Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/136521 holds various files of this Leiden University
dissertation.
Author: Cao, X.
- 254 -
SAMENVATTING
Endotheelcellen (ECs) en myeloïde cellen, afgeleid van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), vormen een nieuw en krachtig hulpmiddel voor de studie van verschillende vaat- en ontstekingsziekten die worden veroorzaakt door, of gecorreleerd aan, het disfunctioneren van deze celtypen. Dit proefschrift richt zich voornamelijk op de differentiatie en karakterisering van hiPSC-afgeleide ECs en myeloïde cellen en hun toepassing bij het modelleren van twee vaatziekten, namelijk Hereditaire Hemorragische Teleangiëctasie (HHT1) en Pseudomyogeen hemangioendothelioom (PHE).
Hoofdstuk 1 geeft een algemene introductie over hiPSC-afgeleide ECs en
macrofagen. In dit hoofdstuk wordt de huidige ontwikkelde differentiatiemethode voor deze celtypen samengevat en wordt het fenotype en de functionele activiteit van deze cellen vergeleken met hun primaire tegenhangers in vivo. Aangezien we voornamelijk geïnteresseerd zijn in de vaatziekten HHT1 en PHE, beschrijft dit hoofdstuk ook het onderliggende mechanisme van deze ziekten, met de nadruk op ECs en myeloïde cellen.
Hoofdstuk 2 en 3 beschrijven de ontwikkeling van een efficiënt protocol voor de
differentiatie van monocyten en macrofagen van hiPSCs en geven een gedetailleerde functionele karakterisering en vergelijking met perifeer bloed (PB) -afgeleide monocyten en macrofagen. We tonen aan dat hiPSC-afgeleide monocyten na cryopreservatie functioneel zijn en kunnen worden gebruikt om de ontstekingsreactie
in vitro te modelleren in een microfluïdische chip. Zowel pro-inflammatoire als
ontstekingsremmende M1- en M2-subtypen van macrofagen konden worden gepolariseerd van hiPSC-monocyten, deze waren vergelijkbaar met PB-afgeleide macrofagen wat betreft hun genexpressieprofiel en functionele activiteit. Interessant is dat we een hogere endocytose- en efferocytoseactiviteit waarnamen in hiPSC-afgeleide macrofagen dan in bloed-afgeleide macrofagen, terwijl beide vergelijkbare bacteriële en tumorcel fagocytosecapaciteiten vertoonden. Samengevat, hiPSC-monocyten en macrofagen konden robuust worden gegenereerd uit onafhankelijke hiPSC-lijnen, deze cellen waren volledig functioneel en vergelijkbaar met PB-afgeleide myeloïde cellen.
In hoofdstuk 4 wordt het ontwikkelingsproces van ECs en cardiomyocyten van hiPSCs in een co-differentiatiesysteem onderzocht met behulp van een ETV2mCherry
reporterlijn en bulk- en single cell RNA sequencing (RNAseq). Dit hoofdstuk toont aan dat ECs en cardiomyocyten in dit co-differentiatie systeem een gemeenschappelijke ontwikkelingsoorsprong hebben, ze zijn beide ontstaan uit cardiogene mesoderm voorlopers. De cruciale rol van kortstondige expressie van ETV2 werd onthuld tijdens de specificatie van het endotheel. Bovendien bewijst dit hoofdstuk dat functionele cardiomyocyten ook kunnen worden ontwikkeld vanuit ETV2+ voorlopers.
- 255 -
behulp van ECs, afgeleid van isogene HHT1 hiPSC-lijnen, die werden gegenereerd uit een HHT1-patiënt met mozaïcisme. Ziektegerelateerde fenotypen werden waargenomen met behulp van dit vasculaire 3D-model met mutante hiPSC-ECs, waaronder een stijging in ontstekingsreacties en defecte vasculaire organisatie. TGFß-, BMP- en WNT-signaleringsroutes bleken ontregeld te zijn in mutante ECs op basis van hun gehele transcriptomische profiel. Het onderzoek in dit hoofdstuk onthulde verder het onderliggende ziektemechanisme van HHT1 dat cruciaal is voor het ontwikkelen van potentiële therapeutische strategieën in de toekomst.
Hoofdstuk 6 en de appendix beschrijven de ontwikkeling van een
PHE-tumorspecifieke hiPSC-lijn. Deze lijn werd gegenereerd door een chromosomale translocatie in WT hiPSCs te introduceren met CRISPR/Cas9. Vervolgens werden ECs gedifferentieerd van deze lijn om PHE in vitro te kunnen modelleren. De gemuteerde hiPSC-ECs vertoonden een aantal ziektegerelateerde fenotypen in vitro en in vivo na transplantatie in muizen, die correleren met symptomen die zijn waargenomen bij PHE-patiënten. RNAseq op wildtype (WT) en gemuteerde hiPSC-ECs onthulde transcriptoomveranderingen die hiPSC-EC-disfuncties veroorzaken en die de PHE-fenotypen weerspiegelen. Signaleringsroutes die in PHE hiPSC-ECs ontregeld zijn werden ook geïdentificeerd, deze kunnen mogelijk doelwit zijn voor de behandeling van PHE in de toekomst.
