Het bepalen van totale IGF-II spiegels in plasma, in combinatie met IGF-I metingen, is relevant voor de diagnostiek van GH-deficiëntie bij kinderen. IGF-II speelt een belangrijke rol bij het ontstaan van diverse typen tumoren, hetgeen een aanknopingspunt kan zijn voor therapieën die er op gericht zijn om lokaal IGF-II en/of IGF-receptoren te inactiveren. Gebleken is dat de detectie van precursorvormen van IGF-II (“big” IGF-II) van essentieel belang is bij de diag- nostiek van non-pancreas-
β-celtumor-geïnduceerde hypoglykemie (NPTH) en de evaluatie van de behan- deling hiervan. Het ligt dan ook in de verwachting dat de recente ontwikkeling van relatief eenvoudig en snel uitvoerbare bepalingen van “big” IGF-II in plasma en andere lichaamsvloeistoffen een bijdrage zal leveren aan verder onderzoek naar de rol van dit eiwit als tumormarker bij tumoren die (nog) niet ge- paard gaan met NPTH.
Trefwoorden: IGF-II, pro-IGF-II, non-pancreas-
β- celtumor-geïnduceerde hypoglykemie
In dit artikel geven wij een beschouwing over de biologische betekenis van insulineachtige groeifactor (IGF)-II, en over de structuur en eigenschappen van het IGF-II-gen en -eiwit. Vervolgens gaan we in op de factoren die van invloed zijn op de concentraties van IGF-II en zijn precursorvormen in de circulatie en het belang van de detectie van deze eiwitten voor de klinische praktijk. IGF-I is aan bod gekomen in een eerder verschenen publicatie (1).
Biologische eigenschappen van IGF-II
IGF-II is een hoofdzakelijk paracrien en autocrien werkende groeifactor die met name een rol speelt tijdens de prenatale groei en ontwikkeling (2-4). In foetale weefsels wordt dan ook een veel hoger ex- pressieniveau gevonden van het IGF-II-gen dan in
weefsels van volgroeide individuen (5, 6). In vitro experimenten met verscheidene celtypen laten zien dat IGF-II betrokken is bij de regulatie van de celpro- liferatie en het intermediair metabolisme (4). IGF-II blijkt ook de snelheid van geprogrammeerde celdood (apoptose) te remmen (3, 4). Daarnaast is IGF-II een belangrijke postnatale factor gebleken bij de regulatie van botturnover en voor het optimaal functioneren van het immuunsysteem en het centraal zenuwstelsel (3, 4). Men denkt dat de biologische effecten van IGF-II, evenals die van IGF-I, vooral tot stand komen na binding aan de type-I-IGF-receptor. De laatste ja- ren is echter duidelijk geworden dat ook interacties met andere receptoren, waaronder de insulinerecep- tor, bijdragen aan het pleiotrope karakter van de IGF- II-activiteit (4). Van de insulinereceptor bestaan, door alternatieve splicing van exon 11 van het insuline- receptorgen, er twee isovormen (A en B) (7). De rela- tieve expressie van beide isovormen is weefsel- specifiek: isovorm A komt met name tot expressie in foetale weefsels, hersenweefsel en hemopoëtische cellen, maar ook in verscheidene typen tumoren. Iso- vorm B overheerst in de belangrijkste doelwitweef- sels voor de metabole effecten van insuline, zoals lever, spieren en vetweefsel (7, 8). Recent onderzoek suggereert dat IGF-II met een relatief hoge affiniteit, 30-40% van die van insuline, kan binden aan isovorm A van de insulinereceptor. Deze interactie leidt via autofosforylering van de receptor voornamelijk tot mitogene effecten (7). De affiniteit van IGF-II voor isovorm B ligt daarentegen meer dan tienvoudig lager. Er bestaat nog een derde type celmembraan- receptor die specifiek IGF-II bindt, namelijk de type- II-IGF/mannose-6-fosfaatreceptor (2,4). Deze receptor lijkt voornamelijk te functioneren bij de endocytose en degradatie van IGF-II (2-4). Daarnaast is de type- II-IGF/mannose-6-fosfaatreceptor betrokken bij het transport van lysosomale enzymen van het Golgi- apparaat naar de lysosomen en kan een interactie aangaan met de biologisch inactieve vorm van trans- formerende groeifactor-
β1 (TGF-
β1), die daarbij ge- activeerd wordt en een groeiremmende werking uit- oefent (4).
IGF-II wordt in tal van organen, met name de lever, gesynthetiseerd en komt voor een deel in de circulatie terecht. Onder normale omstandigheden is vrijwel al het IGF-II, net als IGF-I, in plasma gebonden aan Ned Tijdschr Klin Chem 2002; 27: 163-169
Overzichten
Insuline-achtige groeifactor (IGF)-II:
biologische eigenschappen en de klinische relevantie
J. van DOORN, C.M. HOOGERBRUGGE, M. JANSEN en S.C. van BUUL-OFFERS
Laboratorium voor Endocrinologie, Wilhelmina Kinder- ziekenhuis/Universitair Medisch Centrum, Utrecht
Correspondentie: Dr. J. van Doorn, Laboratorium voor Endo- crinologie, huispostnummer: KE.03.139.2, Wilhelmina Kinder- ziekenhuis/ Universitair Medisch Centrum, Utrecht. Postbus 85090, 3508 AB Utrecht.e-mail: J.vandoorn@lab.azu.nl.
specifieke IGF-bindende eiwitten (IGFBP’s). Hiervan zijn er in totaal zes beschreven (9). IGFBP-2 en –6 binden preferentieel IGF-II. De affiniteit van IGF-I en -II voor de IGFBP’s (Kd ~
-10M) is zelfs hoger dan van de type-I-IGF-receptor (Kd ~
-8M). In de normale situatie vormt meer dan 75% van de IGF’s een complex met het groeihormoon (GH)-afhankelijke IGFBP-3 en een 85-kD-zuurlabiele subunit (ALS) (4, 9). Deze relatief grote (150 kD) complexen kun- nen het capillairmembraan niet passeren, waardoor de verblijfsduur van de IGF’s in de circulatie aanzienlijk wordt verlengd (halfwaardetijd (T1/2): ca 15 uur).
Het overige IGF circuleert in de vorm van binaire complexen met IGFBP-3 of met andere IGFBP’s.
T1/2 van dergelijke complexen in plasma bedraagt ca. 25-30 minuten (4, 9). Slechts een minieme fractie (< 1%) van zowel IGF-I als IGF-II is in de vrije, niet gebonden, vorm aanwezig (T1/2
≈10 min.) (4, 9).
Naast hun transportfunctie moduleren IGFBP’s de beschikbaarheid van IGF’s op cellulair niveau en daarmee het uiteindelijk biologische effect (9). Door specifieke IGFBP-proteasen kan de affiniteit van IGFBP’s voor de IGF’s verlaagd worden, waardoor de groeifactoren beschikbaar komen voor binding aan hun receptoren.
Structuur en eigenschappen van het IGF-II-gen en -eiwit
Het IGF-II gen is gelokaliseerd op chromosoom 11 en normaliter wordt in de meeste celtypen alleen het paternale allel tot expressie gebracht (maternale im- printing) (2, 6, 10). H19, een paternaal ingeprent gen dat eveneens gelokaliseerd is op chromosoom 11 en codeert voor een niet in eiwit vertaald RNA, is be- trokken bij het in stand houden van de imprinting van het IGF-II-gen (2,11). Het IGF-II-gen is 30 kilobase- paren groot, bestaat uit 9 exonen en bevat 4 promoto- ren (figuur 1) (12). Hierdoor kan in principe een scala van IGF-II-mRNA-moleculen gevormd worden met
verschillende 5’-uiteinden. Welke promotor(en) ge- bruikt worden is afhankelijk van het ontwikkelings- stadium en het weefseltype (5). Alleen de exonen 7, 8 en een gedeelte van exon 9 coderen voor het uit 180 aminozuren bestaande pre-pro-IGF-II-precursoreiwit.
Dit eiwit bevat een N-terminaal peptide van 24 aminozuren en een carboxy-terminaal peptide (het zogenaamde E-domein) met een lengte van 89 aminozuren (figuur 1). Verondersteld wordt dat het N-terminale peptide als signaalpeptide functioneert bij het transmembraantransport en tijdens dit proces wordt afgesplitst (13, 14). Het E-domein-peptide wordt na glycosylering van specifieke serine- en threonineresiduen via een aantal, deels nog niet opge- helderde, opeenvolgende enzymatische stappen afge- splitst waarbij het rijpe, 67 aminozuren lange, 7,5 kDa monomere IGF-II-polypeptide overblijft (13, 14). Volledige intracellulaire afsplitsing van het E-do- mein is echter niet noodzakelijk voor secretie. In het plasma en andere lichaamsvloeistoffen wordt, naast het 7,5 kD-IGF-II, een heterogene (zowel wat betreft glycosyleringsgraad als het nog aanwezige deel van het E-domein) fractie 9-15-kD-pro-IGF-II aangetrof- fen. Dit wordt ook wel “big” IGF-II genoemd (15).
Verder is gebleken dat verscheidene celtypen “big”
IGF-II afscheiden in het kweekmedium (16). Er zijn aanwijzingen dat zowel de affiniteit voor de type-I-en -II-IGF-receptoren als de biologische activiteit van
“big” IGF-II vergelijkbaar is met die van 7,5 kD IGF- II (17, 18).
De aminozuursequentie van het 7,5 kD-IGF-II-peptide vertoont 47% homologie met die van pro-insuline.
Door een strikte conservering van de cysteïneresi- duen en de drie resulterende zwavelbrugverbindingen hebben beide eiwitten een vergelijkbare driedimen- sionale structuur (2). De A- en B-domeinen van IGF- II zijn structureel verwant met de A- en B-ketens van insuline. Het C-domein van IGF-II lijkt sterk op het verbindings (C)-peptide van pro-insuline.
Rol van IGF-II bij tumorigenese en - progressie
Tegenwoordig wordt algemeen aangenomen dat IGF- II als paracriene en/of autocriene groeifactor betrok- ken is bij oncogen-geïnduceerde tumorigenese (10).
IGF-II remt apoptose van reeds getransformeerde cel- len en stimuleert bovendien de proliferatie van neo- plastische cellen via activering van de type-I-IGF- receptor of isovorm A van de insulinereceptor (8, 10).
Vergeleken met normaal weefsel wordt in tal van typen tumoren het IGF-II-gen verhoogd tot expressie gebracht, hetgeen met behulp van o.a. in situ hybri- disatie (mRNA) en immunohistochemie (eiwit) kan worden aangetoond (10). Deze bevinding kan der- halve een aanknopingspunt zijn voor therapieën die er op gericht zijn om lokaal IGF-II en/of IGF-recep- toren te inactiveren (10). Hoewel hiervoor tot nu toe maar weinig aanwijzingen gevonden zijn (19, 20), is het niet uitgesloten dat herrangschikkingen, mutaties of andere afwijkingen in het IGF-II-gen kunnen bijdragen tot een hogere transcriptieactiviteit. Bij sommige maligne tumoren heeft men een mutatie of deletie geconstateerd in het gen voor de type-II-IGF/
mannose-6-fosfaatreceptor (21). Wellicht leidt dit tot
Figuur 1. Structuur van het IGF-II-gen en precursor-IGF-II-eiwit. Het IGF-II-gen bevat 4 promotoren (P1-P4). Alleen de exonen 7, 8 en een gedeelte van 9 (gearceerd aangegeven) co- deren voor pre-pro-IGF-II-eiwit. Het N-terminale signaalpep- tide (SP) wordt afgesplitst waardoor pro-IGF-II ontstaat. Het E-domein van het pro-IGF-II wordt via een aantal stappen, waarvan het pro-IGF-II [68-88] een relatief stabiele inter- mediair is die ook in de circulatie voorkomt, afgebroken tot het rijpe uit 67 aminozuren opgebouwde 7.5-kD-IGF-II.
zowel een verminderde endocytose van IGF-II als tot een verminderde activering van TGF-
β1 aan het cel- membraan van neoplastische cellen. Het gevolg is een lokaal verhoogde concentratie van het mitogene IGF-II en een relatief lage concentratie van het biolo- gisch actieve groeiremmende TGF-
β1 (21).
Bij de meeste kinderen met het syndroom van Beckwith-Wiedemann, dat gekarakteriseerd wordt door onder meer foetaal gigantisme, organomegalie en hemihypertrofie, heeft men aangetoond dat er sprake is van een verlies van imprinting van het IGF- II-gen (11, 22). Daardoor bevatten diverse weefsels prenataal aanzienlijk meer IGF-II-mRNA dan nor- maal (23). Patiënten met deze aandoening hebben een 1000-voudig verhoogde kans op het ontwikkelen van embryonale tumoren, zoals Wilms’ tumoren (11). In tal van andere tumoren, zoals het rhabdomyosarcoom, glioom, longcarcinoom, leiomyosarcoom en prostaat- carcinoom blijken de neoplastische cellen eveneens beide IGF-II-allelen tot expressie te brengen, hetgeen mogelijk voorafgegaan wordt door inactivering van het H19-allel (6, 10, 24). Daarnaast gaan Wilms’ tu- moren dikwijls gepaard met een deletie of mutatie van het gen voor Wilms-tumorsuppressoreiwit, WT1.
Normaliter functioneert WT1 als een transcriptiesup- pressorfactor voor zowel het IGF-II-gen (via binding aan de P3-promotor) als het type-I-IGF-receptorgen (6, 25, 26).
Patiënten die besmet zijn met het hepatitis-B-virus lopen een verhoogd risico op het ontwikkelen van een hepatocellulair carcinoom. Het virus produceert een 17-kD-eiwit, HBV-X, dat betrokken is bij de car- cinogenese. HBV-X fosforyleert de transcriptiefactor Sp1, die vervolgens kan binden aan promotor 4 (en waarschijnlijk ook promotor 3) van het IGF-II-gen, waardoor de transcriptieactiviteit wordt verhoogd (27).
Non-pancreas-ß-celtumor-geïnduceerde hypoglycemie Een extreme mate van IGF-II-overproductie ligt ten grondslag aan het zeldzame syndroom van non-pan- creas-
β-celtumor-geïnduceerde hypoglycemie (NPTH).
Doorgaans betreft het hier grote, zowel benigne als maligne (al dan niet gemetastaseerde) tumoren van mesodermale, epitheliale of hemopoietische origine.
Het ziektebeeld wordt gekarakteriseerd door een per- sistent hoge insulineachtige activiteit in het lichaam (28, 29). De lipolyse in vetweefsel is gereduceerd. Er is een enorme toename van het glucoseverbruik door met name skeletspierweefsel, terwijl tegelijkertijd de glucoseproductie door de lever wordt geremd door een sterke afname van de glycogenolyse en gluco- neogenese. Uiteindelijk kan dit resulteren in extreem lage plasmaspiegels van vrije vetzuren en hypoglyke- mie. Een insulinoom kan daarbij worden uitgesloten, aangezien bij patiënten met NPTH de insulinespie- gels in het plasma zeer laag zijn. Bovendien wordt de GH-secretie sterk onderdrukt, waardoor in het alge- meen verlaagde plasma IGF-I- en IGFBP-3-concentra- ties gemeten worden (18, 28). Ondanks de hoge mate van expressie van IGF-II-mRNA door tumorweefsel worden meestal geen verhoogde totale IGF-II-spiegels gevonden. Echter, in tegenstelling tot normaal plasma, blijkt het grootste deel van het IGF-II te bestaan uit
“big” IGF-II (15, 18). In figuur 2 wordt de tegen- woordig gangbare hypothese uiteengezet over het mechanisme dat verantwoordelijk is voor NPTH.
De veranderde kinetiek van IGF’s in de circulatie van patiënten met NPTH verklaart waarom het totale ge- halte van IGF-II in het plasma niet toeneemt. Indien het tumorweefsel niet operatief verwijderd kan wor- den is een efficiënte behandeling van NPTH lastig.
Behandeling met GH, glucagon en/of glucocortico- steroïden kan dan tijdelijk succesvol zijn (28).
Totale IGF-II-spiegels in plasma
Bepalingsmethode
Het totale IGF-II-gehalte in serum of EDTA-plasma wordt in ons laboratorium bepaald met behulp van een radioimmunoassay (RIA) (30). Hierbij wordt ge- bruik gemaakt van een monoklonaal antilichaam dat is gericht tegen een epitoop van het rijpe 7,5 kD IGF-II. Deze IGF-II-RIA maakt dus geen onderscheid
Figuur 2. Hypothetisch model voor het mechanisme van het ontstaan van non-pancreas-β-celtumor-geïnduceerde hypogly- kemie. Het is waarschijnlijk dat in de tumorcellen de machine- rie die betrokken is bij de processing van pro-IGF-II tot het rijpe 7.5 kD IGF-II niet in staat is om het hoge aanbod van precursoreiwit adequaat te verwerken. Hierdoor zal een aan- zienlijke hoeveelheid “big” IGF-II in de circulatie terechtkomen.Big IGF-II competeert met 7.5 kD IGF-II en de relatief ge- ringe hoeveelheid IGF-I voor binding aan de IGFBP’s. Echter in NPTH-plasma blijkt de vorming van het 150-kD-complex ernstig verstoord te zijn. “Big”-IGF-II bindt wel aan IGFBP-3 maar dit complex is vervolgens niet of nauwelijks in staat om ALS te binden. In tegenstelling tot de normale situatie, treft men de IGF’s dus voornamelijk in de vorm van binaire 40-60- kD-complexen aan. Daarnaast is ook de niet-gebonden, vrije, fractie verhoogd. Gezien de veel snellere turn-over van deze complexen in de circulatie veronderstelt men dat de plasma- pool van IGF’s, voor een groot deel dus “big” IGF-II, sneller uitwisselt met de weefselcompartimenten en lokaal de concen- traties sterk zullen toenemen. Het gevolg is dat een sterk insulineachtig effect wordt geïnduceerd, waarschijnlijk via de insulinereceptor (isovorm B). Daarnaast kan men zich voor- stellen, dat door een hoge mate van feedbackremming, de GH- productie door de hypofyse wordt onderdrukt. Hierdoor neemt de synthese van GH-afhankelijke eiwitten zoals IGF-I, IGFBP-3 en ALS eveneens af, waardoor de vorming van het 150-kD-complex nog verder wordt tegengegaan. Uiteindelijk zal, wanneer counterregulatie niet meer kan compenseren, hy- poglykemie ontstaan.
tussen 7,5 kD IGF-II en hoogmoleculaire precursor- vormen van deze groeifactor. Recent wordt het interna- tionale (WHO 96/538) recombinant IGF-II-ijkingpre- paraat als standaard gebruikt (31). In plasmamonsters aanwezige IGFBP’s interfereren met de binding van IGF-II aan het antilichaam. Daarom worden deze eiwitten eerst zo veel mogelijk verwijderd door een extractieprocedure (Sep-Pak C18 kolomchromato- grafie) bij een lage pH, waarbij IGF’s dissociëren van IGFBP’s.
Fysiologische invloeden op de totale IGF-II-concen- tratie in de circulatie
De totale concentratie van IGF-II in de circulatie ver- andert niet gedurende de dag. Bij mannen en vrouwen worden dezelfde spiegels gemeten. Vanaf de geboorte stijgt de IGF-II-spiegel gedurende de eerste 5 levens- jaren, maar verandert daarna niet of nauwelijks meer (figuur 3) (30, 32). Bij volwassenen ligt de totale IGF-II-spiegel in plasma ongeveer een factor 3 hoger dan die van IGF-I.
De invloed van de voedingstoestand op plasma IGF- II is complex. Vasten gedurende een periode van 5 dagen heeft geen effect (33). Bij intensive-care-pa- tiënten die in een ernstig katabole toestand verkeren wordt daarentegen doorgaans een lage IGF-II-con- centratie in het plasma aangetroffen, die samenhangt met gereduceerde IGFBP-3-concentraties (34). Kinde- ren met chronische eiwit- en energie-ondervoeding hebben eveneens sterk verlaagde IGFBP-3- en IGF-II- spiegels (33). Meestal normaliseren deze geleidelijk na realimentatie.
Indicaties voor totaal IGF-II-meting
In tegenstelling tot IGF-I staat de plasma-IGF-II- spiegel niet direct onder invloed van GH. Waarschijn- lijk wordt de concentratie IGF-II in de circulatie voor een belangrijk deel bepaald door de hoeveelheid van de diverse IGF-bindende eiwitten, met name die van het GH-afhankelijke IGFBP-3. Zo worden bij een ern- stige GH-deficiëntie lage spiegels gevonden, die weer
stijgen na GH-behandeling. Acromegalie leidt echter niet tot verhoogde IGF-II-spiegels (35). Door de (be- perkte) GH-afhankelijkheid kan IGF-II gebruikt wor- den als additionele parameter voor GH-deficiëntie.
De combinatie van plasma-IGF-I en -IGF-II-metingen, c.q. de molaire IGF-I/IGF-II-ratio, heeft bij kinderen met kleine gestalte een hogere sensitiviteit en specifi- citeit bij het voorspellen van de GH-piek na een GH- provocatietest dan IGF-I of IGF-II alleen (30, 32).
Bij chronische nierinsufficiëntie (CNI) kan de IGF-II- spiegel verhoogd zijn, waarschijnlijk ten gevolge van een accumulatie van IGFBP’s in het plasma (36). Om- gekeerd worden bij patiënten met chronische lever- ziekten, kinderen met systemische juveniele artritis en volwassenen met reumatoïde artritis meestal ver- laagde plasma-IGF-II-concentraties gevonden (37-39).
Ondanks het feit dat veel typen tumoren IGF-II ver- hoogd tot expressie brengen vindt men doorgaans geen verhoogde totale IGF-II-spiegels in het plasma of cerebrospinaal vocht. Echter, zowel het colorectaal adenoom als carcinoom lijken wel geassocieerd te zijn met een verhoogde totale plasma-IGF-II-spiegel (40, 41).
“Big” IGF-II
“Big” IGF-II in plasma kan geïdentificeerd en semi- kwantitatief bepaald worden met behulp van gelfiltra- tiekolomchromatografie bij lage pH (figuur 4). Circa 10-15% van het totale IGF-II in normaal plasma be- staat uit “big” IGF-II. De diagnose NPTH kan defini- tief gesteld worden wanneer een verhoogde bijdrage (soms meer dan 70%) gemeten wordt (18, 28). Het opnieuw stijgen of niet dalen van de hoeveelheid
“big” IGF-II in het plasma na operatie is indicatief voor een tumorrecidief, zelfs voordat deze met be- hulp van een CT-scan kan worden gezien. Het is niet goed uitgezocht of “big” IGF-II-spiegels in het plasma van kankerpatiënten zonder symptomen van NPTH ook veranderd zijn. In een studie waarin plasmamonsters werden onderzocht van 11 schijnbare gezonde, maar hepatitis-B-virus-positieve patiënten bleek dat er in 4 gevallen sprake was van een verhoogd percentage “big” IGF-II (42). Het is niet bekend of juist deze patiënten een hoger risico hebben op het ontwikkelen van een hepatocellulair carcinoom. Een alternatief voor de bewerkelijke en tijdrovende gel- fitratiemethode is het bepalen van de concentratie E-peptide met behulp van een RIA. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een antilichaam dat is gericht tegen een specifieke sequentie van 15 tot 21 amino- zuren in begin van het E-domein van pro-IGF-II (43, 44). Ook in ons laboratorium is een dergelijke RIA operationeel. Bij gezonde kinderen van 3 tot 14 jaar neemt de concentratie E-peptide in het plasma met de leeftijd ongeveer met een factor 2 toe (43). Bij vol- wassenen ligt de gemiddelde spiegel ca 40% lager.
Patiënten met NPTH hebben een verhoogde concen- tratie E-peptide in de circulatie (43, 44), welke na operatie of embolisatie van de tumor binnen een dag begint af te nemen (45). Ook plasma afkomstig van patiënten met CNI bevat een aanzienlijk grotere hoeveelheid E-peptide dan normaal (43, 44). Een na- deel van de RIA methode is evenwel dat in principe
Figuur 3. Gemiddelde Nederlandse referentiewaarden voor detotale IGF-II- en IGF-I-spiegels in plasma als functie van de leeftijd. Aangezien de totale IGF-II-spiegels voor mannen (M, n = 472) en vrouwen (V, n = 434) niet significant verschillen, zijn deze samengenomen.
zowel E-peptide bevattend “big” IGF-II als vrije frag- menten van het E-domein worden gedetecteerd. Na- dere analyse van CNI-plasma wijst uit dat de ver- hoogde spiegel E-peptide die met RIA gevonden is verklaard kan worden door de accumulatie van vrije fragmenten van het E-domein (figuur 4) (13, 44).
Waarschijnlijk is dit het gevolg van een afgenomen excretie. Ook normaal plasma bevat vrije E-peptide- fragmenten. Deze bevinding illustreert dat de E-pep- tide-RIA weliswaar gebruikt kan worden als meet- instrument voor een eerste screening van plasmamon- sters, maar niet voor het definitief vaststellen van de concentratie “big” IGF-II. Daarom hebben wij recent in ons laboratorium een ELISA (Enzyme Linked Im- munosorbent Assay) ontwikkeld die exclusief “big”
IGF-II aantoont. Hierbij wordt gebruik gemaakt van zowel een antilichaam tegen 7,5-kD-IGF-II als een antilichaam dat een deel van het E-peptide herkent.
Als standaard in deze bepaling wordt een uit Cohn- fractie IV van normaal plasma gezuiverd “big” IGF- II-preparaat gebruikt (46). De ELISA-bepaling wordt uitgevoerd in Sep-Pak-C18-extracten van EDTA- plasma- of serummonsters. Wanneer deze methode wordt toegepast op plasma van patiënten met NPTH en nierdialysepatiënten blijkt dat de spiegels “big”
IGF-II bij laatstgenoemde categorie inderdaad niet verhoogd zijn (tabel 1). In de literatuur wordt ver- meld dat plasmamonsters van patiënten met actieve acromegalie een verhoogd gehalte van het E-peptide bevatten (zoals bepaald met een RIA) (43). In amnion- vocht en zaadvloeistof wordt een relatief hoge con- centratie E-peptide gemeten. Het is echter niet be- kend of het hier om vrije fragmenten of pro-IGF-II gaat. Verder wordt door Daughaday en Trivedi een casus gerapporteerd van een patiënt die chronisch ge- hemodialyseerd werd en na verloop van tijd hypo- glycemie ontwikkelde (47). Het RIA-E-peptidegehalte in het plasma bleek verhoogd te zijn. Echter men kon geen tumor ontdekken. Kolomchromatografische analyse van het plasma wees later uit dat de concen- tratie “big”IGF-II niet verhoogd was. Bovenge- noemde bevindingen illustreren dus dat de door ons ontwikkelde ELISA voor “big”IGF-II niet alleen van belang is voor de diagnostiek en follow-up van NPTH, maar ook perspectieven biedt voor verder onderzoek naar de aanwezigheid van “big” IGF-II in plasma en andere lichaamsvloeistoffen onder normale en patho- fysiologische condities.
Figuur 4. Sep-Pak-C18-extracten van 2 ml plasma werden onderworpen aan Sephadex-G-50-gelfiltratiekolomchromato- grafie. Met behulp van deze methode kunnen eiwitten op grootte gescheiden worden. Eiwitten werden geëlueerd met 0.1 M azijnzuur. De verhouding tussen het elutievolume (Ve) van een eiwit en het totaal volume van de kolom (Vt) is een maat voor de mobiliteit tijdens gelfiltratie. De Ve/Vt-waarden van een aantal eiwitten met een bekend molecuulgewicht die- nen als referentiepunten. In iedere opgevangen fractie werd vervolgens zowel de hoeveelheid IGF-II- (—-•—-) als E-pep- tide- (—-—-) immunoreactiviteit bepaald. A: normaal plasma; B: plasma van een patiënt met een hemangiopericy- toom en NPTH; C: gepooled plasma van patiënten met chro- nisch nierfalen.
Tabel 1. Concentraties van totaal IGF-II, totaal E-peptide en
“big” IGF-II zoals bepaald met behulp van respectievelijk RIA en ELISA, in Sep-Pak-C18-extracten van EDTA-plasmamon- sters afkomstig van verscheidene patiënten met non-pancreas- β-celtumor-geïnduceerde hypoglykemie (NPTH), chronische nierinsufficiëntie (CNI) en gezonde controles.
totaal totaal “big”
IGF-II E-peptide IGF-II (nmol/l) (nmol/l) (nmol/l) NPTH-plasma (n= 9)
gem. ± SD: 102,9 ± 32,4 45,3 ± 15,91 22,6 ± 9,412 range: 42,3 - 103,1 24,7 - 70,0 9,6 - 31,2 CNI-plasma (n=4)
gem. ± SD: 93,7 ± 41,1 26,8 ± 6,53 2,0 ± 0,8 range: 62,5 - 153,7 20,2 - 35,6 1,2 - 2,9
Normaal plasma 51,5 8,4 3,8
(gepooled)
1 p < 0,0001; 2p< 0,001; 3 p< 0,05 (vs. normaal plasma)
Literatuur
1. Van Doorn J, Oltmans HF, Wit JM, Van Buul-Offers SC, Jansen M, Van den Brande JL. De klinische relevantie van de meting van insuline-achtige groeifactoren in het plasma.
Ned Tijdschr Geneeskd 1991; 135: 1730-1735.
2. O’Dell SD, Day INM. Molecules in focus - Insulin-like growth factor II (IGF-II). Int J Biochem Cell Biol 1998;
30: 767-771.
3. Van Buul-Offers SC. Insulin-like growth factor-II in the cycle of life. Biomed Rev 1996; 5: 65-71.
4. Jones JI, Clemmons DR. Insulin-like growth factors and their binding proteins: Biological actions. Endocr Rev 1995; 16: 3-34.
5. Jansen M, Holthuizen P, Van Dijk MA, Van Schaik FMA, Van den Brande JL, Sussenbach JS. Structure and expres- sion of the insulin-like growth factor II (IGF-II) gene. In:
Sara VR, Hall K, Low H, editors. Growth factors From genes to clinical application. New York: Raven Press, 1990: 25-40.
6. LeRoith D, Baserga R, Helman L, Roberts CT, Jr. Insulin- like growth factors and cancer. Ann Intern Med 1995; 122:
54-59.
7. Frasca F, Pandini G, Scalia P et al. Insulin receptor isoform A, a newly recognized, high-affinity insulin-like growth factor II receptor in fetal and cancer cells. Mol Cell Biol 1999; 19: 3278-3288.
8. Sciacca L, Costantino A, Pandini G et al. Insulin receptor activation by IGF-II in breast cancers: evidence for a new autocrine/paracrine mechanism. Oncogene 1999; 18: 2471- 2479.
9. Rajaram S, Baylink DJ, Mohan S. Insulin-like growth factor-binding proteins in serum and other biological fluids:
Regulation and functions. Endocr Rev 1997; 18: 801-831.
10. Khandwala HM, McCutcheon IE, Flyvbjerg A, Friend KE.
The effects of insulin-like growth factors on tumorigenesis and neoplastic growth. Endocr Rev 2000; 21: 215-244.
11. Falls JG, Pulford DJ, Wylie AA, Jirtle RL. Genomic imprinting: implications for human disease. Am J Pathol 1999; 154: 635-647.
12. Holthuizen P, Van der Lee FM, Ikejiri K, Yamamoto M, Sussenbach JS. Identification and initial characterization of a fourth leader exon and promoter of the human IGF-II gene. Biochim Biophys Acta 1990; 1087: 341-343.
13. Daughaday WH, Trivedi B. Heterogeneity of serum pep- tides with immunoactivity detected by a radioimmuno- assay for proinsulin-like growth factor-II E domain:
Description of a free E domain peptide in serum. J Clin Endocrinol Metab 1992; 75: 641-645.
14. Duguay SJ, Jin Y, Stein J, Duguay AN, Gardner P, Steiner DF. Post-translational processing of the insulin-like growth factor- 2 precursor - Analysis of O-glycosylation and endo- proteolysis. J Biol Chem 1998; 273: 18443-18451.
15. Haselbacher G, Humbel RE. Evidence of two species of insulin-like growth factor (IGF-II and “big” IGF-II) in human spinal fluid. Endocrinol 1982; 110: 1822-1824.
16. Hudgins WR, Hampton B, Burgess WH, Perdue JF. The identification of O-glycosylated precursors of insulin-like growth factor II. J Biol Chem 1992; 267: 8153-8160.
17. Valenzano KJ, Heath-monnig E, Tollefsen SE, Lake M, Lobel P. Biophysical and biological properties of naturally occurring high molecular weight insulin-like growth factor II variants. J Biol Chem 1997; 272: 4804-4813.
18. Hoekman K, Van Doorn J, Gloudemans T, Maassen JA, Schuller AG, Pinedo HM. Hypoglycaemia associated with the production of insulin-like growth factor II and insulin- like growth factor binding protein 6 by a haemangiopericy- toma. Clin Endocrinol 1999; 51: 247-253.
19. Lambert S, Collette J, Gillis J, Franchimont P, Desaive C, Gol-Winkler R. Tumor IGF-II content in a patient with a colon adenocarcinoma correlates with abnormal expression of the gene. Int J Cancer 1991; 48: 826-830.
20. Irminger JC, Schoenle EJ, Briner J, Humbel RE. Structural alteration of the insulin-like growth factor-II gene in Wilm’s tumour. Eur J Pediatr 1989; 148: 620-623.
21. Wang SN, Souza RF, Kong DH et al. Deficient trans- forming growth factor-Beta1 activation and excessive insulin-like growth factor II (IGFII) expression in IGF-II receptor-mutant tumors. Cancer Res 1997; 57: 2543-2546.
22. Brown KW, Villar AJ, Bickmore W et al. Imprinting muta- tion in the Beckwith-Wiedemann syndrome leads to biallelic IGF2 expression through an H19-independent pathway.
Hum Mol Genet 1996; 5: 2027-2032.
23. Hedborg F, Holmgren L, Sandstedt B, Ohlsson R. The cell type-specific IGF2 expression during early human deve- lopment correlates to the pattern of overgrowth and neo- plasia in the Beckwith-Wiedemann syndrome. Am J Pathol 1994; 145: 802-817.
24. Scharf JG, Dombrowski F, Ramadori G. The IGF axis and hepatocarcinogenesis. Mol Pathol 2001; 54: 138-144.
25. Drummond IA, Madden SL, Rohwer-Nutter P, Bell GI, Sukhatme VP, Rauscher FJ, III. Repression of the insulin- like growth factor II gene by the Wilms tumor suppressor WT1. Science 1992; 257: 674-678.
26. Werner H, Re GG, Drummond IA et al. Increased expres- sion of the insulin-like growth factor I receptor gene, IGF1R, in Wilms tumor is correlated with modulation of IGF1R promoter activity by the WT1 Wilms tumor gene product. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 5828-5832.
27. Lee YI, Lee S, Lee Y et al. The human hepatitis B virus transactivator X gene product regulates Sp1 mediated transcription of an insulin-like growth factor II promoter 4.
Oncogene 1998; 16: 2367-2380.
28. Zapf J. Insulinlike growth factor binding proteins and tumor hypoglycemia. Trends Endocrinol Metab 1995; 6: 37-42.
29. Hoekman K, Van Doorn J, Gloudemans T et al. Tumour- induced hypoglycemia: A case report. Ann Oncol 1994; 5:
277-281.
30. Rikken B, Van Doorn J, Ringeling AM, Van den Brande JL, Massa G, Wit JM. Plasma levels of insulin-like growth factor (IGF)-I, IGF-II and IGF-binding protein-3 in the evaluation of childhood growth hormone deficiency. Horm Res 1998; 50: 166-176.
31. Rafferty B, Rigsby P, Gaines-Das RE. Multicentre colla- borative study to calibrate IGF-II by bioassay and immuno- assay: establishment of the first WHO reference reagent.
Growth Hormone & IGF Research 2001; 11: 18-23.
32. Rosenfeld RG, Wilson DM, Lee PDK, Hintz RL. Insulin- like growth factors I and II in evaluation of growth retarda- tion. J Pediatr 1986; 109: 428-433.
33. Thissen JP, Ketelslegers JM, Underwood LE. Nutritional regulation of the insulin-like growth factors. Endocr Rev 1994; 15: 80-101.
34. Timmins AC, Cotterill AM, Hughes SCC et al. Critical ill- ness is associated with low circulating concentrations of insulin-like growth factors-I and -II, alterations in insulin- like growth factor binding proteins, and induction of an insulin-like growth factor binding protein 3 protease. Crit Care Med 1996; 24: 1460-1466.
35. Van Doorn J, Cornelissen AJFH, Van Buul-Offers SC.
Plasma levels of insulin-like growth factor binding protein- 4 (IGFBP-4) under normal and pathological conditions.
Clin Endocrinol 2001; 54: 655-664.
36. Van Doorn J, Ringeling A, Shmueli SS et al. Circulating levels of human insulin-like growth factor binding protein- 6 (IGFBP-6) in health and disease as determined by radioimmunoassay. Clin Endocrinol 1999; 50: 601-609.
37. Ormarsdottir S, Ljunggren O, Mallmin H, Olofsson H, Blum WF, Loof L. Circulating levels of insulin-like growth factors and their binding proteins in patients with chronic liver disease. Liver 2001; 21: 123-128.
38. Bennett AE, Silverman ED, Miller III JJ, Hintz RL. Insulin- like growth factors I and II in children with systemic onset juvenile arthritis. J Rheumatol 1988; 15: 655-658.
39. Neidel J. Changes in systemic levels of insulin-like growth factors and their binding proteins in patients with rheuma- toid arthritis. Clin Exp Rheumatol 2001; 19, 81-84.
40. Renehan AG, Painter JE, O’Halloran D et al. Circulating insulin-like growth factor II and colorectal adenomas. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 3402-3408.
41. Renehan AG, Jones J, Potten CS, Shalet SM, O’Dwyer ST.
Elevated serum insulin-like growth factor (IGF)-II and IGF binding protein-2 in patients with colorectal cancer. Br J Cancer 2001; 83: 1344-1350.
42. Daughaday WH, Wu J-C, Lee S-D, Kapadia M. Abnormal processing of pro-IGF-II in patients with hepatoma and in some hepatitis B virus antibody-positive asymptomatic individuals. J Lab Clin Med 1990; 116:555-562.
43. Daughaday WH, Trivedi B. Measurement of derivatives of proinsulin-like growth factor-II in serum by a radio- immunoassay directed against the E-domain in normal subjects and patients with nonislet cell tumor hypo- glycemia. J Clin Endocrinol Metab 1992; 75: 110-115.
44. Liu F, Baker BK, Powell DR, Hintz RL. Characterization of proinsulin-like growth factor-II E-region immunoreac- tivity in serum and other biological fluids. J Clin Endo- crinol Metab 1993; 76: 1095-1100.
45. Nanayakkara PWB, Van Doorn J, van den Berg FG, van Groeningen CJ, Pinedo HM, Hoekman K. Treatment of heamangiopericytoma associated hypoglycaemia with embolisation. Eur J Intern Med 2002; in press.
46. Jespersen S, Koedam JA, Hoogerbrugge CM, Tjaden UR, van der Greef J, Van den Brande JL. Characterization of O-glycosylated precursors of insulin-like growth factor II
by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spec- trometry. J Mass Spectr 1996; 31: 893-900.
47. Daughaday WH, Trivedi B. Heterogeneity of serum pep- tides with immunoactivity detected by a radioimmuno- assay of proinsulin-like growth factor-IIE domain:
description of a free E domain peptide in serum. J Clin Endocrinol Metab 1992; 75: 641-645.
Summary
Insulin-like growth factor (IGF)-II: biological properties and clinical relevance. Van Doorn J, Hoogerbrugge CM, Jansen M and Van Buul-Offers SC. Ned Tijdschr Klin Chem 2002; 27:
163-169.
The determination of total IGF-II levels in plasma is useful in the evaluation of GH-deficiency during childhood. IGF-II plays an important role in tumorigenesis. Hence, therapies aimed to inactivate locally IGF-II and/or IGF-receptors could be of clinical relevance. The detection of incompletely pro- cessed precursor forms of IGF-II (“big”IGF-II) is of crucial importance in the diagnosis and follow up of patients with non-islet cell tumour induced hyperglycaemia (NICTH). It is likely that recently developed assays for the determination of
“big” IGF-II in plasma and other biological fluids contribute to further investigations on its role as a tumour marker in the evaluation of tumours which are not (yet) associated with hypoglycaemia.
Keywords: IGF-II, pro-IGF-II, non-pancreas-β cell tumour induced hypoglycemia
