid katalysator (tien eq voor het galactopeptide vs een halve eq Pd cat. voor het glucopeptide). Limitaties van deze oxideringsmethode zijn vooral de oxidatie van de hydroxielgroepen van threonine, wat resulteerde in fragmentatie van de peptiden met meer complexe sequenties en Pd-gemedieerde deglycosylering. De deglycosylering kan succesvol onderdrukt worden door behandeling met een “scavenger” van de Pd-katalysator. De keto-groep op geoxideerde glucopeptiden kan verder getransformeerd worden in een oxiem functionaliteit, die de introductie van variabele interessante groepen mogelijk maakt. De oxidatie-oxiem methodologie werd vervolgens toegepast op het complexe mengsel van tryptische glucopeptides van Glc-HMW1ct. Preliminaire screenings lieten zien dat één eq van Pd-katalysator en 24 h incubatietijd genoeg waren om significante niveaus van oxidatie te bereiken zonder dat degradatie werd gevonden. Verder bleek oxiemformatie ook mogelijk en kon bijvoorbeeld een biotine groep geïntroduceerd worden in bescheiden hoeveelheden vanuit het geoxideerde mengsel van glucopeptides. Concluderend omschrijft dit Hoofdstuk de methodologie voor de modificatie van glucopeptides in een late fase, net zoals selectieve oxidatie en functionalizatie van tryptische glucopeptides voor proteomics analyse.

Hoofdstuk 7 is gewijd aan het ontcijferen van de specifieke elementen

voor substraatherkenning van het bacteriële arginine rhamnosyltransferase

EarP. Dit enzym is verantwoordelijk voor arginine glycosylering, wat een

subtype van N-gekoppelde glycosylering is die uitzonderlijk zeldzaam is en waarvan maar een klein aantal voorbeelden bekend zijn in de natuur.10,11 EF-P-rhamnosylering is belangrijk voor bacteriële fitheid en wanneer dit wegvalt bij

Pseudomonas aeruginosa en Neisseria meningitidis leidt dit tot verschillende

nadelige effecten zoals grotere vatbaarheid voor antibiotica.12,13_{In dit Hoofdstuk} wordt de moleculaire basis voor substraatherkenning door het EarP enzym dat arginine rhamnosylering aanstuurt onderzocht. Door het testen van korte peptide-analogen van het substraateiwit EF-P in de rhamnosyleringsreactie is gebleken dat in het bijzonder de secondaire structuur een cruciale rol speelt in

(7)

234

herkenning. Cyclische ontwerpen die het natuurlijke bèta-haarspeld motief nadoen werden succesvol in vitro gerhamnosyleerd, terwijl ongeorganiseerde en lineaire peptiden geen geschikte substraten bleken voor EarP. Door het testen van verschillende manieren voor het vormen van de bèta-haarspeld en het testen van verschillende peptidelengten, werd het kleinste EF-P fragment tot op heden geïdentificeerd dat nog succesvol kon worden gerhamnosyleerd, namelijk een cyclisch 11-meer peptide. Verschillende mutanten van dit peptide werden getest om de promiscuïteit van EarP te onderzoeken en onthulden een grotere tolerantie van EarP voor variatie in aminozuursequentie dan voor de afwezigheid van secundaire-structuurelementen. Dit is in het bijzonder van belang voor het rationeel ontwerpen van inhibitoren en ook voor het ontwikkelen van gereedschap voor de identificatie van andere bacteriële arginine-rhamnosylerende systemen. Toekomstig werk aan de peptideontwerpen beschreven in dit Hoofdstuk zou kunnen bestaan uit het incorporeren van een additionele bèta-lus (residuen Val53, Phe54, Lys55) voor het verbeteren van de bindingsaffiniteit voor EarP. Verder zou voor het ontwerpen van inhibitoren de minimale bèta-haarspeld gecombineerd kunnen worden met het nucleotide deel van het suiker donorsubstraat (TDP van TDP-Rha) om het actieve centrum van EarP volledig te bezetten.

(8)

235

1. Walvoort, M. T. C.; Testa, C.; Eilam, R.; Nuti, F.; Rossi, G.; Real-Fernandez, F.; Lanzilla, R.; Morra, V. B.; Lolli, F.; Rovero, P.; Imperiali, B.; Papini, A.M. Antibodies from multiple sclerosis patients preferentially recognize hyperglucosylated adhesin of non-typeable

Haemophilus influenzae. Sci. Rep. 2016, 6, 39430.

2. Wolfert, M. A.; Boons, G. -J. Adaptive immune activation: glycosylation does matter. Nat.

Chem. Biol. 2013, 9, 776-784.

3. Villadangos, J. A.; Bryant, R. A. R.; Deussing, J.; Driessen, C.; Lennon-Dumenil, A. M.; Riese, R. J.; Roth, W.; Saftig, P.; Shi, G. P.; Chapman, H.A.; Peters, C.; Ploegh, H. L. Proteases involved in MHC class II antigen presentation. Immunol. Rev. 1999, 172, 109-120. 4. Patil, N. S.; Wong, D. L.; Collier, K. D.; McDonald, H.C. Fluorescent derivatization of a protease antigen to track antigen uptake and processing in human cell lines. BMC

Immunol. 2004, 5, 12.

5. St Geme III, J. W.; Falkow, S.; Barenkamp, S. J. High-molecular-weight proteins of nontypable Haemophilus influenzae mediate attachment to human epithelial cells. Proc.

Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993, 90, 2875–2879.

6. Ladhani, S.; Slack, M. P. E.; Heath, P. T.; von Gottberg, A.; Chandra, M.; Ramsay, M. E.; European Union Invasive Bacterial Infection Surveillance participants. Invasive

Haemophilus influenzae Disease, Europe, 1996–2006. Emerg. Infect. Dis. 2010, 16, 455-463.

7. Jäger, M.; Hartmann, M.; de Vries, J. G.; Minnaard, A. J. Catalytic Regioselective Oxidation of Glycosides. Angew. Chemie Int. Ed. 2013, 52, 7809–7812.

8. Eisink, N. N. H. M.; Lohse, J.; Witte, M. D.; Minnaard, A. J. Regioselective oxidation of unprotected 1,4 linked glucans. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 4859–4864.

9. Marinus, N.; Tahiri, N.; Duca, M.; Mouthaan, L. M. C. M.; Bianca, S.; van den Noort, M.; Poolman, B.; Witte, M. D.; Minnaard, A.J. Stereoselective Protection-Free Modification of 3-Keto-saccharides. Org. Lett. 2020, 22, 5622–5626.

10. Singh, D. G.; Lomako, J.; Lomako, W. M.; Whelan, W. J.; Meyer, H. E.; Serwe M.; Metzger, J. W. beta-Glucosylarginine: a new glucose-protein bond in a self-glucosylating protein from sweet corn. FEBS Lett. 1995, 376, 61–64.

11. Li, S.; Zhang, L.; Yao, Q.; Li, L.; Dong, N.; Rong, J.; Gao, W.; Ding, X.; Sun, L.; Chen, X.; Chen, S.; Shao, F. Pathogen blocks host death receptor signalling by arginine GlcNAcylation of death domains. Nature 2013, 501, 242–246.

12. Rajkovic, A.; Erickson, S.; Witzky, A.; Branson, O. E.; Seo, J.; Gafken, P. R.; Frietas, M. A.; Whitelegge, J. P.; Faull, K. F.; Navarre, W.; Darwin, A. J.; Ibba, M. Cyclic Rhamnosylated Elongation Factor P Establishes Antibiotic Resistance in Pseudomonas aeruginosa. mBio 2015,

6, e00823.

13. Yanagisawa, T; Takahashi, H.; Suzuki, T.; Masuda, A.; Dohmae, N.; Yokoyama, S. Neisseria meningitidis Translation Elongation Factor P and Its Active-Site Arginine Residue Are

(9)

University of Groningen Exploring and exploiting bacterial protein glycosylation systems Yakovlieva, Liubov