University of Groningen
Klotho in vascular biology
Mencke, Rik
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Mencke, R. (2018). Klotho in vascular biology. Rijksuniversiteit Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
467
468
Centraal in dit proefschrift staat de relatie tussen het van de nier afkomstige anti-verouderingseiwit Klotho en de bloedvaten, met bijzondere aandacht voor Klotho-expressie
in bloedvaten en voor de rol van Klotho in de hermodellering van slagaders. Hoofdstuk 2,
waarin we de bestaande literatuur samenvatten over Klotho-expressie en over door Klotho gemedieerde effecten op de bloedvaten, dient als een uitgangspunt. We bespreken wat er bekend is met betrekking tot Klotho in relatie tot vaatverkalking, dysfunctie van endotheelcellen (die de binnenlaag van bloedvaten bekleden), verhoogde doorlaatbaarheid van endotheel, hyperplasie van de lamina intima (de binnenlaag) van bloedvaten, verstijving van slagaders, hoge bloeddruk en slechte nieuwvorming van bloedvaten. Een kritische beschouwing van de literatuur brengt ons tot een aantal interessante en nieuwe concepten. Ten eerste, alle verschillen veroorzaakt door Klotho-deficiëntie in hoe organen, weefsels en cellen eruitzien en in welke genen en eiwitten tot expressie gebracht worden in muizen vertonen een opvallende gelijkenis met veroudering in mensen, voor zover specifiek onderzocht. Verder bleek dat, hoewel een hoge fosfaatspiegel in het bloed een voorwaarde is voor de ontwikkeling van vaatverkalking, een aantal interventies gericht op de moleculaire mechanismen geassocieerd met celveroudering resulteerden in minder vaatverkalking zonder een verlaging van de fosfaatspiegel in het bloed, wat suggereert dat de gevoeligheid van cellen voor verkalking een limiterende factor is en dat een hoge fosfaatspiegel in het bloed alleen niet voldoende is. Als laatste concluderen we dat de experimentele effecten van Klotho op de bloedvaten die bekend zijn Klotho als een zeer veelbelovend aangrijppunt voor therapeutische strategieën positioneren.
Deel I is gericht op Klotho-expressie. In Hoofdstuk 3 beginnen we met nog een overzicht van
de literatuur over Klotho-expressie, waarin we beschrijven dat het circulerende, oplosbare Klotho afkomstig is van de nier en in welke organen, weefsels en celtypen Klotho nog meer gemaakt wordt, waarbij we een uitspraak proberen te doen over de mate van Klotho-expressie en over hoe zeker we zijn van deze data. We beschouwen de antilichamen gericht tegen Klotho, waarbij we aangeven in hoeverre de validatie van deze antilichamen in de literatuur beschreven is. Hoewel we door meerdere, onafhankelijke argumenten zo zeker zijn als we maar zijn kunnen van het expressiepatroon van Klotho in de nier, is het onderwerp van Klotho-expressie in de bloedvaten hoogst controversieel en is het onderzoeksveld bezaaid met
elkaar tegensprekende data. Daarom hebben we in Hoofdstuk 4 onderzocht of
membraangebonden Klotho tot expressie komt in humane bloedvaten. Daartoe hebben we ons eerst gericht op expressie van membraangebonden Klotho in de nier, aan de hand waarvan we onze detectiemethoden gevalideerd hebben. We hebben verschillende antilichamen gebruikt, waaronder met name KM2076, welke we gevalideerd hebben middels Western blot, met recombinant (kunstmatig geproduceerd) Klotho als controle, met een competitie-assay met recombinant Klotho en met Klotho-knockoutweefsel als een negatieve controle. Na antilichaam KM2076 gevalideerd te hebben als specifiek voor Klotho in de nier, wat we in zowel humane nier als in muizennier hebben kunnen detecteren in de distale nierbuisjes, konden we vervolgens geen Klotho detecteren in vaatweefsel van gezonde donoren of van patiënten met een chronische nierziekte, noch middels Western blot, noch
469
middels immuunhistochemie. Ondanks het feit dat we een extreem lage expressie van Klotho/mRNA in bloedvaten gevonden hebben met qRT/PCR, hebben we naast het feit dat we membraangebonden Klotho-eiwit niet konden detecteren in bloedvaten, ook geen activatie van FGF23-signaaltransductie in de aorta gevonden na het geven van FGF23 aan muizen, terwijl de nier wel FGF23-signaaltransductie vertoonde in de lokale aanwezigheid van Klotho als co-receptor voor FGF23. Deze data geven aan dat membraangebonden Klotho, zoals tot expressive gebracht in de nier, niet gedetecteerd kan worden in bloedvaten, noch functioneel is als co-receptor voor FGF23.
We hebben vasculaire Klotho-expressie verder onderzocht in Hoofdstuk 5. Omdat veel studies
aangeven dat Klotho als een eiwit van 116 kDa voor zou komen (terwijl Klotho in de nier 130 kDa is) in gladde spiercellen, hebben we een anti-Klotho antilichaam gebruikt, Ab69208, dat een eiwit van 116 kDa detecteerde en een vasculair aankleuringspatroon liet zien. Ab69208, echter, detecteerde geen Klotho in de nierbuisjes en het aankleuringspatroon van Klotho in de nier met KM2076 en het aankleuringspatroon in bloedvaten met Ab69208 toonden geen overlap. Nadat we zowel volledige knockoutmuizen als slagader-specifieke Klotho-knockoutmuizen onderzocht hadden, die beide het vasculaire aankleuringspatroon lieten zien met Ab69208 zoals in wildtype muizen, hebben we geconcludeerd dat dit aankleuringspatroon niet specifiek is voor Klotho. Dit is een sterke aanwijzing dat aankleuringspatronen en banden op 116 kDa op Western blot met andere antilichamen tegen Klotho waarschijnlijk ook non-specifiek zijn, vooral als Klotho in de nier met deze antilichamen niet aangetoond wordt. In lijn met onze voorgaande PCR-bevindingen dat Klotho op een extreem laag niveau tot expressie gebracht wordt in bloedvaten, konden we Klotho-expressie detecteren in gladde spiercellen met RT-PCR, maar niet met RNA in situ hybridisatie. Om te beoordelen of dit lage expressieniveau relevant is voor de bloedvaten hebben we de slagader-specifieke Klotho-knockoutmuizen verder onderzocht en hebben we gevonden dat, hoewel ze
op het oog geen duidelijk fenotype hebben, deze SM22α-Cre/Klothoflox/flox-muizen functioneel
een slechte endotheelfunctie hebben evenals een slechte contractiefunctie van de gladde spiercellen, vergeleken met wildtype muizen. Deze slechte endotheelafhankelijke vaatrelaxatie zou kunnen betekenen dat een zeer kleine hoeveelheid Klotho gemaakt in bloedvaten invloed heeft op de communicatie van gladde spiercellen naar endotheelcellen aan de onderzijde/zijkant van de endotheelcellen. Omdat endotheelcellen voortdurend blootgesteld worden aan Klotho in het bloed aan de “bovenkant” van de cellen, hypothetiseren we dat kleine hoeveelheden Klotho gemaakt door gladde spiercellen waarschijnlijk de gladde spiercellen zelf beïnvloeden om de communicatie van gladde spiercel naar endotheelcel via andere mediatoren te moduleren. De slechtere contractiefunctie zou kunnen betekenen dat lokaal geproduceerd Klotho belangrijk is om de differentiatie van gladde spiercellen en de contractiele functie te handhaven.
Vervolgens, in Hoofdstuk 6, hebben we de expressie van het gepostuleerde uitgescheiden
Klotho-eiwit onderzocht, welke lang verondersteld werd geproduceerd te worden op basis van een alternatief gespliced Klotho-mRNA-transcript. We hebben ons wederom eerst op de
470
nier gericht en, bij gebrek aan methoden om dit eiwit specifiek te detecteren, hebben we ons eerst gericht op de gen- en mRNA-niveau’s. Het humane, alternatieve Klotho-mRNA bevat een prematuur stopcodon tussen exons 3 en 4, welke theoretisch de degradatie van het transcript in gang zou zetten door nonsense-gemedieerde mRNA-afbraak. Door in deze afbraakroute te interfereren in HK-2-cellen in vitro, zowel als met RNA-immuunprecipitatie, polysoomfractionering en RNA-in situ hybridisatie, hebben we geconcludeerd dat het alternatieve Klotho-mRNA inderdaad onderhevig is aan nonsense-gemedieerde mRNA-afbraak en dat dit niet tot expressie gebracht wordt als eiwit. Dit zou betekenen dat het veronderstelde uitgescheiden eiwit niet bestaat en we hebben een dergelijk Klotho-eiwit ook niet kunnen detecteren in geconditioneerd medium. Er lijkt, echter, wel een klinische relevantie te bestaan voor deze bevinding, daar de relatieve hoeveelheid van het alternatieve Klotho-transcript sterk toeneemt in patiënten met acute nierschade. Deze waarschijnlijk dysregulatie van de splicingefficiëntie zou in principe resulteren in een verlaagde expressie van het membraangebonden Klotho, wat hoogst relevant is, omdat expressie sterk verlaagd wordt bij acute nierschade, maar het behoud van Klotho-expressie de nier juist zou beschermen tegen nierschade. Hoewel andere mechanismen, zoals hypermethylering van de promoter, ook bekend zijn waardoor Klotho-expressie verlaagd wordt, hypothetiseren we dat de verlaging van Klotho bij een verlies van splicingefficiëntie ten faveure van een niet-getransleerd transcript, resulterend in minder membraangebonden Klotho-eiwit, een additioneel mechanisme is waardoor Klotho-expressie verloren gaat en waardoor de nier in een vicieuze cirkel geraakt van Klotho-downregulatie en continue met kleine stapjes verslechterende nierschade. Geconcludeerd hebbende dat uitgescheiden Klotho geproduceerd door de nier in feite niet bestaat, hebben we de expressie daarvan in de bloedvaten niet onderzocht.
Samenvattend concluderen we in Deel I dat
membraangebonden Klotho niet detecteerbaar is in bloedvaten uitgescheiden Klotho niet bestaat
wat vaak voor vasculair Klotho aangezien wordt waarschijnlijk niet-specifiek is een extreem lage hoeveelheid lokale Klotho-expressie in bloedvaten wel degelijk
belangrijk is voor de vaatfunctie.
In Deel II, over de rol van Klotho in vaatremodellering, hebben we de effecten verder
onderzocht van Klotho op de differentiatie van gladde spiercellen en op het afwijkende gedrag van gladde spiercellen dat ontstaat in de afwezigheid van Klotho, zoals vaatverkalking. Vaatverkalking is een actief proces, waarin de gladde spiercellen dedifferentiëren en een
genprofiel gaan laten zien wat lijkt op dat van botvormende cellen. In Hoofdstuk 7 hebben we
de ontwikkeling van vaatverkalking in Klothodeficiëntie bestudeerd met NaF-18, een bottracer die nu onderzocht wordt voor het bestuderen van vaatverkalking, in µPET-CT en autoradiografie. Terwijl met µPET-CT geen signaal gedetecteerd kon worden, lieten de audiografiescans zien dat vaatverkalking bij Klothodeficiëntie begint in de aortaboog en in de
471
buikaorta. Omdat vasculaire calcificaties slechts heel sporadisch gevonden werden met histochemische methoden, geeft de veel uitgebreider gedetecteerde NaF-18-signatuur aan dat NaF-18 een geschikte tracer is voor microcalcificaties. Mechanistisch hebben we voor het
eerst gevonden dat er een sterk verhoogde calcificatieneiging bestaat in het serum van Klotho
-/--muizen in een stadium nog zonder duidelijke histologische calcificaties, wat suggereert dat
het fetuine A-systeem en de rijping van secundaire calciprotein partikels (CPP’s) rollen zouden kunnen spelen in de aetiologie van door Klotho-deficiëntie geïnduceerde vaatverkalking. We vonden vervolgens inderdaad dat Klotho de door CPP’s geïnduceerde verkalking van gladde spiercellen in vitro kon remmen.
In Hoofdstuk 8 hebben we de bloedvaten in de nieren van Klotho-/--muizen onderzocht,
waarin zoals gezegd geen verkalkingen voorkwamen. In plaats daarvan vonden we arteriolaire hyalinose, een vaatafwijking die gevonden wordt bij veroudering, bij hoge bloeddruk en na transplantatie en welke nog niet eerder is beschreven in relatie tot Klotho-deficiëntie. We konden plasma-eiwitten detecteren in de hyalineuze laesies, die aangeven dat het endotheel verhoogd doorlaatbaar is, evenals meer extracellulaire matrixeiwitten, die een verhoogde aanmaak door gladde spiercellen aangeven. Gladde spiercellen in deze laesies hebben ook hun gedifferentieerde, contractiele fenotype verloren, terwijl ze markers vertoonden die geassocieerd zijn met een meer synthetisch fenotype. Om te beoordelen of het voorkomen
van arteriolaire hyalinose in Klotho-/--muizen een algemeen fenomeen is dat optreedt bij
Klotho-deficiëntie, hebben we andere Klotho-knockoutlijnen bestudeerd, die variabel arteriolaire hyalinose lieten zien. In kl/kl-muizen (de oorspronkelijke muizen met een disruptie in de Klotho-promoter) in het bijzonder overheerste vasculaire calcificatie, in de plaats waarvan echter arteriolaire hyalinose voorkwam wanneer de ontwikkeling van vaatverkalking geremd werd door spironolacton. Deze bevindingen vormen nieuwe indicaties dat Klotho-deficiëntie primair niet gekenmerkt wordt door calcificatie, maar door dedifferentiatie van gladde spiercellen, gevolgd door een fenotypische transitie in één van verschillende richtingen.
Hoofdstuk 9 biedt nog meer bewijs wat deze hypothese ondersteunt. Nadat het
oorspronkelijk gerapporteerd was dat Klotho-deficiënte muizen intimahyperplasie (een verdikking van de binnenlaag van bloedvaten), zijn nadere observaties of studies naar dit fenomeen niet beschreven. Omdat intimahyperplasie een proces is waarin de gladde spiercellen vanuit de middelste laag van de vaatwand dedifferentiëren en migreren naar de binnenlaag, waar ze vervolgens zich vermeerderen en het vat obstrueren, waren we geïnteresseerd in het onderzoeken van het eventuele migreren van gladde spiercellen in
Klotho-deficiëntie. Na geen spontane intimahyperplasie waargenomen te hebben in Klotho
-/--muizen, hebben we echter wel gevonden dat Klotho+/--muizen een versterkte respons
vertonen vergeleken met wildtype muizen na beschadiging van de vaatwand met een draad of na cuffing van een slagader, met een ernstigere vernauwing van het bloedvat en/of een groter neotinima-oppervlak, hoewel in het cuffing-model dit effect zou kunnen komen door minder uitdunning van de vaatwand in partiële Klotho-deficiëntie. Daarnaast vertoonden
472
kl/kl-muizen wel spontane intimahyperplasie, wat nog uitgesprokener werd na remming van
vaatverkalking met spironolacton. De hypothese dat Klotho dedifferentiatie van gladde spiercellen remt wordt verder ondersteund door de bevinding dat recombinant Klotho in vitro de migratie van gladde spiercellen remt.
In Hoofdstuk 10 hebben we vaatfunctie in Klotho-deficiëntie onderzocht. We hebben eerst
bevestigd dat Klotho-/--muizen endotheeldysfunctie vertonen, wat verrassend genoeg niet het
geval was in Klotho+/--muizen, zelfs niet op een leeftijd van 1 jaar. We hebben verschillende
stoffen gebruikt om aortaringetjes te pre-contraheren, omdat de gevoeligheid voor
phenylephrine ook veranderd was in Klotho-/--muizen, wat een reflectie zou kunnen zijn van
het premature verouderingsfenotype in Klotho-deficiëntie. Als laatste laten we eerste indicaties zien dat oplosbaar Klotho zelf mogelijk de door Klotho-deficiëntie geïnduceerde endotheeldysfunctie kan verbeteren. Naast een functioneel gevolg van Klotho-deficiëntie in de vorm van een verschil in contractiliteit, bevestigen deze data de verregaande effecten die Klotho heeft op het endotheel.
We hebben ons verder gericht op het endotheel in Hoofdstuk 11, waarin we de rol hebben
onderzocht van Klotho in angiogenese (bloedvatnieuwvorming) en tumorangiogenese (bloedvatnieuwvorming geïnitieerd door een tumor) in het glioblastoom, een sterk gevasculariseerde primaire hersentumor. We hebben gevonden dat Klotho de buisjesvorming van microvasculair endotheel in vitro remde, terwijl er geen effect was van Klotho op bloedvatnieuwvorming in een kippeneimembraanmodel van bloedvatnieuwvorming in ovo. Deze data verhelderen niet wezenlijk de directe effecten van Klotho op bloedvatnieuwvorming, naast dat ze wellicht de hypothese versterken dat de effecten van Klotho op bloedvatnieuwvorming mogelijkerwijs verschillend zijn in verschillende weefsels of afhankelijk zijn van het type endotheelcel. Meer onderzoek met meer modellen is nodig om de relatie tussen Klotho en bloedvatnieuwvorming inzichtelijk te maken. We hebben echter wel gevonden dat Klotho bloedvatnieuwvorming geïnduceerd door verschillende glioblastoomcellijnen kon remmen, zowel in vitro als in ovo, hoewel we geen effect hebben gevonden van Klotho op tumorgroei or bloedvatnieuwvorming in tumoren in muizen met glioblastoomxenotransplantaten, waarvan we vermoeden dat dit een excessief pro-angiogeen model is. Ondanks deze in vivo-resultaten denken we dat onze data laten zien dat Klotho als een remmer van tumorbloedvatnieuwvorming kan ageren en we hypothetiseren dat de anti-tumoreffecten gemedieerd door Klotho, zoals beschreven in andere studies, waarschijnlijk ten dele aan een remming op de tumorbloedvatnieuwvorming toegeschreven kunnen worden.
We concluderen in Deel II dat
Klotho een essentiële factor is in het reguleren van arteriële hermodelling
Klotho-deficiëntie spontaan kan leiden tot vasculaire calcificatie, arteriolaire hyalinose en intimahyperplasie
Klotho-deficiëntie endotheeldysfunctie induceert
473
In Deel III proberen we te beginnen een weg te banen voor toekomstige klinische
toepassingen van Klotho. Daartoe hebben we eerst in Hoofdstuk 12 de op Klotho gebaseerde
therapeutische strategieën beschouwd die experimenteel gebruikt zijn, zowel breed in modellen van fibrose en kanker en specifiek middels nieuwe methoden van “targeted therapy”. We bespreken welke domeinen van het Klotho-eiwit met welke functies samenhangen, wat nuttig zou kunnen zijn in het van elkaar isoleren van verschillende door Klotho gemedieerde effecten. We bespreken ook welke technische problemen er nog bestaan in het ontwerpen van op Klotho gebaseerde therapieën.
In Hoofdstuk 13 bespreken we of er andere aspecten zijn aan Klotho die gebruikt kunnen
worden in de kliniek, bijvoorbeeld diagnostisch of als voorspellende factor. Verschillende mutaties (SNP’s) in het Klotho-gen zijn bestudeerd in relatie tot vaatziekten en heterozygoten voor het KL-VS-allel zijn wellicht beschermd tegen hart- en vaatziekten, terwijl homozygoten voor KL-VS mogelijkerwijs meer risico lopen hart- en vaatziekten te ontwikkelen. Bovendien, terwijl er veel studies gedaan zijn naar Klotho serumspiegels in relatie tot nier- of vaatziekten, zijn de huidige, beschikbare ELISA’s niet betrouwbaar genoeg om betekenisvolle conclusies te verbinden aan data geproduceerd met deze assay’s. Kortom, er lijkt nog geen rol te bestaan voor Klotho-SNPs als een risicofactor of voor het meten van de serumspiegels van oplosbaar Klotho in de kliniek.
In Hoofdstuk 14 hebben we gevonden dat de intron-SNP’s rs577912 en rs553791 in het
Klotho-gen in de ontvangers van een getransplanteerde nier negatief geassocieerd zijn met de overleving van het transplantaat. De bevinding dat SNP’s in de ontvangers, en niet in de donors, in het Klotho-gen potentieel klinisch relevant zijn wijst op een potentiële rol voor Klotho in het immuunsysteem van de ontvanger en de interactie daarvan met de getransplanteerde nier. Deze mogelijkheid suggereert nog een mogelijke rol voor Klotho in celtypen die slechts in kleine hoeveelheden Klotho produceren.
We concluderen in Deel III dat
er zowel kansen als uitdagingen bestaan voor op Klotho gebaseerde therapieën het potentiële gebruik van Klotho-SNP’s als een risikofactor en van oplosbaar Klotho
als een biomarker op dit moment nog niet voldoende ondersteund wordt door bewijs een toekomstige rol voor Klotho in diagnostiek zeker mogelijk is.
