Chemical tools to probe the proteasome
Verdoes, M.
Citation
Verdoes, M. (2008, December 19). Chemical tools to probe the proteasome. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/13370
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/13370
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
153
Hoewel afgelopen decennia uitgebreide studies zijn verricht valt er nog veel te ontdekken in het veld van het proteasoom onderzoek. De interdisciplinaire inspanningen op het grensvlak van de chemie en de biologie hebben het begrip over de rol van het proteasoom in een breed scala van processen in een stroomverselling gebracht. Een beknopt overzicht van de recente ontwikkelingen in het veld van chemische biologie gedreven proteasoom onderzoek is uiteengezet in Hoofdstuk 1. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift richt zich op de ontwikkeling van nieuw chemisch biologisch gereedschap waarmee proteasomen nauwgezetter bestudeerd kunnen worden.
De synthese en karakterisatie van de fluorescente, cell-permeabele en activiteits gebaseerde proteasoom probe BODIPY TMR-Ahx3L3VS (MV151) is beschreven in Hoofdstuk 2. Deze probe bewerkstelligt de snelle en gevoelige in-gel detectie van proteasoom activiteit in een gegeven monster gebruik makende van een fluorescentie scanner. De probe is gebruikt voor het labelen van de actieve proteasoom populatie in cel lysaten en in levende cellen. MV151 heeft een aantal voordelen vergeleken met eerder ontwikkelde probes in de zin dat Western blotten, radioactiviteit en gel drogen overbodig zijn. De distributie van MV151 was eenvoudig te detecteren in UbG76V-GFP transgene muizen en correleerde met de inhibitie van het proteasoom in het getroffen weefsel, gebaseerd op de accumulatie van de GFP-reporter. Het labellen van het proteasoom door middel van MV151 in combinatie met UbG76V-GFP transgene muizen is een bruikbare strategie voor het aantonen van de biodistributie van proteasoom inhibitoren. Ten slotte is een competitie experiment gebruik makende van MV151 een snelle en gevoelige methode
Samenvatting
Chemisch gereedschap voor het
bestuderen van het proteasoom
Samenvatting
154
gebleken voor het vaststellen van het inhibitie profiel (in de zin van potentie en subunit preferentie) van een gegeven proteasoom inhibitor.
De ontwikkeling van drie makkelijk toegankelijke alkyn gefunctionaliseerde BODIPY fluoroforen wordt besproken in Hoofdstuk 3. Deze fluoroforen kunnen chemoselectief worden gekoppeld aan elke willekeurig azide bevattende activiteits gebaseerde karakterisatie probe en azide gemodificeerde metaboliet. De toepasbaarheid van de alkyn bevattende BODIPYs is gedemonstreerd aan de hand van de synthese van drie epoxomicin afgeleide fluorescente proteasoom probes.
In Hoofdstuk 4 wordt de synthese van het bifunctionele azido-BODIPY zuur beschreven. In een activiteits gebaseerde eiwitprofilerings setting biedt deze nieuwe fluorofoor een keur aan flexibiliteit vergeleken met de conventionele monogefunctionaliseerde fluoroforen. Evenals de laatstgenoemde, maken azido-BODIPY uitgeruste activiteits gebaseerde probes snelle fluorescente detectie mogelijk en zijn deze probes compatibel met “live cell imaging” technieken. Gebruik makende van twee sets aan een- en twee-staps labeling proteasoom probes gebaseerd op azido-BODIPY werd vastgesteld dat de Staudinger-Bertozzi ligatie zo goed als quantitatief verloopt onder de toegepaste condities. Dit resultaat houdt in dat de efficiëntie van de eiwit labeling afhangt van de reactiviteit van de activiteits gebaseerde probe ten opzichte van het doel eiwit(familie) en niet van de chemoselectieve ligatie die gebruikt wordt in de tweede stap.
Dit betekent in essentie dat twee-staps activiteits gebaseerde eiwit profilering met dezelfde efficiëntie kan verlopen als het labelen van eiwitten in een gebruikelijke een-staps strategie.
Op peptiden gebaseerde proteasoom inhibitoren bestaan uit drie structurele entiteiten, namelijk 1) het “warhead”, de electrofiele val die reageert met het nucleofiele residu van het actieve centrum, 2) het peptidische herkenningselement dat fungeert als een sturingssequentie en 3) de N-terminale extentie. In Hoofdstuk 5 wordt uitgelegd dat deze structurele elementen van vijf veel gebruikte proteasoom inhibitoren kunnen worden gecombineerd wat resulteerde in een bibliotheek van 15 hybride proteasoom inhibitoren.
Met behulp van MV151 werd het inhibitie profiel van de bibliotheek bepaald. Het combineren van structurele elementen van bekende proteasoom remmers bleek een legitieme strategie voor de ontwikkeling van nieuwe potente proteasoom inhibitoren, daar een van epoxomicin afgeleide boor ester naar voren kwam als een van de meest potente peptide-gebaseerde proteasoom inhibitoren die zijn beschreven.
Samenvatting
155
Een soortgelijke strategie wordt behandeld in Hoofdstuk 6. In dit geval werden warheads en peptide herkennings elementen van beschreven subunit specifieke proteasoom inhibitoren gecombineerd. Onverwachts bleken alle vinyl ethyl ester gebaseerde verbindingen, inclusief de door Marastoni et al. beschreven 2 specifieke inhibitor niet actief in competitie experimenten tegen MV151. Een potentere op epoxyketon gebaseerde 1 specifieke proteasoom inhibitor werd ontwikkeld, naast de 5 specifieke vinyl sulfon en een op 2 en 5 gerichte epoxyketon. Deze hits werden ongevormd tot subunit specifieke twee-staps labelings probes door de introductie van een azide. Door het vervangen van de naphthylacetamide voor een azido-BODIPY werden een
5 specifieke en een op 2 en 5 gerichte fluorescente twee-staps labelings probe verkregen. Daarnaast leverde de conjugatie van een alkyn gefunctionaliseerde BODIPY met de 1 specifieke twee-staps probe een groen fluorescente probe op met een voorkeur voor
1, welke bij hogere concentraties 5 begint te labelen.
In Hoofdstuk 7 beschijft de synthese van vier epoxomicin analoga welke zijn uitgerust met een dieen. Deze probes bleken het proteasoom te inhiberen met een potentie in dezelfde orde van grootte als de moeder verbinding epoxomicin. Initiële Diels- Alder twee-staps proteasoom labeling experimenten, uitgevoerd op gezuiverd 20S proteasomen en gebruik makende van een dieen bevattende inhibitor en een fluorescent dienofiel, lieten zien dat de Diels-Alder een veel belovende alternatieve ligatie methode in activiteits gebaseerde eiwit profilering is. Om concurerend te worden met bestaande ligatie methoden is het nodig dat deze reactie wordt geoptimaliseerd.
