University of Groningen
Computational modeling of cholesterol metabolism
Paalvast, Thijs
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Paalvast, T. (2019). Computational modeling of cholesterol metabolism. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
283
English summary
Cardiovascular risk factors such as obesity, insulin resistance, high plasma triglyceride and low HDL cholesterol cluster together. This clustering of risk factors is commonly reffered to as metabolic syndrome. To learn more about metabolic syndrome, diet-induced obesity in mice is often used as a proxy for the same condition in humans. Mice however, have a very different lipoprotein profile than humans, and have lower LDL cholesterol and triglycerides than humans. Therefore, in this dissertation, apoE*3Leiden.CETP-mice are used, that have a humanized lipid profile. By feeding these mice with a humanized lipid profile a diet relatively rich in fat and cholesterol, and by monitoring how the mice subsequently increase in body weight, and how plasma levels of lipids, glucose and insulin change, and how for example the food intake and excretion of cholesterol change over time, the natural course of metabolic syndrome may be studied. Moreover, by integrating this data into a computer model that takes into account how metabolic pathways interact, predictions can be made about how non-measured components within glucose and lipid metabolism must change in activity over time. If this component is measurable, such a prediction may then be verified. This dissertation describes how such a method may be used to gain new insights about what determines individual susceptibility towards developing metabolic syndrome. It was found that, at least in mice, a higher concentration of unabsorbed fat in faeces is accompanied by mitigation of diet-induced obesity, lower plasma lipids, and less insulin resistance. Mice with reduced susceptibility to the metabolic syndrome were characterized by both a lower rate of bile salt production and changes in the bile acid profile. By subsequently manipulating bile acid production pharmacologically, we could change bile acid profiles in prone mice to the profile otherwise observed in non-prone mice. Upon this pharmacological intervention, body weight and plasma lipids are largely normalized. Since these mice have a human lipid profile, drugs with the same mechanism may likely have a similar effect on people, thus instilling hope that a new and effective class of drugs for people who are overweight and have high plasma triglyceride and cholesterol levels may soon become available.
Chapter 1 discusses how metabolic syndrome is currently understood. While many theories exist concerning metabolic syndrome, most center around the idea that metabolic syndrome is triggered by exceeding the storage capacity of fat. Upon exceeding the storage capacity, fat starts leaking out of the adipose tissue and instead accumulates in other tissues, thereby impairing tissue function. The leaking of free fatty acids from adipose tissue, among other things, impairs the ability of muscles to absorb glucose, resulting in higher insulin (insulin resistance), and ultimately higher
284
glucose levels (diabetes). High plasma triglycerides are also strongly associated with increased body weight. Studies in which both the production and clearance of triglyceride-rich lipoproteins (VLDL) are measured indicate that especially increased production of these particles explains the high plasma triglyceride, but that in addition clearance is often decreased. The idea is that the higher VLDL production is driven by an increased uptake of fatty acids from the adipose tissue and, driven by higher insulin levels, also by an increased production of fat in the liver. The higher VLDL production, in combination with a reduced expression of the LDL receptor, ensures that LDL-C in metabolic syndrome is usually also increased. The relation between cholesterol metabolism and metabolic syndrome however, is much less developed than that for plasma triglycerides and insulin resistance, and as such, an elevated LDL cholesterol is not actually part of the definition of metabolic syndrome. Notwithstanding, it is obvious that (increased) LDL cholesterol leads to atherosclerosis, which makes cholesterol metabolism an important factor in the metabolic syndrome.
Chapter 2 provides an overview of computer models of cholesterol metabolism, discusses them in detail, and moreover subjects these models to a test by evaluating how the models behave upon simulating treatment with statins. The idea is that if models can be validated in this way, they may be used as a module in a larger-scale model. We found that while some models actually passed this test, by and large we had to conclude that the field as a whole is still in its infancy. However, we expect that over time computer models will increasingly be able to replicate experiments and be used more widely .
In chapter 3 we present an agent-based model of lipoprotein metabolism. Agent-based models center around agents, where agents are independently operating elements within the simulation of the computer model, and consists of rules that dictate how these agents interact. The aim of the model was to gain more insight into why high plasma triglyceride is associated with low HDL cholesterol. The prevailing idea is that upon high plasma triglycerides, triglycerides in VLDL are exchanged with the cholesterol ester in HDL, after which the triglycerides in HDL are in turn depleted by the enzymes hepatic lipase and endothelial lipase, resulting in low HDL cholesterol. Furthermore, because this results in smaller HDL, HDL will then be cleared by the kidneys more rapidly, also resulting in decreased HDL.
An alternative explanation for the relation bethween plasma triglycerides and HDL is that surface lipids released during the breakdown of VLDL, become available as substrate for the production of HDL cholesterol ester by the enzyme LCAT. From this perspective, a low plasma triglyceride suggests a higher rate of lipolysis and should be
285
associated with a higher rate of HDL-cholesterol ester production and thus higher HDL cholesterol. The advantage of an agent-based model is that because individual agents can operate independently of eachother, it studying the exchange of lipids between these agents becomes more straightforward. In addition, variation in size and composition, which occur in lipoproteins as a result of this exchange, will automatically be taken into account since the properties of each individual simulated lipoprotein particle are necessarily tracked by the program. After we tested the model for correctly simulating genetic defects in lipoprotein metabolism, we simulated increased VLDL production as it occurs in people with metabolic syndrome. Surprisingly, whereas according to the current theories HDL should decrease, we instead found an increase in HDL because increased VLDL production also made more surface lipids available for the production of HDL cholesterol ester. Interestingly, the combination of higher VLDL production with faster clearance of HDL could only be replicated in the model if it was also assumed that there is an HDL-independent path that handles the superfluous surface lipids of VLDL during lipolysis.
Chapter 4 describes how male mice with a human lipid profile, apoE*3Leiden.CETP mice, respond to a fat and cholesterol-rich diet over the course of a 6 months period. An important observation in this study was that body weight, plasma lipids, and insulin resistance all increase non-linearly over time, reach a maximum, and then change direction. Interestingly, the changes in plasma lipids are reminiscent of the trajectory which plasma lipids follow in men throughout life, which also decrease in advanced age. Another important observation in this study was that apoE*3Leiden.CETP mice show large variation in their response to high-fat diet and that not all animals showed a strong increase in body weight, insulin resistance and increase in plasma lipids.
In chapter 5 the data described in chapter 4 is further investigated so that more could be learned about the source of this variation. We integrated the longitudinal data described in chapter 4 with a computational model of glucose and lipid metabolism (MINGLeD; Model INtegrating Glucose and Lipid Dynamics), by applying a method known as Analysis of Dynamic Adaptations in Parameter Trajectories (ADAPT), that allows the parameters of a model to gradually change over the simulated time period, thereby also predicting how the corresponding process should change in activity. ADAPT predicted that animals that do not respond with a high plasma triglyceride to high-fat cholesterol-rich diet, and thus appear non-prone to develop metabolic syndrome, may be characterized by higher energy expenditure and decreased cholesterol absorption. These predictions however could not be confirmed by a validation experiment. However, another prediction was that animals with a mild response to the diet may be characterized by decreased fat absorption. Interestingly, we
286
found that fecal fat excretion was increased, suggesting that this is indeed the case. In addition, the increased fat excretion was strongly correlated to decreased fecal bile acid excretion, which in turn suggests that a large part of the variation may be explained by differences in bile acid metabolism.
In chapter 6 an FXR agonist is used to manipulate bile acid metabolism in mice, in such a way that mice prone to develop metabolic syndrome, obtain a bile acid profile similar to mice that are not. After eight weeks of high fat and cholesterol-rich diet the FXR agonist was added to the diet for an additional period of four weeks. We then observed that fecal bile acid excretion, which also reflects bile acid production rate, was strongly decreased, and that the bile acid profile had shifted to a bile acid profile consisting of predominantly hydrophilic bile acids, which are less efficient in promoting cholesterol absorption than more hydrophobic bile acids. In line with these observations, we also observed decreased cholesterol absorption and increased fecal cholesterol excretion. Interestingly, these changes were accompanied by a sharp decrease in plasma triglycerides, plasma cholesterol levels, and a marked decrease in body weight. Reminiscent of the findings in non-prone mice in chapter 5, fecal fat excretion was increased in treated mice. Furthermore, food intake was reduced in response to the FXR agonist. A final interesting finding was that while the total amount of liver fat was not decreased, the localization of liver fat accumulation shifted from pericentral to periportal. By integrating the data with the MINGleD computer model (see chapter 5), we found that a possible explanation for this phenomenon is that an increased portion of intestinally absorbed fat is directed to the periportal part of the liver.
In chapter 7 recent developments in fat and cholesterol absorption are discussed. One important development is that it has recently been shown that humans do not only clear cholesterol from the body through biliary cholesterol secretion, but also through a pathway in which cholesterol is transported from the plasma to the intestinal lumen, a process known as trans-intestinal cholesterol excretion (TICE). While this pathway had previously been shown to be present in mice, and to be enhanced through production of hydrophilic bile acids, it was yet to be demonstrated in humans. Importantly, TICE in humans can be enhanced with medication, thereby lowering plasma cholesterol. Promoting the clearance of cholesterol in this way may therefore provide a new strategy to further decrease cardiovascular risk.
Chapter 8 discusses how the findings described in this thesis fit in with current understanding metabolic syndrome, and what should be done to improve treatment
287
metabolic syndrome in the future. I then argue that FXR agonists could play an important role.
289
Nederlandse samenvatting
Het metabool syndroom is de clustering van cardiovasculaire risicofactoren en wordt gekenmerkt door overgewicht, insuline-resistentie, hoog plasma triglyceride en laag HDL cholesterol. Het verloop van metabool syndroom in mensen kan nagebootst worden door muizen met een gehumaniseerd lipidenprofiel op een dieet te zetten met relatief veel vet en cholesterol. Door vervolgens te volgen hoe de muizen toenemen in lichaamsgewicht, hoe de plasmaspiegels van lipiden, glucose en insuline veranderen, en hoe bijvoorbeeld de voedselinname en excretie van cholesterol veranderen over de tijd, kan dan een idee gevormd worden over het natuurlijk beloop. Bovendien, door deze gegevens te integreren in een computermodel die rekening houdt met hoe de betrokken stofwisselingspaden op elkaar inwerken, kunnen voorspellingen worden gedaan over hoe niet-gemeten onderdelen binnen de stofwisseling en cholesterolhuishouding door de tijd heen moeten veranderen in activiteit. Indien meetbaar, kan dan gecontroleerd worden of de voorspellingen kloppen. In dit proefschrift wordt beschreven hoe een dergelijke werkwijze gebruikt kan worden om tot nieuwe inzichten te komen over wat nu eigenlijk bepaalt of iemand wel of geen metabool syndroom krijgt. Het blijkt dat, in ieder geval bij muizen, een hogere concentratie niet-geabsorbeerde vetten in de ontlasting gepaard gaat met een minder sterke toename van het lichaamsgewicht, lagere plasmalipiden, en minder insuline-resistentie. De muizen met een verminderde vatbaarheid voor het metabool syndroom werden gekenmerkt door een lagere galzoutproductie en een veranderd galzoutprofiel. Door de galzoutproductie met een medicijn te manipuleren zodat het galzoutprofiel gaat lijken op die bij muizen die geen metabool syndroom krijgen op een vetrijk dieet, blijken we in staat om bij muizen die wel sterk toenemen in lichaamsgewicht en hoge plasma lipiden ontwikkelen, zowel lichaamsgewicht als plasmalipiden grotendeels te normaliseren. Omdat deze muizen een menselijk lipidenprofiel bezitten, geeft dit hoop dat middelen met hetzelfde werkingsmechanisme een soortgelijk effect op mensen zullen hebben, wat zou betekenen dat er dan een nieuwe en effectieve groep medicijnen beschikbaar gaat komen voor mensen die kampen met overgewicht en te hoge plasma triglyceride- en cholesterolwaardes hebben.
In hoofdstuk 1 leg ik uit wat er tot nu toe bekend is over het metabool syndroom. Er zijn veel theorieën over de verschillende factoren die bij metabool syndroom een rol spelen, maar het centrale idee is dat alles begint met overschrijding van de opslagcapaciteit van het vet. Vet begint dan te lekken uit het vetweefsel en gaat zich ophopen op andere plekken in het lichaam waardoor deze weefsels zich anders gaan gedragen en in hun functie beperkt worden. De lekkende vetten zorgen er ondere andere voor dat de spieren minder makkelijk glucose opnemen, met als gevolg dat de
290
insuline spiegel (insuline-resistentie), en uiteindelijk ook die van glucose stijgt (suikerziekte). Hoge plasma triglyceriden ook sterk gekoppeld zijn aan het lichaamsgewicht. Studies waarbij zowel de productie als klaring van trigyceride-rijke lipoproteinen (VLDL) wordt gemeten, wijzen erop dat met name verhoogde productie van deze deeltjes het hoge plasma triglyceride verklaard, maar dat desalniettemin ook de klaring vaak lager is. Het idee is dat de hogere VLDL-productie gedreven wordt door een toegenomen opname van vetten afkomstig van het vetweefsel en, gedreven door hogere insuline spiegels, ook door een verhoogde productie van vet in de lever. De hogere VLDL-productie, in combinatie met een verminderde expressie van de LDL-receptor, zorgt er voor dat LDL-C in metabool syndroom doorgaans ook verhoogd is. De relatie tussen cholesterolhuishouding en metabool syndroom is echter veel minder ontwikkeld dan die met plasma triglyceriden en insuline-resistentie, en een verhoogd LDL-cholesterol als zodanig maakt dan ook geen deel uit van de definitie van metabool syndroom. Definities daargelaten is het overduidelijk dat (verhoogd) LDL-cholesterol tot aderverkalking leidt, wat de cholesterolhuishouding to een niet te negeren factor in het metabool syndroom maakt.
In hoofdstuk 2 wordt een overzicht van computermodellen van het cholesterol metabolisme gegeven, in detail besproken, en getest door een behandeling met statines te simuleren. Het idee is dat als modellen op deze manier valideerbaar blijken, ze ook als module in een grootschaliger model gebruikt moeten kunnen worden. We vonden dat enkele modellen inderdaad slaagden voor deze test, maar door de bank genomen moesten we concluderen dat het veld als geheel nog in de kinderschoenen staat. De verwachting is dat met de tijd computermodellen steeds beter in staat zullen zijn om experimenten te repliceren en breder ingezet kunnen worden.
In hoofdstuk 3 presenteer ik een agent-gebaseerd computermodel. Agent-gebaseerde modellen zijn opgebouwd uit een set van regels die het doen en laten van ‘agents’ bepalen, waar agents zelfstandig opererende elementen binnen de simulatie van het computermodel zijn. Het doel van het model was om meer inzicht te krijgen in hoe de correlatie tussen een hoog plasma triglyceride en een laag HDL-cholesterol tot stand komt. Het prevalerende idee is dat het HDL-cholesterol laag is als het plasma triglyceride hoog is doordat triglyceriden uit VLDL worden uitgewisseld met cholesterol ester in HDL, waarna het triglyceride in HDL wordt afgebroken door enzymen als lever-lipase en endotheel-lipase. Het resulterende kleinere HDL zou dan vervolgens makkelijker geklaard worden door de nieren. Een andere verklaring van deze relatie is dat de extra oppervlakte-lipiden die vrijkomen tijdens de afbraak van VLDL beschikbaar komen voor de productie van HDL-cholesterol ester. Een laag plasma triglyceride suggereert dan immers een snellere afbraak van VLDL en dus meer HDL-cholesterol ester productie. Het voordeel van een agent-gebaseerd model is dat
291
doordat individuele agenten onafhankelijk van elkaar kunnen opereren, het eenvoudiger wordt om uitwisseling van lipiden tussen deze agenten te bestuderen. Daarbij doet het model automatisch recht aan de variatie in grootte en samenstelling die in lipoproteines als gevolg van deze uitwisseling voorkomen doordat de eigenschappen van elk individueel gesimuleerde lipoproteine-deeltje noodgedwongen worden bijgehouden. Nadat we het model getoetst hadden op het correct simuleren van monogenetische afwijkingen in het lipoproteinen metabolisme, simuleerden we een toegenomen VLDL-productie zoals die ook bij mensen met het metabool syndroom voorkomt. Terwijl volgens de huidige theorieën het HDL dan lager zou moeten worden, vonden we juist een verhoging van het HDL doordat er door de toegenomen VLDL-productie ook meer oppervlakte-lipiden voor de productie van HDL-cholesterol ester beschikbaar kwam. De combinatie van een hogere VLDL-productie met een snellere klaring van HDL kon alleen in het model gerepliceerd worden als tegelijkertijd werd aangenomen dat er een HDL-onafhankelijk pad is dat de overbodige oppervlakte lipiden van VLDL verwerkt tijdens de lipolyse.
In hoofdstuk 4 wordt beschreven hoe mannelijke muizen met een menselijk lipidenprofiel, apoE*3Leiden.CETP muizen, zich ontwikkelen op een vet en cholesterol-rijk dieet over een periode van 6 maanden. Een belangrijke observatie in deze studie was dat lichaamsgewicht, plasma lipiden en insuline-resistentie niet lineair met de tijd toenamen, maar een maximum bereikten, waarna deze parameters zich in tegengestelde richting begonnen te ontwikkelen. Interessant genoeg lijken de veranderingen in plasma lipiden op het traject die plasma lipiden in mannen afleggen in hun leven, waarbij deze ook dalen bij (ver) gevorderde leeftijd. Een andere belangrijke observatie in deze studie was dat apoE*3Leiden.CETP muizen een grote variatie laten zien in hun respons op het vetrijk dieet en dus niet allemaal een sterke toename van het lichaamsgewicht, insuline-resistentie en stijging van plasmalipiden lieten zien.
In hoofdstuk 5 gebruik ik een computationele methode op de data beschreven in hoofdstuk 4 om meer te weten te komen over hoe deze variatie tot stand zou kunnen komen. Integreren van de longitudinale data met een grofmazig model van de stofwisseling, wijst erop dat dieren die niet reageren met een hoog plasma triglyceride op dieet, gekenmerkt zouden kunnen worden door een hoger energieverbruik en een lagere cholesterol absorptie. Deze voorspellingen konden echter niet bevestigd worden met een validatie-experiment. Een andere voorspelling was dat dieren met een milde respons op dieet mogelijk een lagere vetabsorptie hebben. We vonden toen dat de fecale vet-uitscheiding verhoogd was, wat suggereert dat dit inderdaad het geval is. Daarbij was de verhoogde vet-excretie sterk gecorreleerd aan een verminderde fecale
292
galzout-excretie, wat op zijn beurt suggereert dat een groot gedeelte van de variatie wel eens verklaard zou kunnen worden door intrinsieke verschillen in de galzoutstofwisseling.
In hoofdstuk 6 wordt een FXR-agonist gebruikt om de galzoutstofwisseling in de muizen te beïnvloeden, op zo’n manier dat de muizen die gevoelig zijn voor het ontwikkelen van metabool syndroom, het galzoutprofiel krijgen van muizen die dat niet zijn. Als na vier weken vet en cholesterol-rijk dieet de FXR-agonist aan het dieet wordt toegevoegd, zien we dat zoals verwacht, de fecale uitscheiding van galzouten, dat aangezien galzouten zich niet ophopen in het lichaam ook de productie van galzout weergeeft, sterk is afgenomen, en dat het galzoutprofiel is verschoven naar voornamelijk hydrofiele galzouten, die cholesterol-absorptie minder bevorderen dan hydrofobe galzouten. We zien dan ook dat de fecale cholesterol excretie is toegenomen en dat de cholesterol absorptie verminderd is. Belangrijker is dat dit samengaat met een sterke daling van het plasma triglyceride en plasma cholesterol, en dat ook het lichaamsgewicht sterk afnemen. Herinnerend aan de eerdere studie waarbij werd gekeken naar de heterogeniteit tussen dieren, was ook de fecale uitscheiding van niet opgenomen vetten verhoogd bij behandelde muizen. Verder waren er sterke aanwijzingen dat de voedselinname verminderd is als reactie op de FXR-agonist. Een andere interessante vondst was dat terwijl de totale hoeveelheid levervet niet verminderd was, de verdeling veranderde van pericentraal naar periportaal. Door de data te integreren met eerder besproken grofmazig computermodel vonden we dat een mogelijke verklaring voor dit fenomeen was dat meer van het vet dat opgenomen wordt in de darm in het periportale deel van de lever terechtkomt.
In hoofdstuk 7 worden recente ontwikkelingen op het gebied van vet en cholesterol-absorptie besproken. Een van de belangrijke ontwikkelingen is dat er recent is aangetoond dat trans-intestinale cholesterol excretie niet alleen bij muizen voorkomt, maar ook bij mensen. Bovendien blijkt de trans-intestinale cholesterol excretie met medicijnen bevorderd te kunnen worden en gaat het plasma cholesterol omlaag. Bevorderen van de klaring van cholesterol op deze manier geeft een nieuwe strategie om het cardiovasculair risico te doen zinken.
In hoofdstuk 8 bespreek ik wat de inzichten in dit proefschrift betekenen voor de huidige ideeën met betrekking tot metabool syndroom, en wat er zou moeten gebeuren om metabool syndroom in de toekomst beter te kunnen behandelen. Ik stel dan dat FXR-agonisten een belangrijke rol zouden kunnen gaan spelen.
293 Acknowledgements
This thesis would not exist without the help and inspiration of many others. I greatly appreciate everybody’s input throughout the years, including those whose names may have been omitted.
First of all, I wish to thank my promotor (Prof. A.K. Groen) and co-promotors (Prof. J.A. Kuivenhoven and Prof. B.M. Bakker), for taking a chance on me, and for their continued support.
Thank you Prof. M.H. Hofker, for your entertaining stories on Duchenne dystrophy and how you made the apoE*3Leiden mouse strain, may you rest in peace.
Thank you Prof. F. Kuipers, for your inspiring presence and always knowing my name. I would also like to thank the reading committee, for making time to read this thesis. Thank all of you who did a lot of the work. Albert Gerding and Niels Kloosterhuis, without your experience both in the lab and with animal work I would have been surely lost. Renze Boverhof, without your work, my thesis would be missing some of my most crucial data. Theo van Dijk, you may be one of the few to actually fully understand MIDA, and actually that’s fine. Vincent Bloks, thank you for your knowledge on gene expression analysis and constructive criticism on statistics. Furthermore thank you Martijn Koehorst, Theo Boer, Angelika Jurdzinski, Niels Mulder, Marieke Smit and Mirjam Koster.
Thank you to everyone of the Laboratory of Pediatrics, thank you for listening to my presentations, even though most of you are not especially into computational modeling. Federico Oldoni, thank you for radiating some of that unwavering determination my way and helping me with whatever whenever. Xiang Zhang, I always appreciate your level-headedness, sometimes outright cynism, and strong opinions about statistical methods, childbirth and soccer (football). Eelke Brandsma, I have always admired your uncomprimising optimism. Jan-Freark de Boer, thank you for your willingness to share your knowledge, skills and to offer guidance. Also thank you Debby Koonen, Hans Jonker, Henk Jan Verkade, Kathrin Thedieck, Marit Westerterp, and Janine Kruit for insightful discussions.
Thank you everyone from Systems Biology, for making me feel welcome and always doing your best to understand what I was trying to do, even when not necessarily
294
within your area of interest or conveyed in an intelligible manner. Thank you Anne-Claire Martinez for your maniacal enthousiasm when helping with my animal work. Thank you Sarah Stolle and Agnieszka Wegrzyn, for giving me the courage to ever plough onwards, even when things look bleak. Prof. D.J. Reijngoud, dear Dirk Jan, I was honored to do my work next to you, may you have fun doing research for the rest of your life. I also want to thank Wenxuan Zhang for her pioneering work on phospholipids and Karin Wolters for her expertise with proteomics. Bernard Evers, Melany Rios Morales, Marcel Vieira Lara, Chris Versloot, Fentaw Abegaz Yazew, thank you all for your company and good luck with your further journey in research. Thank you Marijke Schreurs for your ever cheerful attention and great help with practical considerations in animal work. Thank you Maaike Oosterveer for your sharp wit, inspiring motivation, and for (falsely) assuming I know more than half of what you know about metabolism. Thank you Karen van Eunen for being so communicative, and being always ready to explain principles of good science. Bart van de Sluis, thank you for always being interested in both my research and extra-curricular activities. Melinde Wijers thank you for that data that you shared, while I did not directly use it in one of my papers it helped me greatly. Antoine Rimbert, thank you for willingness to probe my DNA, may you find what you are looking for. Alexander Heberle, I have deep respect for your prowess in research, may you succeed in your ambitions, whatever direction they take.
Thank you Yanan Wang, may you be succesfull in your endeavours in science, and thank you for keeping your head cool that one day when you had to show an unexperienced animal experimenter how to measure VLDL-TG production in mice. Enchen Zhou, thank you for your invaluable work with the apoE*3Leiden mouse. Thank you Yvonne Rozendaal and Fiona Sips, I always enjoyed our meetings. Furthermore, I deeply admire your technical skills in computational modeling, as I still consider myself an amateur at heart. Prof. Natal van Riel, thank you for your inspiration and guidance.
Thank you other collaborators from the RESOLVE consortium, I have always enjoyed our yearly meetings.
Last but not least, I need to thank my wife (Elisa), and daughters (Kimberley, Amberdinn, Jàbée), for your love and for putting up with me and my moods. And I thank God for helping remind me what is most important in life.
295
Finally, I thank all the mice that have been sacrificed in the process of finishing this thesis. You may have been bred to be turned into data, I still somehow wish I could have asked for your ‘informed’ consent. Number nine, you will always be in my heart.
