University of Groningen Breaking walls: combined peptidic activities against Gram-negative human pathogens Li, Qian

University of Groningen

Breaking walls: combined peptidic activities against Gram-negative human pathogens

Li, Qian

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2019

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Li, Q. (2019). Breaking walls: combined peptidic activities against Gram-negative human pathogens. University of Groningen.

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

Summary

Samenvatting

Summ

ar

y

S

Summary

Antibiotic resistance has become one of the biggest threats to global health and development today. The development of antibiotic resis-tance is a natural ecological phenomenon, but the abuse and misuse of antibiotics is accelerating the process. The most difficult-to-treat infections are caused by Gram-negative pathogens, which have a pro-tective outer-membrane. There is an urgent need for discovering new antibiotics and for a better use of existing antibiotics, in order to fight the increased resistance of bacteria to existing antibiotics. Lantibiotics have been proposed as good candidates in this field.

Nisin is one of the oldest and most widely used antimicrobials and is highly effective against Gram-positive bacteria. Nisin binds to the pyrophosphate moiety of lipid II via the N-terminal rings A and B and forms a pyrophosphate cage. Then nisin bends, inserts its C-terminus into the membrane and forms transmembrane pores. Thus, nisin exerts two killing mechanisms: it permeabilizes the membrane and inhibits cell wall synthesis. Since the pyrophosphate is essential and not prone to mutation and also facilitates the transmembrane of orientation of nisin, low levels and rates of specific resistance development against nisin are expected. Like nisin, vancomycin also binds to lipid II and exerts antibi-otic activity against Gram-positive bacteria. Its target is D-Ala-D-Ala in lipid II and then it blocks the glycan polymerization and cross-linking. Nevertheless, the activity of nisin/vancomycin against Gram-negative bacteria is much lower than that against Gram-positive bacteria. The main reason is that the protective outer-membrane of Gram-negative bacteria forms an efficient barrier to prevent nisin/vancomycin to reach its target, lipid II, at the inner membrane. Thus, the main bottleneck for nisin/vancomycin to be effective against Gram-negative pathogens appears to be their low capacity to penetrate the outer-membrane.

The research work described in this thesis focuses on further engi-neering of nisin-like lantibiotics and the use of nisin/vancomycin in synergy with other peptides to fight Gram-negative pathogens. The NICE system has been extensively and successfully used for high ex-pression of proteins from different origins for various applications, including the introduction of Melan/Lan to clinically relevant peptides to improve their stability and pharmacodynamic properties.

170

Summ

ar

y

S

In Chapter 2, the NICE system and the nisin modification machin-ery was applied to introduce a lanthionine bridge into vasopressin. In order to do that, the first cysteine of wild type vasopressin was changed to serine, and then expressed in the NICE system and isolated, purified and characterized. The formation of a lanthionine ring was confirmed by LC-MS/MS analysis.

Chapter 3 describes the bioengineering of nisin to increase its

activ-ity against Gram-negative pathogens. Several tails with transmembrane activity were attached to various nisin moieties. And then, rational design of nisin, tails or both was performed. The activities of nisin, the tails and fusions were tested both on Gram-negative and Gram-positive bacteria. The results revealed that the tails of the fusions changed both the activity and spectrum of activity of nisin, but the fusion was still bactericidal (the mutant T16m2 was up to 12-fold better than nisin against Gram-negative bacteria). The rational design is a potential way to develop highly potent lantibiotic-derivatives.

Synergism between membrane perturbing peptides and lipid II- targeting antibiotics are employed in both Chapter 4 and Chapter 5. In

Chapter 4, the synergism between several peptides was studied. Several

anti-Gram-negative peptides (GNPs) (L-peptides) with modest activity against Gram-negative bacteria were synthesized, tested either alone or in combination with vancomycin/nisin against five selected Gram-neg-ative pathogens. We observed that GNP-6 was very efficient alone and showed a modest synergism when combined with either vancomycin or nisin against the Gram-negative pathogens tested. In contrast, GNP-8 had exhibited an astonishing synergism with vancomycin and specially nisin in spite of its poor activity when tested alone. Highly synergistic activity of GNP-8 and nisin/vancomycin leads to dramatically reduced minimal inhibitory concentration values (up to 32-fold). Considering the size, charge and potency of the L-GNPs, GNP-6 and GNP-8 were found to be the best candidates for further investigation in combination with either nisin or vancomycin. A mechanism of gateway activity of membrane disrupting peptides is proposed.

Subsequently in Chapter 5, some mutants of GNP-6 and GNP-8 were rationally designed and synthesized, and the MICs of them alone and combined with vancomycin/nisin were tested. Overall, single amino acid engineering and sequence reversal did not provide better

Summ

ar

y

S

were replaced by their D-isomers) that retain the activity and are less prone to proteolytic degradation. Thus, no specific receptors are in-volved in the actions of the selected GNP-D6 or GNP-D8. LPS and Mg2+ were added in the activity assays, and the activity of vancomycin, GNP-D6 and GNP-D8 were significantly compromised when they were tested either alone or in combination. These results further prove that GNPs, especially GNP-D8 interact with LPS on the outer-membrane and improve the perturbation of the outer-membrane.

The results of preclinical tests revealed that vancomycin and GNP-D8 neither caused lysis of erythrocytes nor showed significant toxicity against the human cell line HEK-239 when tested alone or in combi-nation. The concentration of GNP-D6 to cause a hemolysis and toxicity was extremely high compared to the concentration required to inhibit the growth of Gram-negative pathogens, including MDR strains. Thus, vancomycin, GNP-D8 and GNP-D6 are potential candidates for ther-apeutic use, although further characterization is required.

In summary, two strategies were employed to increase the activity of nisin against selected Gram-negative pathogens. Even though fur-ther in vivo tests (e.g. pharmacokinetic/pharmacodynamics tests) are needed. The fused peptides here described and combinations of two compounds constitute new and relevant therapeutic approaches to deal with (MDR) Gram-negative pathogens. The NICE system and the nisin modification machinery were applied to successfully pro-duce functionally fused peptides against Gram-negative pathogens. We also showed that it is possible to introduce a lanthionine ring into vasopressin, which opens the way for yield improvement enabling vasoconstriction and in vivo assays. Moreover, similar technology can be used to produce variants of the homologous oxytocin which could have interesting novel bioactivities.

Sa m en va ttin g

S

Samenvatting

Antibioticaresistentie is tegenwoordig één van de grootste bedreigingen voor de wereldwijde gezondheid. De ontwikkeling van antibioticare-sistentie is een natuurlijk ecologisch fenomeen, maar het overmatig gebruik en misbruik van antibiotica versnelt het proces. De meest moeilijk te behandelen infecties worden veroorzaakt door gramnega-tieve pathogenen, die een beschermende buitenmembraan hebben. Er is een dringende behoefte aan het ontdekken van nieuwe antibiotica en aan een beter gebruik van bestaande antibiotica, om de verhoog-de resistentie van bacteriën tegen bestaanverhoog-de antibiotica te bestrijverhoog-den. Lantibiotica zijn voorgesteld als goede kandidaten op dit gebied. Nisine is één van de oudste en meest gebruikte antimicrobiële midde-len en is zeer effectief tegen grampositieve bacteriën. Nisine bindt via de N-terminale ringen A en B aan de pyrofosfaatgroep van lipide II en vormt een zogenaamde pyrofosfaatkooi. Hierna buigt nisine, brengt zijn C-terminus in het membraan en vormt vervolgens transmembraanpori-en. Nisine gebruikt dus twee dodingsmechanismen: het permeabiliseert de membraan en remt de celwandsynthese. Omdat pyrofosfaat essentieel is en niet vatbaar is voor mutatie en ook de membraan de transverse oriëntatie van nisine vergemakkelijkt, worden lage niveaus en snelheden van specifieke resistentieontwikkeling tegen nisine verwacht. Evenals nisine bindt vancomycine ook aan lipide II en oefent het antibiotische ac-tiviteit uit tegen grampositieve bacteriën. Het doelwit is D-Ala-D-Ala in lipide II en het blokkeert de polymerisatie en het crosslinken van glycan. Niettemin is de activiteit van nisine / vancomycine tegen gramnegatieve bacteriën veel lager dan tegen grampositieve bacteriën. De belangrijkste reden is dat het beschermende buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën een efficiënte barrière vormt om te voorkomen dat nisine of vancomycine zijn doelwit, lipide II, in het binnenmembraan bereikt. Het belangrijkste knelpunt voor nisine of vancomycine om effectief te zijn tegen gramnegatieve pathogenen lijkt dus hun lage capaciteit om de buitenmembraan te penetreren.

Het onderzoekswerk beschreven in dit proefschrift richt zich op de verdere engineering van nisine-achtige lantibiotica en het gebruik van

174

S

nisine en vancomycine in synergie met andere peptiden om gramnega-tieve pathogenen te bestrijden. Het NICE-systeem is uitgebreid en met succes gebruikt voor de hoge expressie van eiwitten van verschillende oorsprong en voor verschillende toepassingen, waaronder de introduc-tie van Melan en Lan in klinisch relevante peptiden om hun stabiliteit en farmacodynamische eigenschappen te verbeteren.

In Hoofdstuk 2 werden het NICE-systeem en de nisine modificatie machinerie toegepast om een lanthionine brug in vasopressine te in-troduceren. Om dat te doen, werd het codon van de eerste cysteïne van wildtype vasopressine veranderd in een serine codon en vervolgens het gen tot expressie gebracht met het NICE-systeem, en het product geïsoleerd, gezuiverd en gekarakteriseerd. De vorming van een lant-hionine ring werd bevestigd door LC-MS / MS-analyse.

Hoofdstuk 3 beschrijft de bio-engineering van nisine om de activiteit

ervan tegen gramnegatieve pathogenen te verhogen. Verschillende staarten met transmembraan activiteit werden aan verschillende ge-deeltes van nisine gehecht. Daarna werd een rationeel ontwerp van nisine, staarten of beide uitgevoerd. De activiteiten van nisine, de staarten en fusies werden zowel tegen gramnegatieve als grampositieve bacteriën getest. De resultaten laten zien dat de staarten van de fusies zowel de activiteit als het spectrum van nisine veranderden, terwijl de fusie nog steeds bacteriedodend was (de mutant T16m2 was tot 12 maal beter tegen gramnegatieve bacteriën dan nisine). Het rationele

ontwerp is een potentiële manier om zeer krachtige lantibiotica-deri-vaten te ontwikkelen.

Synergisme tussen membraan-verstorende peptiden en lipide II-ge-richte antibiotica wordt omschreven in zowel Hoofdstuk 4 als

Hoofd-stuk 5. In Hoofdstuk 4 werd synergisme tussen verschillende peptiden

bestudeerd. Verschillende anti-gramnegatieve peptiden (GNP’s) (L- peptiden) met geringe activiteit tegen gramnegatieve bacteriën werden gesynthetiseerd, en ofwel alleen of in combinatie met vancomycine/ nisine tegen vijf geselecteerde gramnegatieve pathogenen getest. We hebben waargenomen dat GNP-6 op zichzelf zeer efficiënt was en matig synergisme vertoonde in combinatie met ofwel vancomycine of

Sa m en va ttin g

S

had GNP-8 een indrukwekkende synergie met vancomycine en vooral in combinatie met nisine, ondanks zijn slechte activiteit wanneer het alleen werd getest. De hoge synergetische activiteit van GNP-8 en ni-sine/vancomycine leidt tot drastisch verlaagde minimaal remmende concentratiewaarden (MICs; tot 32-voudig lager). Gezien de grootte, lading en potentie van de L-GNP’s bleken GNP-6 en GNP-8 de beste kandidaten te zijn voor verder onderzoek in combinatie met nisine of vancomycine. Een mechanisme van ‘’poortopenings activiteit’’ van membraan-verstorende peptiden wordt voorgesteld.

Vervolgens werden in hoofdstuk 5 enkele mutanten van GNP-6 en GNP-8 rationeel ontworpen en gesynthetiseerd, en de MICs daarvan alleen en gecombineerd met vancomycine / nisine werden getest. Over het algemeen leverden de engineering van enkele aminozuren en se-quentieomkering geen betere moleculen op, met uitzondering van de D-GNP’s (alle L-aminozuren werden vervangen door hun D-isomeren) die de activiteit behouden en minder gevoelig zijn voor proteolytische afbraak. Er zijn dus geen specifieke receptoren betrokken bij de activi-teiten van de geselecteerde GNP-D6 of GNP-D8. LPS en Mg2w _werden

toegevoegd in de activiteitstesten en de activiteit van vancomycine, GNP-D6 en GNP-D8 was significant gedaald toen ze ofwel alleen of in combinatie werden getest. Deze resultaten bewijzen verder dat GNP’s, in het bijzonder GNP-D8, interactie aangaan met LPS in het buitenmembraan en de verstoring van het buitenmembraan faciliteren. De resultaten van preklinische testen onthulden dat vancomycine en GNP-D8 noch celdood van erythrocyten veroorzaakten noch sig-nificante toxiciteit vertoonden tegen de menselijke cellijn HEK-239 wanneer ze alleen of in combinatie werden getest. De concentratie van GNP-D6 voor het veroorzaken van hemolyse en toxiciteit was extreem hoog in vergelijking met de benodigde concentratie om de groei van gramnegatieve pathogenen, waaronder MDR-stammen, te remmen. Vancomycine, GNP-D8 en GNP-D6 zijn dus potentiële kan-didaten voor therapeutisch gebruik, hoewel verdere pharmaceutische karakterisering vereist is.

176

S

Samenvattend: er werden twee strategieën gebruikt om de activiteit van nisine tegen geselecteerde gramnegatieve pathogenen te verhogen. De hier beschreven gefuseerde peptiden en combinaties van twee ver-bindingen vormen nieuwe en relevante therapeutische strategieën om met gramnegatieve pathogenen (MDR) om te gaan. Het NICE-systeem en de nisine modificatie machinerie werden toegepast om op een suc-cesvolle manier functioneel gefuseerde peptiden te produceren tegen gramnegatieve pathogenen. We toonden ook aan dat het mogelijk is om een lanthionine ring in vasopressine te introduceren, wat de weg vrijmaakt voor opbrengstverbetering en daarmee vasoconstrictie en in

vivo testen mogelijk maakt. Bovendien kan vergelijkbare technologie

worden gebruikt om varianten van de homoloog oxytocine te produce-ren welke interessante nieuwe bio-activiteiten zouden kunnen hebben.