University of Groningen
Single-molecule studies of the replisome
Spenkelink, Lisanne
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Spenkelink, L. (2018). Single-molecule studies of the replisome: Visualisation of protein dynamics in multi-protein complexes. Rijksuniversiteit Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Desoxyribonucleïnezuur (DNA) is de belangrijkste drager van erfelijke informatie in de cel. Tijdens celdeling moeten twee identieke kopiën van dit DNA gemaakt worden, zodat alle erfelijke informatie correct wordt doorgegeven aan de volgende generatie cellen. Dit kopieerproces wordt DNA replicatie genoemd. DNA replicatie gebeurt continu en is erg snel en extreem nauwkeurig. Om een idee te krijgen van de schaal waarop DNA replicatie gebeurt, kunnen we uitrekenen hoeveel DNA onze cellen moeten repliceren tijdens ons leven. Een menselijk lichaam heeft ongeveer 2· 1014cellen en elke cel deelt zich gemiddeld vijftig keer
(sommige vaker, andere nooit). Als we dit vermenigvuldigen met de lengte van een DNA streng (ongeveer 6 · 109 bp) kunnen we uitrekenen dat ons lichaam ongeveer 1016 meter aan DNA produceert. Dit is gelijk
aan een lichtjaar!
DNA replicatie moet zo nauwkeurig mogelijk gebeuren, omdat fouten tijdens de replicatie kunnen leiden tot ontwikkelingsdefecten en ernstige ziektes zoals kanker. Daarom is het belangrijk dat we begrijpen hoe DNA replicatie precies werkt. Daarnaast is het ook belangrijk om te weten hoe DNA replicatie in virussen en bacteriën werkt, zodat er mogelijk medi-cijnen ontwikkelt kunnen worden die de replicatie en daarmee de groei van deze ziekteverwekkers stoppen. DNA replicatie in zowel menselijke cellen als micro-organismen wordt uitgevoerd door een groep enzymen die samen de replicatie machine, of replisoom genoemd worden. Deze enzymen openen het spiraalvormige dubbelstrengs DNA, zodat twee enkele strengen onstaan. Vervolgens wordt op deze strengen nieuw DNA gesynthetiseerd. In de afgelopen zestig jaar zijn wetenschappers al veel te weten gekomen over de rol die de verschillende enzymen spelen in het replisoom. Wat men echter nog niet weet is hoe deze en-zymen zich gedragen en wat de interacties zijn tussen de verschillende enzymen. Het is tot nu toe erg moeilijk geweest om deze informatie te verkrijgen omdat de bestaande onderzoeksmethoden niet goed genoeg zijn om deze dynamische en kortstondige processen waar te nemen. In de afgelopen jaren werden er nieuwe enkelmolecuul technieken ontwikkeld die de dynamiek van één enkel enzym molecuul met een hoge precisie kunnen bestuderen. Tijdens mijn onderzoek hebben we
Nederlandse samenvatting
verschillende enkelmolecuul technieken gebruikt om de dynamiek van de enzymen in het replisoom te bestuderen.
Hoofdstuk 2 geeft een overzicht van de verschillende enkelmole-cuul technieken die recentelijk zijn ontwikkeld om biologische processen te bestuderen. Met voorbeelden uit onderzoeken naar DNA replicatie en cytoskeletale motoren beschrijven we de voor- en nadelen van elke techniek. Daarnaast benoemen we de recente verbeteringen en verbeteringen die nog gedaan kunnen worden. Voor het grootste deel van mijn onderzoek gebruik ik enkelmolecuul fluorescentie microscopie om DNA replicatie te bestuderen. Deze techniek maakt gebruik van fluorescente moleculen die, onder invloed van een laser, licht met een bepaalde golflengte uitzenden. Dit licht kan worden gedetecteerd met een zeer gevoelige camera. Op deze manier kan met een grote nauwkeurigheid de positie van deze moleculen worden vastgesteld. Een groot probleem met enkelmolecuul fluorescentie microscopie is dat dit alleen mogelijk is met lage concentraties fluorescerende moleculen. Als de concentratie te hoog wordt, kunnen enkele moleculen niet meer van elkaar worden onderscheiden. In hoofdstuk 3 beschrijf ik een nieuwe, door ons ontwikkelde techniek die het mogelijk maakt om enkele moleculen te visualiseren ondanks dat de concentratie van deze moleculen hoog is. Voor deze methode maken we gebruik van de mogelijkheid om, door een chemische reactie, fluorescente moleculen in een donkere, niet-fluorescerende toestand te brengen. Vervolgens worden, met behulp van een laser, specifiek enkele moleculen weer terug naar de fluorescerende toestand gebracht. Deze enkele moleculen kunnen hierna worden gevisualiseerd.
Om het belang van enkelmolecuul experimenten te illustreren hebben we enkelmolecuul fluorescentie microscopie gebruikt om de dichtheid van enzymen op liposomen te bepalen. Liposomen zijn minescule kunstmatig gesynthetiseerde membraanbolletjes waarin stoffen kunnen worden opgeslagen. Deze liposomen kunnen wellicht gebruikt worden om medicijnen op heel specifieke plaatsen in ons lichaam af te leveren. Hievoor is het echter belangrijk dat de liposomen het juiste doel in ons lichaam kunnen vinden. Hiertoe worden enzymen aangebracht op de
buitenkant van de liposomen die deze specifieke doelen kunnen herken-nen. Tot nu toe was het onmogelijk om met zekerheid vast te stellen hoeveel enzymen werden aangebracht op de liposomen. In hoofdstuk 4 beschrijf ik hoe wij enkelmolecuul fluorescentie microscopie gebruikt hebben om het aantal enzymen per liposoom te tellen. Deze informatie zal helpen bij de ontwikkeling van deze liposomen naar medicijnen die gebruikt kunnen worden in een klinische context.
In hoofdstukken 5 en 6 gebruiken we enkelmolecuul fluorescentie micro-scopie om de dynamiek van enzymen in het E. coli replisoom te bepalen. DNA polymerasen zijn verantwoordelijk voor het synthetiseren van nieuw DNA tijdens DNA replicatie. Men heeft lang gedacht dat polymerasen een stabiel complex vormen met de rest van het replisoom. In hoofdstuk 5 beschrijf ik hoe wij echter laten zien dat polymerasen in het replisoom kunnen uitwisselen met polymerasen in hun omgeving. De snelheid van deze uitwisseling hangt af van de concentratie van polymerasen in de omgeving — bij een hoge concentratie is de uitwisseling snel, bij een lage concentratie langzaam. Door dit uitwisselingsmechanisme kunnen defecte polymerasen gemakkelijk vervangen worden. Verder kunnen via dit mechanisme andere enzymen, wanneer nodig, de polymerasen vervangen om andere taken uit te voeren. Denk hierbij bijvoorbeeld aan enzymen die reparaties uitvoeren bij DNA schade. In hoofdstuk 6 beschrijf ik een soortgelijk uitwisselingsmechanisme voor SSB’s. SSB’s (Enkelstrengs DNA bindende enzymen, single-stranded DNA binding proteins in het Engels) binden enkelstrengs DNA en beschermen het totdat polymerasen er nieuw, dubbelstrengs DNA van maken. Bij lage concentraties SSB, kunnen de SSB’s makkelijk hergebruikt worden binnen het replisoom. Dit kan nuttig zijn voor de cel, als de SSB concen-tratie opeens erg laag wordt. Dit kan bijvoorbeeld gebeuren doordat alle SSB gebonden wordt door enkelstrengs DNA bij een DNA beschadiging. Doordat SSB hergebruikt wordt in het replisoom, kan DNA replicatie gewoon doorgaan. Als er een hoge concentratie SSB’s in de omgeving is, wisselen SSB’s in het replisoom zich uit met de SSB’s uit de omgeving. In hoofdstuk 7 bestuderen we de invloed van het enzym RarA op DNA replicatie en reparatie. RarA is een eiwit waarover nog niet heel
Nederlandse samenvatting
veel bekend is. Met enkelmolecuul fluorescentie microscopie laten wij zien dat bij een hoge concentratie RarA, de DNA replicatie van één van de strengen kortstondig stopt. Dit komt waarschijnlijk doordat RarA de verbinding verbreekt tussen de polymerase en een ander replisoom eiwit, genaamd β2. Enige tijd later gaat replicatie weer verder, waardoor er een
gat achter blijft in het DNA. Dit is wellicht een mechanimse dat er voor zorgt dat het replisoom langs beschadigd DNA kan bewegen, zonder dat DNA replicatie volledig vast loopt. Verschillende herstel mechanismen kunnen er dan voor zorgen dat het DNA gerepareerd wordt en het gat wordt ingevuld.
Tot slot beschrijf ik in hoofdstuk 8 hoe we een ’tethered-bead’ enkel-molecuul techniek gebruiken om voor de eerste keer DNA replicatie in een eukaryotisch systeem te visualiseren. Bij deze techniek meten we de veranderingen in de lengte van een DNA molecuul die plaatsvinden wanneer een enkele DNA streng wordt gekopieerd. Deze veranderingen geven ons informatie over de activiteit van de enzymen in het replisoom. Eerst laten we zien dat we met deze techniek replicatiesnelheden zien die hetzelfde zijn als snelheden gemeten met traditionele methodes. Vervolgens bestuderen we hoe het MTC enzym complex deze snelhe-den beïnvloed. Het is bekent dat het MTC complex het replisoom kan versnellen. Wij laten zien dat de interactie tussen MTC en het replisoom dynamisch is en dat MTC het replisoom maar voor een deel van de tijd versnelt. Deze dynamiek zou niet kunnen worden waargenomen zonder het gebruik van enkelmolecuul technieken.
Door het gebruik van enkelmolecuul technieken hebben wij laten zien dat de samenstelling van het replisoom veel dynamischer is dan gedacht. De verschillende eiwitten die onderdeel uitmaken van het replisoom worden constant uitgewisseld met eiwitten uit de omgev-ing. Deze dynamiek vindt niet alleen plaats in het replisoom, maar is waarschijnlijk van toepassing op andere eiwit complexen.
