MISCELLANEOUS Samenvatting
List of abbreviations
Curriculum vitae
List of publications
Acknowledgments
Nederlandse samenvatting
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Interacties tussen cellen en de extra-cellulaire matrix (ook wel cel-matrix interacties genoemd) zijn belangrijk voor celoverleving, proliferatie en migratie. Wanneer een primaire tumor eenmaal gevormd is, kunnen meerdere veranderingen binnen deze tumor optreden zoals verlies van interacties tussen cellen onderling en verandering van cel-matrix interacties qua eitwit expressie en dynamiek.
Veranderingen van de eigenschappen van cel-matrix interacties is één van de karakteristieken van epitheliaal-naar-mesenchymale (EMT) transitie. EMT is een cellulair proces waarbij tumor cellen de mogelijkheid verwerven om de primaire tumor te verlaten en ergens anders in het lichaam uitzaaiingen (=metastasen) te vormen. In dit proefschrift beschrijf ik onze bevindingen over de rol van de cel adhesie moleculen focal adhesion kinase (FAK) en paxillin in borstkanker progresssie en de vorming van metastasen. Ten eerste worden de verschillende licht microscopie technieken voor het volgen van migrerende cellen in zowel 2D, 3D en in vivo gepresenteerd. In het bijzonder introduceren we de FLIP-FRAP methode (Fluorescence loss in photobleaching and Fluorescence recovery after photobleaching; ook wel half-FRAP methode genoemd). Deze methode geeft inzicht in de kinetiek van cel-matrix interactie eiwitten in een cel. Het bestuderen van de vorming van metastasen is van belang voor het beter behandelen van kankerprogressie. In dit proefschrift heb ik gebruik gemaakt van een nieuw muis in vivo metastaseringsmodel welke ik in detail heb beschreven. Verder heb ik de relatie tussen het eiwit kinase c-Jun N-terminal kinase (JNK) en paxillin in het migratie- en metastasegedrag van borsttumor cellen bestudeerd.
Een van onze doelen is het bestuderen van het metastaseproces vanuit de primaire tumor: hoe ontvluchten de kankercellen de tumor massa en vooral hoe intravaseren de kankercellen de bloedvaten in de tumor. Om snel te migreren beschikken tumorcellen over kleine cel-matrix adhesies die snel moeten worden gevormd en weer afgebroken (=turnover van cel-matrix adhesies). Om de dynamiek van deze adhesies te bestuderen zijn er verschillende tecknieken beschikbaar. In Hoofdstuk 3 geven we een overview van verscheidene lichtmicroscopie tecknieken met de bijhorende beeldanalyse methoden, waarmee we cel migratie en cel-matrix adhesies in kankercellen bestuderen in zowel 2D, 3D en in vivo. In Hoofdstuk 4, presenteren we een methodiek geschikt om de dynamiek van de focal adhesie eiwitten te kwantificeren dankzij de zo genoemde
“bleek techniek” FRAP en/of FLIP. Hiervoor hebben we een model opgezet waarbij we de kinetiek van GFP-gelabelde eitwitten in een cel in zowel het cytoplasma als ook alle cell-matrix adhesies kunnen meten. De kracht van deze methode is de mogelijkheid om de dynamiek van een eiwit op verschillende punten in een cel afhankelijk van adhesie type en distributie te bepalen. Dankzij het bleken van de helft van de cel kunnen we de eiwitdynamiek in kaart te brengen en in relatie te brengen met de grootte van de focal adhesies en de distributie in de zelfde cel. We hebben dit toegepast om het verschil in het gedrag van twee zeer
belangrijke cel-matrix adhesie componenten te bepalen: paxillin en focal adhesie kinase (FAK). We laten duidelijk zien dat beiden eiwitten verschillen in verblijftijd bij de cel-matrix adhesies: paxillin (100s) zit langer dan FAK (60s) op cell-matrix adhesies. Bovendien, meten we dat hoe groter de cel-matrix adhesie is des te langer verblijven de twee componenten op focal adhesies. FAK kinetiek is ook gevoelig voor de extra-cellular matrix dichtheid. Op laag collagen matrix dichtheid is de verblijftijd van FAK korter dan op een hoge collageen dichtheid. Dus de kinetiek van FAK en paxillin zijn afhankelijk van de maat van de adhesie en ook het type.
Metastase vorming is een belangrijke stap in de progressie van kanker. De onderliggende mechanismen verantwoordelijk voor metastasering zijn nog niet goed begrepen. In dit proces is er een belangrijk moment wanneer tumorcellen met bepaalde eigenschappen de primaire tumor kunnen verlaten en de bloedvaten binnen treden. Er zijn verschillende eiwitten die een rol spelen in de dynamiek van cel-matrix adhesies en die ook betrokken zijn in de ´tumorcel autonome´
metastaseringsprocessen; celmigratie is een van deze processen. Om de rol van cel- matrix adhesie eiwitten in dit proces te bestuderen, hebben we een geschikt muismodel opgezet. In Hoofdstuk 5 beschrijven we ten eerste een geoptimaliseerd muismodel waarbij de MTLn3 cellijn met overexpressie van de groei factor receptor EGFR gebruikt wordt. Wij vonden dat tumorcellen met een verhoogde expressie van EGFR in een immuun-deficiënte muis meer metastaseren dan de controle cellen met normaal EGFR expressie. Bovendien laten we zien dat een muizenstam zonder B, T en met name NK cellen het meest geschikte model is voor het bestuderen van metastasevorming. In onze studies was de tumor groei niet beïnvloed door het immuunsysteem maar het aantal long metastases wel. De EGFR GFP-MTLn3 cellen metastaseren het meest in de Rag2-/-γc-/- muizen die helemaal geen T, B en NK cellen hebben maar wel macrophagen. Samengevat demonstreren we dat de Rag2-/- γc-/- muis in combinatie met de EGFR GFP-MTLn3 cellijn een goed in vivo model is om de ´tumorcel autonome´ metastaseringsprocessen te bestuderen. Deze EGFR GFP-MTLn3 cellijn is verder gebruikt in Hoofdstuk 6 waarbij we de expressie van een bepaald kandidaat pro-metastaseringseiwit specifiek in de kanker cellen tot expressie kunnen brengen. Met behulp van doxycycline in het drinkwater van de dieren, kunnen we, wanneer nodig, de expressie van een bepaald eiwit aanzetten in zowel de primaire tumor als de metastasen die gevormd zijn in de long. Bovendien kunnen we in de primaire tumor, dankzij het gebruik van de fluoroscente eiwitten GFP (=green fluorescent protein) en CFP (=cyan fluorescent protein), de controle en de mutante cellen met behulp van zogenaamde twee-foton microscopie volgen. Op deze manier is het effect van de overexpressie van een bepaald eiwit op celmigratie niveau in een primaire tumor in de muis te visualiseren en kwantificeren.
De progressie van borstkanker is (deels) afhankelijk van de mogelijkheid van cellen om te ontsnappen uit de primaire tumor om vervolgens metastasen te vormen op andere plaatsen in het lichaam. Deze metastasering kan worden geïnitieerd door cel-matrix adhesie signalen. Cel-matrix adhesies zijn inderdaad
Nederlandse samenvatting
belangrijk in borstkankerprogressie. FAK is een belangrijke component in de cel adhesie structuren omdat het signalen van groeifactor receptoren en integrines doorstuurt naar andere eiwitten en op deze manier cellulaire processen reguleert zoals proliferatie, celoverleving, de dynamiek van adhesie en celmigratie.
Verhoogde FAK expressie en activiteit wordt vaak gevonden in verschillende typen kanker, inclusief borstkanker en correleert met progressie van deze ziekte. In Hoofdstuk 2 hebben we de rol van FAK als potentieel target voor kankerbestrijding beschreven. Een andere belangrijk eiwit in het cel-matrix adhesie proces is paxillin. Dit eiwit speelt een platform-rol binnen de cel-matrix adhesie componenten. In Hoofdstuk 7 bestuderen we de rol van paxillin in metastase vorming; in het bijzonder analyseren we de rol van de fosforileringsplaats Ser178 van paxillin. Om de rol van paxillin Ser178 te kunnen bestuderen hebben we gebruik gemaakt van borsttumor MTLn3 cellen waar wild type GFP-paxillin of een mutant GFP-paxillin-S178A die niet gefosforyleerd kan worden tot overexpressie zijn gebracht. We laten zien dat cellen met mutant overexpressie veel minder kunnen migreren door gereduceerd cel-matrix-adhesie dynamiek. De vermindering van celmigratie is ook geassocieerd met een vermindering van de ontwikkeling van borsttumor metastasen in de long in onze proefdiermodellen.
Tevens laten we zien dat verstoring van de paxillin-JNK signaling pathway in verminderde expressie van de groei factor receptor EGFR op eitwit en mRNAs niveau resulteert. Re-expressie van wt EGFR in de mutant cellen zorgt dat de cellen weer naar de longen kunnen metastaseren. We laten hier voor het eerst een relatie zien tussen paxillin en EGFR-gemediëerde kanker metastasering. Wellicht dat de paxillin-JNK signaaltransductie een nieuwe target is om kanker metastasering te voorkomen.
Samengevat laat het onderzoek beschreven in dit proefschrift zien dat zowel FAK als paxillin een belangrijke rol spelen in cel-matrix adhesie dynamiek en in de progressie van borstkanker. Het ontrafelen van cel-matrix adhesie gerelateerde processen in relatie tot borstkanker zal bijdragen aan het beter begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van borstkanker en de progressie daarvan. Tevens zal de mogelijkheid van remming van de eiwitten die cruciaal zijn in de regulatie van cel-matrix adhesies in de behandeling van borstkanker verder moeten worden onderzocht.
List of abbreviations
LIST OF ABBREVIATIONS APC Allophycocyanin
BLI Bioluminescent Imaging CCD Charge-coupled device CFP Cyan fluorescent protein
CLEM Controlled light exposure microscopy CLSM Confocal laser scanning microscopy DN Dominant negative
DIC Differential interference contrast DOXY Doxycycline
ECM Extra-cellular matrix EGF Epidermal growth factor EGFP Enhanced GFP
EGFR Epidermal growth factor receptor EMT Epithelial-to-mesenchymal transition ER Estrogen receptor
ERK Extracellular signal-regulated kinase ErbB1 Epidermal Growth Factor Receptor
FA Focal adhesion
FACS Fluorescence activated cell sorter FAK Focal adhesion kinase
FAT Focal adhesion targeting FB Fibrillar adhesion
FC Focal complex
FCS Fluorescence correlation spectroscopy FERM 4.1 protein, ezrin, radixin and moesin FLI Fluorescent Imaging
FLIP Fluorescence Loss in Photobleaching FLIM Fluorescence lifetime imaging FPs Fluorescent proteins
FRAP Fluorescence Recovery after Photobleaching FRNK Focal adhesion kinase (FAK)-related non kinase FRET Fluorescence resonance energy transfer
FSM Fluorescence speckle microscopy GFP Green fluorescent protein
HGF Hepatocyte growth factor H&E Hematoxylin and eosin HTS High throughput screening IL-2 Interleukin 2
ILK Integrin-linked kinase
IGF1R Insulin-like growth factor 1 receptor JNK c-Jun N-terminal kinase
KO Knock-out
LSCM Laser scanning confocal microscopy
LUC Luciferase
MAPK Mitogen-activated protein kinase MDCK Madin-Darby canine kidney MET Mesenchymal-epithelial transition MHC Major histocompatibility complex MIW Mammary imaging window MLC Myosin light chain
MMP Matrix metallo proteinase MMTV Mouse mammary tumor virus MTLn3 Mammary rat adenocarcinoma cells NK Natural killer cell
PTAs Podosome-type adhesions PTKs Protein tyrosine kinase PYVMT Polyomavirus middle T
RICS Raster image correlation spectroscopy PI3K Phophatidylinositol 3-kinase RAG2 Recombinase activating gene
RtTA Reverse tetracycline responsive transactivator
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacryalmide gel electrophoresis SCID Severe combined immunodeficiency mice
S.D. Standard deviation S.E.M Standard error of mean ShRNA Short hairpin RNA SiRNA Small interference RNA
TGFbeta Transforming growth factor beta
TIRFM Total internal reflection fluorescence microscopy TPLSM Two-photon laser scanning microscopy
UPA Urokinase plasminogen activator UPAR Urokinase plasminogen activator receptor VEGF Vascular endothelial growth factor YFP Yellow fluorescent protein γc Common gamma chain
2D Two-dimensional
3D Three-dimensional
Curriculum vitae
CURRICULUM VITAE
Sylvia Le Dévédec was born on the 30th of June 1976 in Ploemeur, France. She completed her secondary education at the Lycée Lakanal in 1995 in Paris.
Thereafter she joined the ‘Grande Ecole d’Agronomie et des Industries Alimentaires’ in Nancy where she obtained her Ingénieur diploma (Ir.). She completed her studies at the Wageningen University in the Netherlands where she obtained her Master of Science degree in Biotechnology (MSc.). She graduated in 1998 after having worked on a project entitled ‘Three dimensional organization of nuclear components in colorectal cancer’ under supervision of Dr. P. Verschure and Prof. Dr. R. van Driel (University of Amsterdam). Thereafter she started her career in industry as Project Manager at the Research and Development department of Saint-Gobain Cultilene BV in The Netherlands for a period of three years. After a sabbatical year traveling by bike around the world, she started her PhD studies in June 2003 at the Toxicology Department of Prof. Dr. van de Water at the division of Toxicology of the Leiden/Amsterdam Centre for Drug Research (LACDR, The Netherlands). In her research she uses microscopical techniques to get a better insight into the role of focal adhesion-associated proteins in adhesion signaling during tumor cell migration as well as cellular stress response. She aims at understanding cell-matrix adhesion dynamics at the protein level as well as the role of focal adhesion associated protein in metastasis formation. For this purpose she uses different microscopy techniques including FLIP-FRAP, FRET-FLIM, TIRF and Intravital Imaging. From January 2008 she works as a Post-Doc for 4 years on a Dutch Cancer Society (Koningin Wilhelmina Fonds) project entitled ‘Focal adhesion kinase signaling in mammary tumorigenesis and metastasis formation’
(KWF UL 2007-3860).
List of publications
LIST OF PUBLICATIONS
Ma Y., van de Water B., Le Dévédec SE. Focal Adhesion Kinase (FAK) inhibition as a potential strategy for anticancer therapies. Drugs of the Future 2009, 34(6): 477- 483.
Le Dévédec SE, van Roosmalen W, Maria N, Grimbergen M, Pont C, Lalai R, van de Water B. An improved model to study tumor cell autonomous metastasis programs using MTLn3 cells and the Rag2(-/-) γc (-/-) mouse. Clin Exp Metastasis.
2009
de Graauw M, Le Dévédec S, Tijdens I, Smeets MB, Deelder AM, van de Water B.
Proteomic analysis of alternative protein tyrosine phosphorylation in 1,2- dichlorovinyl-cysteine-induced cytotoxicity in primary cultured rat renal proximal tubular cells. J Pharmacol Exp Ther. 2007 Jul;322(1):89-100.
van de Water B, de Graauw M, Le Dévédec SE, Alderliesten M. Cellular stress responses and molecular mechanisms of nephrotoxicity. Toxicol Lett. 2006 Mar 15;162(1):83-93.
Le Dévédec SE, Lalai R, Pont C, de Bont H, van de Water B. Two-photon intravital multi-color imaging combined with inducible gene expression to distinguish metastatic behavior of breast cancer cells in vivo. (accepted for publication in Mol. Imaging Biol.)
Le Dévédec SE, Yan K, de Bont H, Ghotra V, Truong H, Danen E, Verbeek F. and van de Water B. A systems microscopy approach towards understanding tumor cell migration: quantitative evaluation of cellular and molecular measurements.
(conditionally accepted for publication in Cell. Mol. Life Sci.)
Ma Y, Verkoeijen S, van Nimwegen MJ, van Dam H, Le Dévédec SE, Meerman JH, van de Water B. Role of Fos related antigen-1 (Fra-1) in focal adhesion kinase (FAK) mediated chemoresistance of mammary adenocarcinoma cells. (submitted for publication).
de Graauw M, van Miltenburg M, Schmidt MK, Le Dévédec SE, van’t Veer L, ten Dijke P, van de Water B. Annexin A1 expression in basal-like breast cancer mediates metastatic behavior through TGFβ signaling. (submitted for publication) Le Dévédec SE, Ma Y, Verkoeijen S, van Roosmalen W, van Miltenburg M, Lalai R, van de Water B. Serine 178 of the Scaffold Protein Paxillin is Essential for Cancer Cell Migration and Spontaneous Metastasis Formation Through Regulating EGFR Expression. (submitted for publication)
Le Dévédec SE, Geverts B, de Bont H, Houtsmuller AB, van de Water B.
Differential Residency of Focal Adhesion Kinase and Paxillin at Focal Adhesions Depends on Increasing Adhesion Strength. (submitted for publication)
Yan K, Le Dévédec SE, Verbeek F and van de Water B. Automated tracking of migrating mammary carcinoma cell-line.(manuscript in preparation)
De Sonneville J, Le Dévédec SE, Jorand RCT, van Stapele E, Noteborn MHM, Abrahams JP, van de Water B, Kuil ME. A simple microfluidic connection.
(manuscript in preparation).
Damiano L, Le Dévédec SE, Di Stefano P, Lalai R, Truong H, van de Water B, Defilippi P. p140Cap suppresses invasive properties of metastatic MTLn3-EGFR cells. (manuscript in preparation)
Acknowledgments
ACKNOWLEDGMENTS
Enfin, c´est fini! Aujourd´hui, je peux dire que je clos un chapitre important de ma vie: ma thèse. Et je suis vraiment heureuse de commencer un nouveau chapitre qui m´est encore inconnu mais dont je suis très curieuse...My professional life was indeed not a straight line, and there are few important persons that I have to acknowledge for the different steps that I took in this adventure. I should definitely start with my very best friend Michel who encouraged me to follow my intuitions instead of pure rational reasons before making any important choices. Thanks to his support I was able to choose for what I enjoy the most. Michel, hartelijk dank voor alles, voor altijd! Another person that has been quite crucial in my scientific career is my dear friend and ‘mentor’ Pernette. You were my supervisor during my Master traineeship and I learned how research is just about passion and dedication. You were there when I obtained my Ingenieur Diploma in France and as well as for my Master ceremony in Wageningen. Again you are present for my last and final graduation day which makes the circle round. Dankje wel Pernette voor alles! The three years spent in a French company with a French ‘chef’ were tough but so important for my own development. Hervé thanks to you I learned to start a project from scratch and to manage it independently, which experience I used continuously during the period of my scientific adventure. Merci! When I came back from a year biking through many beautiful countries, Bob invited me for an interview. I did not know much about signal transduction, nor about focal adhesions. I had not touched a pipette for almost 4 years but you offered me that PhD position. I still cannot understand why but I am glad you did it! It was not easy for me but with the years and your ´free´ supervision, I feel now very confident as a researcher. Hartelijk dank voor je vertrouwen en ondersteuning!
Last but not least, I would like to thank a discrete person which has been for me very important in all these years and without whom I would not have obtained this thesis. Hans bedank voor alle je hulp met betrekking tot microscopie. Jij bent er altijd als iets mis is en jij staat altijd klaar om mij te helpen met experimenten.
Bedank voor alles!
Without fun, and cheerful moments, I could not have accomplished this thesis. Lieve TOX meiden, Chantal, Maaike, Martine en Marjo, ik zal niet snel onze gezellig etentjes, uitjes en boeiende discussies over alles vergeten. Ik waardeer deze momenten met jullie en zou het liefst willen dat het nog lang kan gebeuren.
Chantal, jij was er altijd om naar mijn verhalen te luisteren en ik ben zo blij dat jij mijn paranymf wilt zijn. Wies, we zijn samen aan een nieuw project begonnen en ik vind het heel fijn om samen met jou te werken. Ik hoop wel dat ik een beetje kan helpen met het behalen van jouw eigen doktor diploma. Jij hebt mij in ieder geval de laatste 2 jaren enorm geholpen en nu ook nog bij de verdediging als mijn paranymf. Bedankt hiervoor! More people at TOX did and still do help me with my work: Maya, Hoa, Ine, Reshma, Sandra, Stephan, Hoa, and of course all the
other TOX members. Thanks a lot! I also had students whose supervision was always a learning period and who one way or another way did contribute to this work: Ruud, Max, Ravin, Naomi, Tada and Hanna. Laura, you came along as a visiting scientist. I also enjoyed working with you. Hopefully it will result in a nice paper. Jan, soms twijfel ik of het ons gaat lukken maar het is wel leuk en rustgevend om met jou te werken. Kuan, we started to work together for almost two years. Thanks to your bioinformatics abilities and your hard work, we are very productive and we set up powerful tools for further research. More people outside Leiden were involved in my research. Adriaan, hoewel onze samenwerking door onze drukke agenda’s niet zo loopt als ik graag zou willen, word ik altijd geïnspireerd door onze gesprekken. Ik hoop dat we in de toekomst nog meer samen kunnen werken. Ook bedank ik Bart voor het helpen met het uitwerken van de data. Maarten en Robert (van Nikon) bedankt voor jullie samenwerking en vriendschap.
I do not forget my long-time friends in France with whom the contact was quite chaotic the last years but that I never forgot: Marie, Anne, Anne-Lise, Hélène and Céline. Furthermore, Micaela and Maite thanks for the great time we had in New-York. Anneke, I miss our regular ‘etentjes’ and Ding thanks for all and especially the regular baby-sitting of Tristan; the little families of Hana, Christian and Otto (Christian, you are now next in line) and Yapei, Kiri and the little Paramore to come….
Finally, I will finish by acknowledging my own family, my parents for having me taught to work hard and try to make something of my life, my sister Julie for her support and pep talks and my parents-in-law for their kindness and cosy welcome in their family. Hagen, merci für das Cover! Robert, this past year has been very tiring and stressful. You took care of our little family and gave me the opportunity to finish my work. You are a great man, friend and father and I love to be with you to help our little schattie-muis growing up. Tristan, before you, work was my only priority, with you I realised that I was completely wrong. I am so happy to have you three Robert, Tristan and little fellow to come!
