University of Groningen
Dynamics of the bacterial replisome
Monachino, Enrico
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Monachino, E. (2018). Dynamics of the bacterial replisome: Biochemical and single-molecule studies of the replicative helicase in Escherichia coli. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
169
S
AMENVATTING
Leven op aarde is gebaseerd op het gebruik van DNA om de blueprint van cellen op te slaan. Een betrouwbare overdracht van deze instructies op de volgende generatie is daarom cruciaal. Door evolutie ontstond er een hele specifieke, multi-eiwitmachine die volledig gespecializeerd is om deze vitale taak uit te voeren: het replisoom. In de afgelopen tientallen jaren hebben meerdere baanbrekende onderzoeken in verschillende organismen geleid tot een gedetaillieerde beschrijving van de belangrijkste onderdelen van het replisoom. Door dit onderzoek is men de complexiteit en elegantie van de machine gaan waarderen. Met de introductie van enkelmolecuultechnieken kwam er een nieuwe methode om het process van het kopieren van DNA te visualizeren en om de moleculaire mechanismen te ontdekken. Het gebruik van enkelmolecuultechnieken heeft geleid tot een soort van paradigma verschuiving: De moleculaire stappen in het replicatieproces worden gekarakteriseerd door stochastische gebeurtenissen die een resultaat zijn van dynamische evenwichten tussen de vele onderdelen van het replisoom. Deze dynamische evenwichten, die tot stand worden gebracht door de sterke en zwakke interacties die de machine bijeen houden, geven het replisoom flexibiliteit en de mogelijkheid om zich aan te passen (Hoofdstuk 1). De ontwikkeling van enkelmolecuultechnieken draagt bij aan de mogelijkheid om zeldzame moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken en aan de visualisatie van subpopulaties die niet eerder zijn waargenomen (Hoofdstuk 2). De overgang van enkelmolecuultechnieken van de kinderjaren naar een volwassen onderzoeksmethode heeft gezorgd voor belangrijke nieuwe kennis en meerdere baanbrekende nieuwe inzichten!
Het onderzoek in dit proefschrift is verdeeld in twee delen: de bijdrage aan de verbetering van enkelmolecuul technieken (Hoofdstukken 3–4) en de toepassing van moderne technieken bij de studie van het replisoom van Escherichia coli (Hoofdstukken 5– 7). Dit proefschrift maakt gebruik van enkelmolecuul technieken vanwege hun intrinsieke kinetische resolutie en het vermogen om de complexiteit van multi-eiwitsystemen aan te pakken. In dit proefschrift is echter ook een belangrijke rol weggelegd voor gevestigde biochemische methoden, die werden gebruikt om de koers te bepalen en ons te wijzen naar waar te kijken met onze microscopen.
Enkelmolecuultechnieken waarbij gestrekt DNA wordt opgespannen zijn nuttig gebleken bij onderzoek naar eiwit–DNA interacties. Echter, meestal wordt het DNA opgespannen op een oppervlak, zoals een microscoopglaasje. Dit veroorzaak twee problemen. Ten eerste zijn er nonspecifieke interacties tussen het DNA – en de eiwitten op het DNA – met het oppervlak, ondanks de ontwikkeling van passivatie methoden. Ten tweede is de snelheid van de laminaire, Poiseuille flow dichtbij het oppervlak nagenoeg nul. Dit maakt het moeilijk om het DNA volledig uit te rekken. Wij hebben beide problemen
170
opgelost door het DNA vast te maken aan een gouden nanodraadje in een microfluidic flowcell (Hoofdstuk 3). De DNA moleculen worden uitgerekt in het midden van de flowcell, ver van de zijden van de flowcell, dus waar de flow het snelst is. Onze experimentele setup had nog een voordeel: De grote dichtheid van DNA moleculen aan het nanodraadje resulteert in een ‘DNA gordijn’ patroon, wat heeft bijgedragen aan het vergroten van de hoeveelheid data per experiment (Hoofdstuk 2). Daarnaast heeft het ‘nanoskiving’ process de fabricatie en de manipulatie van de nanodraadjes vegemakkelijkt in vergelijking met traditionele lithoghrafie technieken. Hierdoor is het maken van een flowcell niet onoverkomelijk moeilijk (Hoofdstuk 3). Een nadeel is echter dat het niet langer mogelijk is in TIRF te werken waardoor bijdragen van fluorescente molecule in de oplossing de achtergrond fluorescentie doen toenemen.
Het gebruik van Rolling-circle DNA templates is een andere methode die erg nuttig is gebleken bij onderzoek naar het DNAreplicatieproces. Hun succes is gebaseerd op de circelvormige, covalent gesloten templatestreng die eindeloos kan worden gerepliceerd. Op deze manier kan replicatie langdurig betrouwbaar worden waargenomen zonder te worden beïnvloed door temporale detectielimieten. Een uitdaging hierbij ligt in het initiëren van replicatie, vooral wanneer complete replisomen moeten worden geassembleerd. Een geschikte vorktopologie is daarom een kritieke vereiste. Helaas bieden conventionele templates een slechte controle over de vorktopologie, waardoor de replicatie-initiatie wordt beïnvloed. Wij presenteerden een nieuwe en eenvoudige methode die het mogelijk maakte om het circulaire DNA-template aan te passen (Hoofdstuk 4). Onze replicatie-experimenten hebben enorm geprofiteerd van het gebruik van dit nieuwe DNA-substraat vanwege een veel hogere replicatie-efficiëntie. Met name de datadoorvoer in enkelmolecuulexperimenten was aanzienlijk verbeterd, waardoor we de aanwezigheid van replicatieproducten (of hun afwezigheid) betrouwbaar konden karakteriseren in uitdagende experimenten (Hoofdstukken 5-7).
Met behulp van deze en andere enkelmolecuultechnieken hebben we de dynamica van de replicatievork in E. coli bestudeerd. In het bijzonder hebben we ons gericht op de replicatieve DnaB helicase, de Pol III holoenzyme polymerase en de interacties tussen deze complexen. Eerdere experimenten evalueerden de stabiliteit van het holoenzymcomplex van DnaB-Pol III maar dit werd gedaan met lage concentraties, in de afwezigheid van concurrerende eiwitten in oplossing. Voor het replisoom van een ander organisme (bacteriofaag T7) werd eerder aangetoond dat de volgende-strengpolymerase om de paar Okazaki-fragmenten vervangen wordt. Om licht te werpen op het dynamische gedrag van het polymeraseholoenzym in het replisoom van E. coli en de mogelijke uitwisseling ervan tijdens replicatie, hebben we fluorescente Pol III polymerasen waargenomen in onze in vitro enkelmolecuul-fluorescentiemicroscoop (Hoofdstuk 5). Zoals verwacht was het replisoom onder omstandigheden met lage concentraties zeer stabiel. In de aanwezigheid van Pol III* in de oplossing, zagen we echter een snelle uitwisseling tijdens DNA replicatie. Opmerkelijk
171
was dat er geen effect op de algehele processiviteit werd gemeten: aan het einde van het experiment kregen we vergelijkbare verdelingen van DNA-productlengtes. Uiteindelijk toonden we aan dat de karakteristieke uitwisseltijd T toenam wanneer het aantal Pol III* in de oplossing werd verkleind. Hierdoor werden de observaties van Pol III* dynamica met polymerasen vrij beschikbaar in oplossing en onder omstandigheden met lage concentraties overbrugd. De waarneming van Pol III* uitwisseling werd verder bevestigd in levende cellen met in vivo enkelmolecuulmetingen. We concluderen dat het E. coli replisoom een buitengewoon flexibele machine is, die zich snel kan aanpassen aan de beschikbaarheid van componenten in de omgeving.
Onze waarneming van Pol III* uitwisseling vertoonde echter inconsistenties met vorige publicaties. Hoewel de monomere τ-DnaB-interactie erg zwak bleek te zijn en beperkt is tot τ domein IVa, werd verwacht dat het clamp-loader-complex (CLC) sterk aan DnaB zou binden door het gesommenteerde effect van meerdere τ-DnaB-contacten. Zo'n sterke binding zou inconsistent zijn met een model waarin Pol III* snel uitwisselt. Daarom hebben we het Pol III* uitwisselingsmechanisme verder onderzocht door de interactie tussen DnaB en de CLC als geheel te karakteriseren (Hoofdstuk 6). Verrassenderwijs toonden onze biochemische experimenten aan dat de sterkte van de interactie afhangt van de conformatie van het N-terminale domein van DnaB. In de vernauwde toestand was de interactie erg zwak. In de opengesperde toestand nam de interactiesterkte echter 500 keer toe. Hetzelfde resultaat werd onafhankelijk van het aantal τ-eenheden in de CLC waargenomen. Dit suggereert dat er slechts één τ per CLC is die een interactie heeft met DnaB. Bovendien laten onze data zien dat DnaB in oplossing hoofdzakelijk in zijn vernauwde toestand verkeert. Verrassend genoeg was CLC niet in staat om DnaB in zijn opgengesperde toestand vast te houden en de affiniteit van de helicase voor de primase bleef onaangetast, een situatie die alleen een allosterische binding van twee of drie primasen aan de helicase kan verklaren zonder fundamentele thermodynamische principes te schenden. Onze experimenten en eerdere onderzoeken naar de helicase-primaseinteractie lijken een dergelijke verklaring te ondersteunen.
Het zwakke contact in de τ-DnaB interactie was consistent met de interactie die wordt gemedieerd door domein IVa in τ. De sterke interactie was daarentegen minder voor de hand liggend om te identificeren. Het feit dat de helicase over moet gaan naar zijn opengesperde toestand suggereerde dat er een cryptische CLC-bindende pocket in DnaB is, die alleen toegankelijk wordt in deze toestand. Affiniteits- en functionele studies hebben aangetoond dat er inderdaad een cryptische τ-bindingsplaats is in DnaB. In het bijzonder hebben we bewezen dat residuen in het y-deel van τ binden op deze plaats en dat er geen overlap is met de residuen in domein IVa die betrokken zijn bij het eerste contact (Hoofdstuk 7). Als gevolg hiervan verhoogt de toevoeging van dit tweede contact de algehele sterkte van de interactie.
172
Het bestaan van een zwak contact tussen CLC en DnaB lijkt de juiste omstandigheden te scheppen voor de uitwisseling van Pol III*. Zoals we hebben aangetoond (Hoofdstuk 6), is er geen duidelijk effect van de sterkte van de CLC-DnaB-interactie op de synthese van de leidende streng, tenzij de sliding clamp uit de reactie wordt verwijderd. Deze laatste reactie is behoorlijk uitdagend voor het replisoom, omdat de stabiliteit van de polymerase op de DNA substraat sterk is aangetast. Onder deze omstandigheden werd de DNA-synthese alleen gestimuleerd door de sterke interactie van de polymerase met het helicase door het τ-domein (Hoofdstuk 7). Zoals blijkt uit in vitro enkelmolecuul FRAP-experimenten (Hoofdstuk 6), speelt de conformatie van het N-terminale domein van DnaB een belangrijke rol bij de synthese van de volgende streng tijdens gecoördineerde replicatie. Door de primaseconcentratie boven en onder het fysiologische bereik te variëren, konden we de Pol III* uitwisselingsdynamiek moduleren. Met name door de DnaG-concentratie te verhogen, werd de uitwisseling van Pol III* vertraagd. Deze uitkomst kan worden verklaard door in overweging te nemen dat het veranderen van de primaseconcentratie het dynamische evenwicht verschuift tussen de conformaties van het N-terminale domein van DnaB: meer primase leidt ertoe dat DnaB meer tijd doorbrengt in de opengesperde toestand, wat resulteert in een sterke interactie met Pol III*. Omgekeerd, bij lagere DnaG concentraties, was de uitwisseling van Pol III* sneller. Dit suggereerde dat DnaB ook op DNA, handelend binnen de replisoom, voornamelijk in zijn vernauwde toestand lijkt te zijn. Tegelijkertijd werd een verder gevolg duidelijk: de verschuiving in het bindingsevenwicht bij hogere DnaG-concentraties resulteert in een binding van meerdere Pol III* polymerasen aan de replicatievork. Verder hebben we, consistent met eerdere metingen, ook waargenomen dat de KM van de
DnaB-DnaG interactie tijdens replicatie in hetzelfde bereik ligt als de fysiologisch relevante concentratie van DnaG en ten minste 10 keer sterker is dan de KD van de geïsoleerde
DnaB-DnaG interactie . Deze discrepantie suggereert de aanwezigheid van verdere contacten van DnaG in het replisoom, en het kan ertoe bijdragen dat ongebonden DnaB, Pol III* s niet van de replicatievork kan wegnemen.
De overgang van DnaB naar zijn opengesperde toestand na DnaG-binding benadrukt de sleutelrol van de primase in de balans tussen de twee DnaB toestanden (Figuur S.1), vooral tijdens replicatie wanneer de affiniteit van de primase voor de replisoom aanzienlijk sterker wordt. Uiteindelijk, door het regelen van de kinetiek van CLC-DnaB interactie, vertegenwoordigt de primase een soort moleculaire schakelaar. Bovendien maakt de eigenaardige allosterische binding met DnaB een snelle uitwisseling van de Pol III* s mogelijk, hetgeen een rol suggereert in de primeroverhandiging. De rekrutering van meerdere Pol III* polymerasen tijdens het synthetiseren van de primer zorgt ervoor dat de nieuwe primer snel kan worden overgenomen door een Pol III* voor replicatie. Uitwisseling vindt plaats wanneer een nieuw gebonden Pol III* met succes de oorspronkelijke polymerase op de volgende streng vevangt door het binden van een nieuwe primer. Het voorgestelde model laat de stochastische aard van het replisoom zien maar garandeert ook
173
robuustheid, omdat deze moleculaire schakelaar toegang verschaft tot verschillende routes die hetzelfde resultaat opleveren: een nieuw gesynthetiseerde primer wordt gebruikt en DNA wordt gerepliceerd.
Onze resultaten zijn over het geheel genomen in overeenstemming met eerdere observaties. In het bijzonder illustreren ze, samen met het driepuntsschakelaarmodel dat beschrijft hoe de clamp-loader χ-subonderdeel en SSB DnaG van de primer verwijderen, de overhandiging van de primer van de primase aan de polymerase, en vervolgens de polymeraseuitwisseling. Ons model biedt ook een mechanistische verklaring voor het recent waargenomen gebrek aan coördinatie tussen de polymerase van de leidende- en de volgendestreng: de twee kernpolymerasen hoeven niet noodzakelijk deel uit te maken van hetzelfde Pol III* complex. Opmerkelijk is dat er ook een zekere mate van overeenkomst is met het bacteriofaag T7 systeem, ondanks de verschillende niveaus van complexiteit van hun respectievelijke replisomen. In beide systemen wordt de polymerase gerekruteerd door het helicase-primasecomplex (het T7 helicase en het primase maken deel uit van hetzelfde eiwit) voor de primeroverdracht. Dergelijke geconserveerde mechanismen in de natuur zijn opmerkelijk en het is mogelijk dat andere replicatiesystemen een vergelijkbare oplossing gebruiken. Toekomstige studies zijn nodig om deze processen in hogere organismen aan te tonen en hun relevantie verder te verduidelijken.
Figuur S.1: Een primase geïnduceerde conformationele schakelaar in DnaB en zijn effecten op de CLC-DnaB interactie
Schema dat de consequenties beschrijft van de door primase geïnduceerde conformationele schakelaar in DnaB op de CLC-DnaB interactie. Wanneer het
174
N-terminale domein zich in de vernauwde toestand bevindt, heeft DnaB een zwakke wisselwerking met de CLC. Bij associatie met de primase echter, gaat de N-terminale kraag van DnaB over in de opengesperde toestand en wordt de interactie met CLC met meer dan twee ordes van grootte versterkt.
T
OEKOMSTPERSPECTIEF
Onderzoek is een oneindig proces. Zodra een antwoord is gevonden, volgen er meer vragen. In verband met de onderwerpen die in dit proefschrift worden besproken, hebben we nog steeds veel vragen die we in de toekomst graag zouden willen onderzoeken. De meest directe vraag zou betrekking hebben op de validatie van ons voorgestelde model in levende cellen. Als het beeld van DnaB dat fungeert als een moleculaire schakelaar gemoduleerd door DnaG een fysiologisch relevante blijkt te zijn, dan is een belangrijke vraag wat het aantal τ-subeenheden per CLC bepaalt en waarom het er meer dan één zou zijn. Een recent onderzoek meldde dat de replicatie van leidende en volgende strengen niet wordt beïnvloed door het aantal τ subeenheden per CLC, zolang er maar minstens één is (Q. Yuan et al., 2016). Ons model biedt een mechanistische beschrijving van waarom dit gebeurt en suggereert daarom dat het niet nodig is om het aantal τ-subeenheden te reguleren, met uitzondering van het garanderen van de aanwezigheid van ten minste één. Verdere ondersteuning voor de aanwezigheid van CLC's met slechts één τ-subeenheid kan afkomstig zijn van de waarnemingen van vier χψ subcomplexen in een levende cel terwijl er slechts drie elk van α, ε en τ werden gedetecteerd (Reyes-Lamothe et al., 2010).
Er zijn nog steeds onopgeloste vragen met betrekking tot het uitwisselingsmechanisme. Het is bijvoorbeeld nog onduidelijk of er een mechanisme is dat de competitie reguleert tussen vrije polymerasen voor dezelfde primer en welke omstandigheden het hergebruiken van de vorige volgende-streng polymerase mogelijk maken. Een mechanistische verklaring voor uitwisseling van de leidende-streng polymerase ontbreekt ook nog steeds. In het bijzonder is er de behoefte om te begrijpen hoe de uitwisseling ervan wordt gereguleerd en of de tijdschaal verschilt van de uitwisseling van de polymerase van de volgende streng. Het zou ook interessant zijn, zelfs als dit minder fysiologisch relevant is, om de uitwisseling in afwezigheid van DnaG te bestuderen (dus alleen de synthese van de leidende streng in overweging nemend). In dit geval zou DnaB bijna continu in zijn vernauwde toestand moeten zijn. De belangrijkste vragen zijn of Pol III* uitwisseling in synthese van de leidende streng plaatsvindt en hoe. De zwakke interactie van Pol III* met DnaB zou de uitwisseling moeten bevorderen. Aan de andere kant, zonder de overgang naar de sterke toestand, zou een nieuwe Pol III* niet eenvoudig kunnen worden gerekruteerd in de replicatievork, waardoor als enige optie voor uitwisseling een directe uitwisseling vanuit de oplossing overblijft. Ook zou de rol en het lot van β2 moeten
175
hergebruikt wanneer een nieuwe polymerase wordt geassocieerd? Zo niet, wat gebeurt er dan?
Over de interactie tussen τ en DnaB zijn er nog enkele vragen vanuit een structureel oogpunt. We weten bijvoorbeeld nog steeds niet welke residuen bij de interactie betrokken zijn. De ontdekking dat slechts één τ per CLC bindt met DnaB was een verrassende die een aantal vragen oproept. Nader onderzoek zou moeten uitwijzen welke structurele of mechanistische aspecten multimere binding belemmeren.
In het geval van het algemene mechanisme van replicatie in E. coli, blijft het primingproces tamelijk onbekend. Heel wat delen van de puzzel zijn bekend, maar niet genoeg om tot een volledig mechanistische beschrijving van het proces te komen. Het is bekend dat DnaB drie DnaG-moleculen kan binden en er zijn bewijzen dat er ten minste twee nodig zijn voor primen. Onze studies hebben hier een bijgedrage geleverd door de allosterische aard van de interactie tussen DnaB en DnaG aan te tonen. Een betere karakterisering van deze binding ontbreekt echter nog steeds, vooral in de context van het replisoom, waar extra contacten met DNA en SSB een rol zouden kunnen spelen. In het bijzonder is er tot nu toe geen enkelmolecuul visualisatie van het proces van primer synthese geweest. Zulke studies zouden enorm helpen bij het verduidelijken van aspecten zoals hoeveel primasen geassocieerd zijn met DnaB tijdens het primen en voor hoe lang deze geassocieerd zijn. Het bestaan van primer- en/of replicatielussen is ook een besproken onderwerp dat moet worden opgelost. Er zijn aanwijzingen in andere systemen voor hun bestaan (Duderstadt et al., 2016; Manosas et al., 2009; Pandey et al., 2009), maar primer-lussen zijn nog nooit waargenomen in het E. coli systeem.
Het replisoom is een fascinerende en wonderbaarlijke machine, vanwege de rol die het speelt in het leven en vanwege de uitdagingen die zijn begrip te bieden heeft. Ondanks alle doorbraken, resultaten en successen (en de laatste jaren waren op dit gebied behoorlijk opmerkelijk), hebben we nog niet alle geheimen onthuld en blijft het systeem ons nog steeds verrassen. Soms door iets nieuws te onthullen, soms door ons perspectief te verbreden. Dus, blijf openstaan en blijf op de hoogte voor meer opwindende resultaten en ontdekkingen!
