Viral elements inducing tumor-related apoptosis
Kooistra, K.
Citation
Kooistra, K. (2007, October 11). Viral elements inducing tumor-related apoptosis. Leiden
Institute of Chemistry (LIC), Faculty of Science, Leiden University. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/12375
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the
Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/12375
S AMENVATTING
Onderzoek naar het ontstaan en de bestrijding van kanker maakt gebruik van specifieke virale eiwitten
Kanker is op dit moment één van de meest voorkomende ziekten waaraan mensen overlijden. Om een gerichte therapie te ontwikkelen, is kennis nodig die inzicht geeft in het ontstaan van kanker. Tumorcellen zijn cellen, die te snel groeien en/of het vermogen zijn kwijt geraakt dood te gaan volgens een genetisch gereguleerd cellulair proces. Dit cellulaire beschermingsmechanisme wordt geprogrammeerde celdood of apoptose genoemd.
Ongecontroleerde celgroei en het ontbreken van apoptose zijn primaire eigenschappen die bij zowel tumoren als bepaalde virusinfecties aanwezig zijn. Het is daarom niet verwonderlijk dat ongeveer 15% van alle tumoren een virale oorsprong heeft.
Tumorvirussen produceren in de cel één of meerdere eiwitten, die specifiek aangrijpen op cellulaire processen, wat resulteert in verstoring van de celgroei en remming van het apoptoseproces. Deze verstoorde processen brengen de cel in een getransformeerde toestand die kan leiden tot tumorigenese. Onderzoek naar deze transformerende virale eiwitten heeft veel tumorgerelateerde processen in kaart gebracht en belangrijke cellulaire eiwitten geïdentificeerd die een cruciale rol spelen in het ontstaan van kanker.
In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van de resultaten, die tot nu toe zijn behaald met transformerende virale eiwitten afkomstig van het Simian Virus 40 (SV40). Het SV40 transformerende eiwit ‘large T antigen’ (LT) is een ‘multi-target’ eiwit, dat bindingsplaatsen bezit voor diverse cellulaire eiwitten. Met behulp van deze eigenschappen kan LT interfereren met cellulaire processen, wat leidt tot stimulatie van de celgroei en inhibitie van apoptose. Een groot aantal cellulaire eiwitten betrokken bij het ontstaan van tumoren, zoals p53, Rb, c-myc, hsp40 en hsp70 en het fosfatase eiwit PP2A, werden mede met behulp van de SV40 transformerende eiwitten LT en ‘small t antigen’
(st) geïdentificeerd (hoofdstuk 1). De transformerende activiteiten van de SV40 eiwitten LT en st zijn gebruikt voor enkele experimenten die verder in dit proefschrift worden beschreven.
Virale eiwitten die tumorspecifieke apoptose induceren
Behalve transformerende virale eiwitten zijn ook virale eiwitten ontdekt, die specifiek apoptose kunnen induceren in getransformeerde cellen (hoofdstuk 1). Deze eiwitten kunnen dus onderscheid maken tussen een normale cel en een tumorcel door specifieke tumormoleculen te herkennen en hierop in te spelen. Ook met behulp van deze virussen zijn wetenschappers in staat gebleken tumorspecifieke processen te identificeren. Deze kennis is van belang voor de ontwikkeling van nieuwe antikankertherapieën, die immers berusten op celdoding door de inductie van apoptose. Deze virale eiwitten kunnen worden
gebruikt als antikanker agens of kunnen worden ingezet voor de identificatie van nieuwe drug targets, waarmee verbeterde antikanker middelen kunnen worden ontwikkeld.
In dit proefschrift worden drie virale eiwitten beschreven met tumorgerelateerde apoptose- eigenschappen: Het adenovirus-gecodeerde eiwit E4orf4, het ‘chicken anemia virus’ eiwit apoptin en het TT-virus-afgeleide eiwit TAIP.
Adenovirus eiwit E4orf4
Het adenoviruseiwit E4orf4 kan tumorspecifieke apoptose induceren door direct te binden aan de tumorgerelateerde eiwitten Src en PP2A (hoofdstuk 1). De binding van Src aan het nucleaire lokalisatiesignaal van E4orf4 zorgt ervoor dat E4orf4 terecht komt in het cytoplasma en in de plasmamembraan, hetgeen resulteert in tumorspecifieke apoptose. De polymerisatie van het cellulaire eiwit actine blijkt in dit proces een cruciale rol te spelen.
Het cellulaire fosfatase-eiwit PP2A speelt dus niet alleen een rol bij het ontstaan van kanker door transformerende (virale SV40) eiwitten, maar is ook betrokken bij de inductie van een alternatieve apoptose die blijkbaar alleen in tumorcellen aanwezig is. Aangezien in veel tumoren de reguliere apoptoseprocessen worden geremd, kan het induceren van celdood via een andere route nieuwe strategieën opleveren in de strijd tegen kanker.
Chicken anemia virus eiwit apoptin
Het eiwit apoptin, afkomstig van het ‘chicken anemia virus’ (CAV), veroorzaakt in een groot aantal onderzochte humane tumorcellen geprogrammeerde celdood, maar niet in gezonde normale cellen. Eerder onderzoek toonde aan dat de nucleaire lokalisatie van apoptin in tumorcellen en de activiteit van een tumorspecifieke kinase, die apoptin alleen in tumorcellen kan fosforyleren, van cruciaal belang zijn voor de tumorspecifieke eigenschappen van apoptin (hoofdstuk 1).
Apoptin is in normale cellen gelokaliseerd in het cytoplasma en kan geen apoptose induceren. In hoofdstuk 2 is het gedrag van apoptin in normale humane cellen nader onderzocht met behulp van een in bacteriën gemaakt fusie-eiwit van maltose- bindingseiwit en apoptin (MBP-apoptin). Na micro-injectie van dit eiwit in verschillende typen normale cellen blijkt dat MBP-apoptin gaat samenklonteren tot grote complexen, dusdanig dat deze niet meer worden herkend door de gebruikte antilichamen en uiteindelijk worden afgebroken. Deze observatie betekent dat naast tumorspecifieke eigenschappen, apoptin ook onderhevig is aan neutralisatie- processen die specifiek zijn voor normale cellen. Dit suggereert dat toepassing van apoptin als antikankermiddel mogelijk zal leiden tot relatief weinig bijwerkingen.
In hoofdstuk 3 staat beschreven dat, naast activatie van apoptin in tumorcellijnen, apoptin kan worden geactiveerd in normale cellen waarin SV40-afgeleide transformerende eiwitten tot expressie is gebracht. Deze transformatiesituatie weerspiegelt de eerste stappen in de ontwikkeling naar volledige tumorigenese. Opmerkelijk is dan ook de ontdekking dat het tumorgerelateerde kinase, dat apoptin in tumorcellen kan fosforyleren,
al actief is in deze fase. Sequenties in het N-terminale deel van LT/st zorgen voor de activatie van het tumorspecifieke apotin kinase.
Tijdens deze experimenten werd opgemerkt dat de tijd, die nodig was om humane fibroblasten VH10 te transformeren met behulp van LT, aanzienlijk korter was dan de tijd die nodig was voor humane mesenchymale cellen (hMSC). Dit verschil tussen deze cellen is te wijten aan de snellere lokalisatie van het LT eiwit in de nucleus en daarmee een eerdere activatie van apoptin in VH10 cellen ten opzichte van hMSC cellen (hoofdstuk 4).
Deze studies laten zien dat met behulp van onder andere de transformerende eiwitten van SV40 zeer gericht gespeurd kan worden naar de tumorspecifieke processen die door apoptin worden “gezien” en nodig zijn voor de inductie van apoptose in getransformeerde of tumorigene cellen.
In hoofdstuk 5 wordt een overzicht gegeven van experimentele omstandigheden die de specifieke apoptin eigenschappen kunnen beïnvloeden. Bepaalde experimentele parameters kunnen leiden tot, voornamelijk, de nucleaire lokalisatie van apoptin in normale cellen. Onder andere de kwaliteit van het gebruikte DNA dat codeert voor apoptin en een hoog aantal celkweekpassages van de gebruikte humane cellen bleken dit onverwachte resultaat op te kunnen leveren. DNA transfecties kunnen resulteren in cellulaire stress situaties, die blijkbaar gedeeltelijk getransformeerde processen kunnen imiteren. Micro-injecties met apoptin eiwit in normale humane cellen leverden nooit een afwijkend beeld op.
De activatie van apoptin in humane HNSCC tumorcellen cellen is nader onderzocht en beschreven in hoofdstuk 6. Het tumorsuppressoreiwit p53 is meestal geïnactiveerd In HNSCC tumoren, onder andere door overexpressie van de apoptose remmende eiwitten Bcl-2 en Bcl-xl. Inactivatie van p53 heeft een negatieve invloed op de werking van huidige antikankertherapieën. Uit eerdere studies is gebleken dat apoptin onafhankelijk van p53 apoptose kan induceren en dat hoge concentraties Bcl-2 geen negatieve invloed hebben op apoptin-geïnduceerde apoptose. Uit ons onderzoek blijkt dat ook een hoge concentratie Bcl-xl eiwit geen invloed heeft op de tumorspecifieke activiteit van apoptin in HNSCC tumorcellen, ondanks het feit dat het p53-geinduceerde apoptose wel bleek te remmen. Deze gegevens bevestigen wederom dat apoptin een potentieel antikankermiddel is.
TT-virus eiwit TAIP
Het derde eiwit dat is onderzocht op mogelijke apoptotische eigenschappen staat beschreven in hoofdstuk 7 en is afkomstig van het TT-virus (TTV). Het genoom van dit virus heeft een grote overeenkomst met dat van CAV. Het hypothetische “open reading frame 3” (ORF 3) van een TT virus codeert voor een eiwit van 105 aminozuren en heeft enkele kenmerkende structurele overeenkomsten met apoptin. Uit onderzoek in
induceren. Wij hebben dit eiwit ‘TTV derived apoptosis-inducing protein’ (TAIP) genoemd. TAIP induceert net als apoptin, p53-onafhankelijke apoptose. De inductie van apoptose in de geteste levertumorcellijnen door TAIP en apoptin verschillen nauwelijks van elkaar, maar TAIP bleek in andere typen humane tumorcellijnen significant minder apoptose te induceren. Eerste experimenten met normale levercellen van de rat lieten zien dat noch TAIP noch apoptin apoptose konden induceren. Verder onderzoek zal moeten aantonen, dat met behulp van TAIP mogelijk levertumorspecifieke processen opgespoord kunnen worden.
Het in dit proefschrift beschreven onderzoek laat zien dat apoptin en mogelijk ook TAIP tumorspecifieke eigenschappen bezitten. Dit onderzoek zal mogelijk leiden naar de identificatie van tumorspecifieke processen, die ten grondslag liggen aan het ontstaan van kanker. Ook zal de kennis, gebaseerd op de virale eiwitten die tumorspecifiek apoptose kunnen induceren, een bijdrage kunnen leveren aan de ontwikkeling van nieuwe antikankertherapieën.
