Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/45223

Cover Page

The handle http://hdl.handle.net/1887/45223 holds various files of this Leiden University dissertation

Author: Schoeman, Johannes Cornelius

Title: Virus-host metabolic interactions: using metabolomics to probe oxidative stress, inflammation and systemic immunity

Issue Date: 2016-12-20

233 233

In conclusion, as illustrated in this thesis, metabolomics methodologies were developed to measure important signalling metabolites in a wide variety of biological matrixes. Subsequently, with these and earlier established metabolomics platforms, the host-virus interaction on the systemic metabolic level was characterised. The results have revealed the opportunistic nature of viruses in exploiting host metabolism to ensure their own survival. Concurrently, as the host is not a passive bystander, host metabolic pathways attempting to correct these viral induced imbalances were found.

234

Samenvatting

De aanhoudende pathogeniciteit van nieuwe wereld en oude wereld virussen illustreert het vermogen van virussen om evolutionaire mechanismen in te zetten die hun overleving in een gastheerorganisme garanderen door zich te richten op cellulaire en immunologische responsen/afweermechanismen. De complexe biochemie en moleculaire biologie die de interactie tussen virus en gastheerorganisme op een metabool niveau bepalen, hebben tot op heden niet de aandacht gekregen die ze verdienen, omdat het metabolisme van het gastheerorganisme over het hoofd is gezien als mogelijke ziektedeterminant. Sinds het eind van de 20

eeuw, hebben de opheldering van het virale mechanisme dat aangrijpt in metabole routes voor virale replicatie, virale rijping en productie van nieuwe virussen en het overleven van geïnfecteerde cellen grote vooruitgang geboekt, zoals beschreven in de introductie in Hoofdstuk 1. In dit proefschrift wordt metabolomics gecomplementeerd met transcriptomics en immunologie om gastheerorganisme-virus interacties te bestuderen op metabool niveau, waarbij speciale aandacht wordt besteed aan de metabolische rol van ontstekingsreacties en oxidatieve stress tijdens de aangeboren immuunrespons tegen de virale infectie. We hebben gekozen voor het respiratoir syncyteel virus (RSV) en hepatitis B-virus (HBV) als kandidaat virussen om hun rol in acute luchtweginfecties en chronische hepatitis B infecties op metabool niveau te bestuderen. Daarnaast hebben we ook in baby’s bestudeerd wat de metabole en immunologische consequenties zijn van in utero blootstelling aan antiretrovirale interventies en het humaan immunodeficiëntie virus (HIV).

Het eerste deel van dit proefschrift omvat methodeontwikkelingen met betrekking tot metabolomics.

Hoofdstuk 2 beschrijft de ontwikkeling van een methode waarmee oxidatieve stress, nitrosatieve stress en ontstekingsfactoren gemeten kunnen worden in biologische vloeistoffen en weefselmonsters. Met dit gerichte metabolomics platform kunnen lipiden van verschillende klassen gemeten worden, inclusief isoprostanen, prostaglandines, nitrovetzuren, lysosphingolipiden en lysofosfatidinezuur metabolieten. De methode maakt gebruikt van vloeistof-vloeistof extractie ter monstervoorbewerking, gevolgd door vloeistofchromatografie en massaspectrometrische analyse. Deze methode is geoptimaliseerd voor verschillende matrices (bloedserum en zes verschillende orgaanweefsels: hart, lever, long, nier, hersen en milt weefsel) om zowel systemische als orgaan specifieke (gelokaliseerde) metabolische responses te evalueren. Het toepassen van deze methode op in vitro en diermodellen van virale infecties, zal ons begrip op metabool niveau vergroten van systemische en gelokaliseerde oxidatieve stress en ontsteking die optreden als onderdeel van het immuunrespons.

Hoofdstuk 3 beslaat de ontwikkeling van een β-glucuronide hydrolyse methode voor het meten van

geoxideerde lipiden in urinemonsters. Urinemonsters kunnen non-invasief verkregen worden en bevatten

uitgescheiden metabole verbindingen die de status van het gehele systeem weerspiegelen. Drie verschillende

commercieel verkrijgbare enzymen die zijn afgeleid van H. pomatia, E. coli en koeienlever, zijn getest in de

234 235

ontwikkeling van een methode om het totale geoxideerde lipide profiel te meten. Daarna hebben we een methode voor de monstervoorbewerking ontwikkeld gebruik makend van β-glucuronide (afkomstig van koeienlever) gevolgd door LC-MS/MS analyse en deze methode gevalideerd. De methode is gevoelig en in staat om specifiek meer dan 70 geoxideerde lipiden te meten die gesynthetiseerd zijn via twee non-enzymatische routes (ROS, RNS) en drie enzymatische routes (COX, LOX en P450). Hiermee hebben we een voor patiënten non-invasieve methode ontwikkeld om ontsteking en oxidatieve stress te bepalen met behulp van urine.

Het hierop volgende deel van dit proefschrift richt zich op metabolomics onderzoek dat is gebaseerd op in vitro methoden, waarbij gebruikt wordt gemaakt van de A549 long epitheel cellijn en RSV als modelsystemen. In Hoofdstuk 4 wordt de metabole ontstekingsrespons onderzocht die door het aangeboren immuunsysteem wordt opgewekt na een infectie met RSV. In een driedaags experiment zijn A549 cellen geïnfecteerd met RSV en is metabolomics gebruikt om het cellulaire oxylipinen profiel op te helderen dat wordt gegenereerd in respons op een RSV infectie. Oxylipines zijn gespecialiseerde signaleringslipiden die een actieve rol spelen in het opwekken, in stand houden en afbouwen van een ontsteking. Complementair hieraan is een gerichte transcriptomics aanpak gebruikt, gericht op de genen die oxylipin-gerelateerde enzymen en receptoren coderen. Vervolgens is een data-analyse methode ontwikkeld om beide aanpakken te integreren. In de eerste 24 uur na RSV infectie laten A549 cellen een sterke pro-inflammatoire respons zien met opregulatie van de COX- II route en een vermindering in de P450 route. Gelijktijdige veranderingen in de oxylipinerespons van RSV geïnfecteerde cellen vergeleken met positieve en negatieve controles suggereren een kat-en-muis spel van gastheerorganisme-virus co-evolutie op een metabool niveau.

In Hoofdstuk 5 proberen we nieuw inzicht te verkrijgen in het tijdsverloop van de verstoorde redox biologie tijdens een in vitro infectie van A549 cellen met RSV. Met behulp van metabolomics en gerichte transcriptomics onderzoeken we de metabole gastheerorganisme-RSV relatie met betrekking tot redox biologie, cellulaire antioxidanten capaciteit en oxidatieve stress. We hebben verhoogde niveaus van lipide peroxidatie metabolieten gevonden binnen 24 uur na infectie, wat het vermogen van RSV onthult om na infectie oxidatieve stress te induceren in A549 cellen. Daarnaast liet metabolomics een aangetaste biogene amine antioxidatie capaciteit zien. Het gastheerorganisme lijkt geen passieve toeschouwer te zijn, aangezien we een opregulatie van alternatieve antioxidatie routes vonden, die resulteerden in verhoogde niveaus van proline en spermidine. Deze studie toont wederom het buitengewone vermogen van RSV aan om de respons van het gastheerorganisme te moduleren, wat resulteert in pathogene mechanismen op het metabool niveau.

Tot slot behandelt dit proefschrift twee klinische metabolomics studies. Hoofdstuk 6 heeft als doel de veranderingen in het metabolisme te karakteriseren tijdens de progressie over de vier klinische fases van een natuurlijke chronische hepatitis B-virus (HBV) infectie. Gerichte metabolomics platformen zijn gebruikt voor het karakteriseren van fosfolipiden, triglyceriden, sphingomyeline, aminozuren, acyl-carnitine en

236 signaleringslipiden profielen tijdens het natuurlijke progressieve verloop van chronische HBV en voor het identificeren van mogelijk voorspellende markers voor het vaststellen van de ernst van de ziekte en mogelijke nieuwe behandelopties. Op basis van bloedserum monsters van HBV geïnfecteerde patiënten hebben we metabole verstoringen geïdentificeerd die gerelateerd zijn aan leverfunctie en leverbeschadiging. Deze verstoringen weerspiegelen de natuurlijke progressie van de ziekte. Aangezien de lever het centrale orgaan is in de regulatie van voedingsstoffen en metabolisme, is het niet verrassend dat een chronische HBV-infectie meerdere metabole veranderingen induceert in de lipidenhuishouding van het gastheerorganisme door middel van virale hijacking. Deze veranderingen kunnen nuttig blijken als markers voor de progressie en de ernst van de ziekte. De gepresenteerde studie geeft bovendien meerdere aangrijpingspunten en inzichten voor het ontwerp van vervolgstudies, terwijl het ook duidelijk maakt dat er een complementaire systeembiologische aanpak nodig is om chronische HBV beter te begrijpen.

Hoofdstuk 7 omvat een studie in een groeiende populatie van kwetsbare baby’s die in utero zijn blootgesteld aan HIV en aan combinatie antiretrovirale therapie (cART). Gerichte metabolomics platformen zijn gebruikt om het metabolietenprofiel in navelstrengbloed te meten van baby’s geboren uit HIV geïnfecteerde moeders die in utero zijn blootgesteld aan cART en baby’s uit een controle groep die geboren zijn uit gezonde moeders. Om de interactie te kunnen bepalen tussen metabolieten en het immuunrespons hebben we ook klassieke cytokines en chemokines gekwantificeerd in dezelfde bloedmonsters en deze data geïntegreerd met de data verkregen uit de metabolomics platformen. Onze resultaten laten ernstige disregulatie zien van meerdere metabole routes in baby’s die in utero direct zijn blootgesteld aan cART en indirect aan HIV, waarmee de onderliggende randvoorwaarden voor een pro-inflammatoir milieu in baby’s wordt gecreëerd. Specifieker gezegd: het lipiden profiel was veranderd in baby’s die aan cART-HIV zijn blootgesteld, waarbij ten opzichte van controle baby’s triglyceriden significant verhoogd waren en fosfolipiden verlaagd. Daarnaast hebben we een toename van geoxideerde lipiden gedetecteerd, die gevormd worden na de productie van reactieve zuurstofverbindingen (ROS) door gedisreguleerde mitochondriën. Tot slot liet de integratie van metabolomics en klassieke immunologische markers zien dat veranderde lipide metabolieten en lipide peroxidatie producten geassocieerd zijn met respectievelijk verhoogde waardes van pro-inflammatoire lysofosfolipiden en verhoogde waardes van de pro-inflammatoire cytokines IL-1β en IP-10.

Samenvattend laat dit proefschrift zien dat we methodes op basis van metabolomics hebben

ontwikkeld, die belangrijke signaleringsmetabolieten kunnen meten in verscheidene biologische matrices. Deze

methodes zijn gebruikt in combinatie met bestaande metabolomics platformen om de interactie tussen

gastheerorganisme en virus te karakteriseren op het systemisch metabool niveau. De resultaten hebben de

opportunistische aard van virussen blootgelegd waarbij ze het metabolisme van een gastheerorganisme uit te

buiten voor hun eigen overleving. Tegelijkertijd is het gastheerorganisme geen gewillige prooi gebleken, omdat

mechanismen zijn gevonden die bedoeld zijn om de onbalans die door het virus wordt veroorzaakt te corrigeren.

235 235

ontwikkeling van een methode om het totale geoxideerde lipide profiel te meten. Daarna hebben we een methode voor de monstervoorbewerking ontwikkeld gebruik makend van β-glucuronide (afkomstig van koeienlever) gevolgd door LC-MS/MS analyse en deze methode gevalideerd. De methode is gevoelig en in staat om specifiek meer dan 70 geoxideerde lipiden te meten die gesynthetiseerd zijn via twee non-enzymatische routes (ROS, RNS) en drie enzymatische routes (COX, LOX en P450). Hiermee hebben we een voor patiënten non-invasieve methode ontwikkeld om ontsteking en oxidatieve stress te bepalen met behulp van urine.

Het hierop volgende deel van dit proefschrift richt zich op metabolomics onderzoek dat is gebaseerd op in vitro methoden, waarbij gebruikt wordt gemaakt van de A549 long epitheel cellijn en RSV als modelsystemen. In Hoofdstuk 4 wordt de metabole ontstekingsrespons onderzocht die door het aangeboren immuunsysteem wordt opgewekt na een infectie met RSV. In een driedaags experiment zijn A549 cellen geïnfecteerd met RSV en is metabolomics gebruikt om het cellulaire oxylipinen profiel op te helderen dat wordt gegenereerd in respons op een RSV infectie. Oxylipines zijn gespecialiseerde signaleringslipiden die een actieve rol spelen in het opwekken, in stand houden en afbouwen van een ontsteking. Complementair hieraan is een gerichte transcriptomics aanpak gebruikt, gericht op de genen die oxylipin-gerelateerde enzymen en receptoren coderen. Vervolgens is een data-analyse methode ontwikkeld om beide aanpakken te integreren. In de eerste 24 uur na RSV infectie laten A549 cellen een sterke pro-inflammatoire respons zien met opregulatie van de COX- II route en een vermindering in de P450 route. Gelijktijdige veranderingen in de oxylipinerespons van RSV geïnfecteerde cellen vergeleken met positieve en negatieve controles suggereren een kat-en-muis spel van gastheerorganisme-virus co-evolutie op een metabool niveau.

In Hoofdstuk 5 proberen we nieuw inzicht te verkrijgen in het tijdsverloop van de verstoorde redox biologie tijdens een in vitro infectie van A549 cellen met RSV. Met behulp van metabolomics en gerichte transcriptomics onderzoeken we de metabole gastheerorganisme-RSV relatie met betrekking tot redox biologie, cellulaire antioxidanten capaciteit en oxidatieve stress. We hebben verhoogde niveaus van lipide peroxidatie metabolieten gevonden binnen 24 uur na infectie, wat het vermogen van RSV onthult om na infectie oxidatieve stress te induceren in A549 cellen. Daarnaast liet metabolomics een aangetaste biogene amine antioxidatie capaciteit zien. Het gastheerorganisme lijkt geen passieve toeschouwer te zijn, aangezien we een opregulatie van alternatieve antioxidatie routes vonden, die resulteerden in verhoogde niveaus van proline en spermidine. Deze studie toont wederom het buitengewone vermogen van RSV aan om de respons van het gastheerorganisme te moduleren, wat resulteert in pathogene mechanismen op het metabool niveau.

Tot slot behandelt dit proefschrift twee klinische metabolomics studies. Hoofdstuk 6 heeft als doel de veranderingen in het metabolisme te karakteriseren tijdens de progressie over de vier klinische fases van een natuurlijke chronische hepatitis B-virus (HBV) infectie. Gerichte metabolomics platformen zijn gebruikt voor het karakteriseren van fosfolipiden, triglyceriden, sphingomyeline, aminozuren, acyl-carnitine en

236 signaleringslipiden profielen tijdens het natuurlijke progressieve verloop van chronische HBV en voor het identificeren van mogelijk voorspellende markers voor het vaststellen van de ernst van de ziekte en mogelijke nieuwe behandelopties. Op basis van bloedserum monsters van HBV geïnfecteerde patiënten hebben we metabole verstoringen geïdentificeerd die gerelateerd zijn aan leverfunctie en leverbeschadiging. Deze verstoringen weerspiegelen de natuurlijke progressie van de ziekte. Aangezien de lever het centrale orgaan is in de regulatie van voedingsstoffen en metabolisme, is het niet verrassend dat een chronische HBV-infectie meerdere metabole veranderingen induceert in de lipidenhuishouding van het gastheerorganisme door middel van virale hijacking. Deze veranderingen kunnen nuttig blijken als markers voor de progressie en de ernst van de ziekte. De gepresenteerde studie geeft bovendien meerdere aangrijpingspunten en inzichten voor het ontwerp van vervolgstudies, terwijl het ook duidelijk maakt dat er een complementaire systeembiologische aanpak nodig is om chronische HBV beter te begrijpen.

Hoofdstuk 7 omvat een studie in een groeiende populatie van kwetsbare baby’s die in utero zijn blootgesteld aan HIV en aan combinatie antiretrovirale therapie (cART). Gerichte metabolomics platformen zijn gebruikt om het metabolietenprofiel in navelstrengbloed te meten van baby’s geboren uit HIV geïnfecteerde moeders die in utero zijn blootgesteld aan cART en baby’s uit een controle groep die geboren zijn uit gezonde moeders. Om de interactie te kunnen bepalen tussen metabolieten en het immuunrespons hebben we ook klassieke cytokines en chemokines gekwantificeerd in dezelfde bloedmonsters en deze data geïntegreerd met de data verkregen uit de metabolomics platformen. Onze resultaten laten ernstige disregulatie zien van meerdere metabole routes in baby’s die in utero direct zijn blootgesteld aan cART en indirect aan HIV, waarmee de onderliggende randvoorwaarden voor een pro-inflammatoir milieu in baby’s wordt gecreëerd. Specifieker gezegd: het lipiden profiel was veranderd in baby’s die aan cART-HIV zijn blootgesteld, waarbij ten opzichte van controle baby’s triglyceriden significant verhoogd waren en fosfolipiden verlaagd. Daarnaast hebben we een toename van geoxideerde lipiden gedetecteerd, die gevormd worden na de productie van reactieve zuurstofverbindingen (ROS) door gedisreguleerde mitochondriën. Tot slot liet de integratie van metabolomics en klassieke immunologische markers zien dat veranderde lipide metabolieten en lipide peroxidatie producten geassocieerd zijn met respectievelijk verhoogde waardes van pro-inflammatoire lysofosfolipiden en verhoogde waardes van de pro-inflammatoire cytokines IL-1β en IP-10.

Samenvattend laat dit proefschrift zien dat we methodes op basis van metabolomics hebben

ontwikkeld, die belangrijke signaleringsmetabolieten kunnen meten in verscheidene biologische matrices. Deze

methodes zijn gebruikt in combinatie met bestaande metabolomics platformen om de interactie tussen

gastheerorganisme en virus te karakteriseren op het systemisch metabool niveau. De resultaten hebben de

opportunistische aard van virussen blootgelegd waarbij ze het metabolisme van een gastheerorganisme uit te

buiten voor hun eigen overleving. Tegelijkertijd is het gastheerorganisme geen gewillige prooi gebleken, omdat

mechanismen zijn gevonden die bedoeld zijn om de onbalans die door het virus wordt veroorzaakt te corrigeren.