Rijksuniversiteit Groningen Bachelorscriptie 2014
OPTIMALISATIE VAN IN VITRO KWEEKCONDITIES VAN HUMANE
NUCLEUS PULPOSUS CELLEN
Wat zijn de huidige kweekcondities en hoe zijn deze te optimaliseren en te combineren?
13-06-2014 Ontwikkelingsbiologie en Regenerative Medicine
Door: J. Hulzebos Begeleidend Docent: Prof. Dr. R.A. Bank
Abstract
Circa 80% van de gehele bevolking krijgt in zijn of haar leven last van pijn in de onderrug. Dit wordt veroorzaakt door degeneratie of slijtage van tussenwervelschijven (TWSen). De functie van de TWSen is om de constante druk die op de wervelschijven drukt, partieel te verminderen.
TWSen bestaan uit een ringvormige structuur, de Annulus Fibrosus (AF), met een binnenste compartiment, de Nucleus Pulposus (NP). De Extracellulaire Matrix (ECM) van de NP zit vol met proteoglycanen, collageen II en water. De mechanismen van TWS-degeneratie zijn nog grotendeels onbekend. Wat reeds bekend is, is dat er een anabool naar katabool-shift plaatsvindt, waardoor NP-cellen enzymen zullen produceren die hun eigen ECM af zullen breken.
NP-cellen leven normaliter in een hypoxische, hyperosmotische 3D omgeving, waar afwisselende druk op wordt uitgeoefend. Indien er degeneratie optreedt, zal de ECM hypo- osmotisch worden en hierdoor zal de druk op de wervelschijven toenemen.
Om de processen van degeneratie beter te kunnen begrijpen en om een curatieve behandelmethode te ontwikkelen voor deze onderrugpijn, moet er een voldoende representatief in vitro NPcel model op worden gesteld. Bij hedendaagse onderzoeken naar de NP en NP- degradatie, wordt er te weinig rekening gehouden met de fysiologische omstandigheden.
In dit literatuuronderzoek worden hedendaagse in vitro experimenten naar NP-cellen gevalideerd, waarna deze onderling worden vergeleken. Met deze informatie is het volgende literaire en analytisch onderbouwde advies opgezet, voor het kweken van Nucleus Pulposus cellen in vitro;
“Nucleus Pulposus cellen dienen gekweekt te worden in een hypoxische, hyperosmotische 3D constructie, waarbij idealiter rekening wordt gehouden met een diurnaal patroon van krachtwerking.”
1
Inhoudsopgave
Abstract ... 1
Inhoudsopgave ... 2
Inleiding ... 3
Literatuuronderzoek ... 5
Hypoxische omgeving ... 5
Moleculaire Mechanismen – HIF-1α ... 5
Samenvattend ... 6
Hyperosmolariteit ... 6
Moleculaire Mechanismen – TonEBP ... 7
TonEBP en HIF-1α... 7
Combinatiestudies ... 7
Osmolariteit en Mechanische Stress ... 7
Osmolariteit en Hypoxie ... 7
Samenvattend ... 7
Mechanische Druk ... 8
Combinatiestudies ... 9
Mechanische Druk en Osmolariteit ... 9
Samenvattend ... 9
2D Versus 3D ... 10
Samenvattend ... 10
Zuurgraad ... 10
Combinatiestudies ... 10
pH en mechanosensing ... 10
Samenvattend ... 10
Vergelijking en Optimalisering ... 11
Hypoxische omgeving ... 11
Hyperosmolariteit ... 11
Mechanische Druk ... 11
2D Versus 3D ... 12
Zuurgraad ... 12
Conclusie ... 13
Nawoord ... 13
Referenties ... 14
Inleiding
it een meta-onderzoek is gebleken dat 80%
van de gehele menselijke populatie eens in zijn of haar leven te maken zal krijgen met pijn in de onderrug (Macfarlane et al., 1998).
Hoewel onderrugpijn een veelvoorkomend probleem is, is er nog geen curatieve behandelmethode ontwikkeld. Huidige behandelmethoden bestaan onder andere uit fysiotherapie en chirurgische ingrepen, zoals een spondylodese (Feng et al., 2013). Het gebrek aan goede behandelingen zorgt voor een aanzienlijke vermindering in de kwaliteit van het leven. Ook de productiviteit van de desbetreffende mensen neemt af, wat direct en indirect vele sociaaleconomische nadelen met zich mee brengt. Sommige mensen kunnen zelfs niet meer normaal functioneren ten gevolge van deze onderrugpijn (Henriksson et al., 2013). Deze onderrugpijn kan op twee verschillende manieren ontstaan.
Namelijk, door slijtage óf degeneratie van de tussenwervelschijven (TWSen) (Adams et al., 2014).
Tussenwervelschijven zijn, zoals de naam reeds aanduidt, gelegen tussen de wervelschijven. De functie van deze TWSen is om de continu aanwezige druk en stress partieel te verlichten van de wervelschijven (Sivan et al., 2014). Deze druk wordt veroorzaakt door onder andere staan, zitten, buigen en draaibewegingen. Deze drukvermindering kan oplopen tot wel 90%
(Adams et al., 2014). Indien deze druk niet verminderd wordt, kunnen de (tussen)- wervelschijven dusdanig gaan slijten dat de kans op complicatievorming zal toenemen.
De TWSen bestaan globaal gezien uit drie verschillende hoofdcompartimenten; de hyaliene eindplaat, de Annulus Fibrosus (AF) en de Nucleus Pulposus (NP) (figuur 1).
De hyaliene eindplaat ligt tussen de vertebrale eindplaat en de NP, dit is de enige plaats waar de NP zijn voedingsstoffen vandaan kan diffunderen (Chan et al., 2014).
Dit komt doordat deze eindplaat bestaat uit botweefsel en glasachtig kraakbeen, waar grote poriën in zitten (Rodriguez et al., 2012).
De AF is een stevige, harde structuur die voornamelijk uit collageen I fibrillen bestaat en lijkt inderdaad dus op een rigide, fibrotische structuur (Kandel et al., 2014). De
functie van deze annulus is om de NP, wat zich binnen in de ringvormige annulus bevindt, te beschermen tegen de omgeving buiten de TWS. Deze NP bestaat voor wel 95% uit Extracellulaire Matrix (ECM) en slechts voor 5% uit zogeheten Nucleus Pulposus-cellen (NPcs) (Urban & Roberts, 2003).
Deze NPcs zijn in staat om verscheidene matrixmoleculen uit te scheiden die vervolgens samen de ECM zullen vormen. Deze ECM bestaat bijna compleet uit proteoglycanen, collagenen en water (Sivan et al., 2014). Het proteoglycaan aggrecaan is het meest voorkomende matrix- eiwit in de NP. Deze aanwezige proteoglycanen dragen een negatieve lading waardoor er water wordt aangetrokken. Door de aanwezigheid van de grote hoeveelheid water, is de NP dan ook een gel-achtige structuur (Van Dijk et al., 2011). Niet alleen proteoglycanen en water maken de ECM van de NP zoals het is, maar ook het polypeptide collageen II. Collageen II is, in vergelijking met collageen I, een stuk minder stevig en zorgt juist meer voor elasticiteit dan rigiditeit.
Zo komt collageen I voornamelijk voor in botstructuren en huid, terwijl collageen II enkel voorkomt in de tussenwervelschijven en glasachtig kraakbeen (Adams et al., 2014).
De achterliggende mechanismen van de degeneratie van de NP zijn nog grotendeels onbekend. Wat reeds wel ontdekt is, is dat de NPcs normaliter een anabole werking hebben. Er kunnen vervolgens biochemische en/of biomechanische veranderingen optreden in de NP, waardoor de NPcs plotseling niet meer anabool werken, maar katabool. NPcs scheiden dan degraderende enzymen uit die de ECM kunnen afbreken, en zo degeneratie realiseren (Van Dijk et al., 2013). Deze degeneratie zorgt voor een afname van proteoglycanen, en dus ook de hoeveelheid water in de NP, waardoor het langzaamaan zijn gel-achtige structuur verliest. Hierdoor zullen de TWS hoogte verliezen, waardoor de wervel- schijven meer druk te verduren krijgen en de onderrugpijn ontstaat (Othori et al., 2014;
Massey et al., 2011).
Het vakgebied van de Regenerative Medicine heeft de afgelopen decennia een aantal grote doorbraken meegemaakt. Door de veelbelovende resultaten wordt er continu meer onderzoek uitgevoerd naar
U
3
regeneratieve mogelijkheden van organen, weefsels en cellen. Zo is dit ook het geval bij het regenereren van kraakbeenachtige structuren waaronder dus ook TWSen.
Vanwege de vele economische nadelen, maar in het bijzonder persoonlijke problemen, is het van groot belang dat er een behandelingsmethode ontwikkelt wordt, die deze degeneratie kan voorkomen, of beter zelfs; genezen.
Echter, het hedendaagse onderzoek naar NPcs laat te wensen over. De NPcs zijn moeilijk ex vivo te kweken, vanwege de vele kweekcondities waar in het laboratorium niet altijd rekening mee wordt gehouden. Zo heerst er binnen de NP een hypoxische omgeving: bloedvaten zijn niet in staat door de AF te dringen. Zodoende hebben NPcs continu te maken met een lage zuurstofconcentratie. Neuronen zijn om dezelfde reden niet in de NP te vinden (Johnson et al., 2002;2005). Ook vanwege de aanwezigheid van de vele negatief geladen proteoglycanen, heerst in de NP een hyper osmotische omgeving (Van Dijk et al., 2011).
Naast de aanwezige osmotische druk, hebben de TWSen ook te maken met een diurnale cyclus van krachtwerkingen (Massey et al., 2011). Een gemiddeld individu is 16 uur per dag actief en door bijvoorbeeld te staan of zitten, wordt er kracht uitgeoefend op de TWSen. ’s Nachts wordt er circa 8 uur gerust waardoor de TWSen tijd hebben om te herstellen. Door deze krachtwerking is het vocht wat zich in de NP bevindt, in staat om egaler te verdelen en in de AF door te dringen waardoor de NP als het ware wordt ingedeukt. In de nacht treedt dit vocht weer uit de AF.
Dit is ook de reden waarom men ’s ochtends circa 2 cm langer is dan in de avond (Massey et al., 2011).
In het laboratorium is het niet altijd gemakkelijk of mogelijk om deze factoren allemaal specifiek na te kunnen bootsen. Dit komt bijvoorbeeld door gebrek aan materiaal, te weinig investering in het onderzoek of een gebrek aan ervaring van de betrokken onderzoekers. In de meeste gevallen bij NP- onderzoek, worden de NPcs zelfs op tweedimensionale (2D) kweken gezet, terwijl de in vivo situatie duidelijk driedimensionaal (3D) is. Doordat de NPcs uit hun normale fysiologische omgeving worden gehaald, kunnen een aantal factoren er voor zorgen dat de cellen kunnen ‘de-differentieren’ naar fibroblast-achtigen (Shen et al., 2013). Dit is een ongewenst proces, omdat het onderzoek wat uitgevoerd wordt op deze cellen niet langer representatief zal zijn voor de in vivo situatie. Het re-differentieren is tevens een moeilijk en vaak onhaalbaar proces (Shen et al., 2013).
In de meeste gevallen wordt er bij NP- onderzoek slechts aan één van deze kweekcondities gehouden, terwijl het in mijn optiek noodzakelijk is om zo goed mogelijk de fysiologische situatie na te bootsen.
In dit literatuuronderzoek worden daarom de fysiologische condities uitgediept, de hedendaagse kweekcondities worden kritisch bekeken en mogelijk bekende moleculaire mechanismen worden uitgediept, om vervolgens een advies op te stellen wat betreft het kweken en manipuleren van in vitro Nucleus Pulposus-cellen.
Figuur 1 – Schematisch overzicht van een tussenwervelschijf. – Massey et al., 2011
Figuur 2 – Collageen type II en aggrecaan mRNA wordt meer aangemaakt door NPcs in hypoxische omgeving dan in normoxische omgeving. In collageen type I is geen onderscheid te maken. - aangepast naar Feng et al., 2013.
Literatuuronderzoek
In de volgende hoofdstukken zullen de desbetreffende kweekcondities aan bod komen. Er wordt hierin literatuur- onderzoek gedaan naar de effecten van de condities op humane Nucleus Pulposus cellen. Moleculaire mechanismen die hier dicht bij betrokken zijn, worden uitgelicht.
Hypoxische Omgeving
In de NP is er geen sprake van enige bloedtoevoer, vanwege het feit dat de collageen I matrix van de AF van grote dichtheid is, dat bloedvaten amper in staat zijn hier in te vormen. Hierdoor hebben NPcs te maken met een laag zuurstof-percentage, maar ook met weinig voedingsstoffen (1g glucose/L). Zodoende zijn NPcs dus afhankelijk van diffusie en anaeroob metabolisme (Tran et al., 2013; Van Dijk et al., 2011). Het blijkt echter zo te zijn, dat wanneer NPcs in een hypoxische omgeving (1-2% O2) gekweekt worden, er juist méér matrixproductie plaatsvindt (Feng et al., 2013).
Onderzoek naar NPcs in hypoxische omgevingen wordt veelal uitgevoerd in 3D culturen zoals alginaat-balletjes of pellet- cultures (Pei et al., 2012). Een recent onderzoek heeft aangetoond dat na 3 weken tijd NPcs in een hypoxische 3D omgeving van 2% O2 dermate veel collageen II en aggrecaan RNA expressie laten zien ten opzichte van een 20% O2 normoxische conditie (figuur 2). Deze data werd onderbouwd door het aankleuren van de gesynthetiseerde collageen II fibrillen. Wat echter opmerkelijk is, is dat de collageen I productie nagenoeg stabiel blijft (Feng et al., 2013). Dit zou indiceren dat de hypoxische omgeving niet de collageen I productie beïnvloedt, maar wel die van collageen II.
Hier liggen dus beduidend verschillende moleculaire mechanismen aan ten grondslag.
Verder is gebleken dat hypoxische condities van 10 tot 20% O2 weinig invloed hebben op matrixproductie, terwijl een verschil tussen 5 en 10% O2 veel invloed heeft op de matrixproductie (Ishihara et al., 1999).
Een hypoxische omgeving van 0% O2 zorgt bijna voor een halt van de productie van ECM, wat indiceert dat O2 in NPcs een kritieke factor is om ECM te produceren, maar geen kritieke factor voor cel-overleving.
Moleculaire Mechanismen – HIF-1α Het is bekend dat wanneer cellen zich in een hypoxische omgeving bevinden, het eiwit Hypoxia Induced Factor - 1α (HIF-1α) zorgt voor genexpressie; HIF-1α speelt een onmisbare rol bij het reguleren van de transcriptionele respons op hypoxische situaties. HIF-1α is een overlevingsfactor in NPcs en is normaliter (geïnhibeerd) aanwezig in cellen. Ten gevolge van hypoxie, wordt HIF-1α vrijgelaten. NPcs hebben de aanwezigheid van vrij HIF-1α nodig om, door hypoxie geïnduceerde matrixeiwit- genexpressie, te realiseren (Feng et al., 2013).
Wanneer HIF-1α actief is, kan het de Sox9 promotor induceren, die de bijbehorende effecten, zoals overleving, ECM-productie en proliferatie-stop, teweeg brengt (Robins et al.
2005). Normaliter induceert HIF-1α ook angiogenese, maar dit wordt geïnhibeerd door Hsp-70 (zie hoofdstuk Osmose).
Onder normoxische condities wordt HIF-1α gehydroxyleerd door het oxygen- dependent degradation domain (ODDD), waardoor het vervolgens wordt geubiquitineerd en opgeruimd door het 30 S proteasoom (Minegishi et al. 2013).
Het is inderdaad het geval, dat wanneer NPcs gekweekt worden onder een 1-2% O2 conditie, deze toegenomen gen- transcriptie vertonen (door HIF-1α), dan in normoxische situaties (Risbud et al., 2006).
Het is daarom aan te nemen dat HIF-1α in NPcs invloed uitoefent op de collageen II en aggrecaan productie, maar geen invloed heeft op de collageen I productie.
Een hypoxische kweekomgeving kan gemakkelijk gerealiseerd worden, door de gemaakte celkweken in een hypoxische incubator te plaatsen. Een nadeel van deze incubators echter, is dat deze in een
5
laboratorium vaak door meerderen gebruikt wordt, waardoor na het openen en sluiten van de incubator, elke keer de hypoxische omgeving verstoord wordt. Deze snelle omschakeling van een hypoxische naar normoxische omgeving kan een (ongewenste) reactie veroorzaken bij de celkweken.
Een eventuele oplossing hiervoor is dat het mogelijk is om hypoxische situaties na te bootsen met het gebruik van een overmaat deferoxamine. Deze stof vangt ijzer ionen weg en daarmee ook de zuurstofdragende capaciteit (Risbud et al., 2006). Mogelijke nadelige effecten van deferoxamine op NPcs moeten nog worden onderzocht.
hypoxische kweek-condities zijn essentieel voor het behouden van het NP-cel fenotype. De HIF-1α pathway is een onmisbaar element in het in vitro kweken van NPcs, mits gecombineerd met een hyper osmotische omgeving.
Hyperosmolariteit
Zoals eerder genoemd is de ECM van de NP rijk aan aggrecaan. Aggrecaan is een proteoglycaan met vele glycosaminoglycaan- ketens (GenBank, 2007). Glycosamino- glycanen (GAG) dragen een negatieve lading, wat er onder andere voor zorgt dat er in de NP water wordt aangetrokken. Deze GAG-ketens kunnen de osmolariteit van de NP reguleren, via het Gibbs-Donann effect.
Na+, K+ en Ca2+ concentraties zijn in de NP hoger dan in andere weefsels, doordat vrije ionen kunnen binden aan de negatieve GAG- ketens. Hierdoor heerst er in de NP een hyperosmotische omgeving van 450-550 mOsm/kg (Wuertz et al., 2007).
Wanneer er een hoge druk wordt uitgeoefend op de TWS, zal de NP inzakken waardoor de gel-achtige inhoud tegen de AF aan drukt. Vanwege de constante druk die de TWSen te verduren krijgen, treedt er een hoeveelheid water in de AF vanuit de NP.
Per dag kan dit oplopen van 20 tot 25%
(Urban & McMullin, 1985). Door de hoge osmolariteit zal de NP echter genoeg water vasthouden en zal de druk nog voldoende verdeeld kunnen worden (Brinckmann et al.,
1983). Omdat de hoeveelheid water verlaagt in de NP, stijgt dus, naarmate de dag vordert, de osmolariteit in de NP. Wanneer men ’s nachts ligt, zal het water terug resorberen naar de NP (Urban & McMullin, 1985).
Doordat in de AF minder GAGs aanwezig zijn dan in de NP, is er ook een bepaalde osmotische gradiënt binnen de NP.
Zo heerst er een osmolariteit van gemiddeld 500 mOsm/kg in de kern van de NP, terwijl richting de AF de osmolariteit al gauw afneemt met circa 10 mOsm/kg (Massey et al., 2011; figuur 7).
Omdat onderzoekers vaak met maar één kweekconditie rekening houden, bij onderzoek naar de NP in vitro, wordt de osmolariteit wel eens vergeten of genegeerd.
Dit is sterk ten onrechte, aangezien niet lang geleden is aangetoond dat cellen kunnen reageren op osmolaire stress (Ishihara et al., 1997). Deze moleculaire mechanismen die hier aan ten grondslag liggen, kunnen een dusdanig positief effect hebben op NPcs, dat een hyperosmotische omgeving onmisbaar is in een NP-celkweek. Cellen die worden blootgesteld aan een hyperosmotische omgeving zullen vocht verliezen en dus krimpen. In een hypo-osmotische omgeving zullen cellen dan ook vocht opnemen. Deze verschillen in volume kunnen grote effecten hebben op cellulaire mechanismen (Ishihara et al., 1997).
Er zijn op dit moment reeds een aantal onderzoeken gedaan naar de effecten van verschillende osmolariteit op het cel- metabolisme van NPcs. Zo is er aangetoond dat een hyperosmotisch medium, gecreëerd met polyethyleenglycol van 457 mOsm/kg, er voor zorgt dat NPcs niet opzwellen en het cel-metabolisme gelijk bleef met de dag 0 in vitro situatie (Van Dijk et al., 2011).
In de literatuur is veel discussie over wat de optimale hyperosmolariteit zou zijn voor het kweken van NPcs. Het is aangetoond dat een hyperosmotische omgeving van circa 400 mOsm/kg, de
Figuur 3 – Relatieve genexpressie van aggrecaan, collageen type I en II. – aangepast naar Van Dijk et al., 2013
Samenvattend,
aggrecaan concentraties verlaagt, terwijl collageen II concentraties gelijk blijven aan de fysiologische situatie. Dit resultaat komt mogelijk tot stand door de te korte kweekperiode, of de te lage osmolariteit die gebruikt is (Tao et al.,2013; Van Dijk et al., 2013; figuur 3). Wanneer een hogere osmolariteit wordt gebruik (500 mOsm/kg), neemt wel degelijk de mRNA expressie van de desbetreffende genen toe (Wuertz et al., 2007; figuur 4).
Moleculaire Mechanismen – TonEBP Tonicity enhancer binding protein (TonEBP) wordt door de cel aangemaakt wanneer die zich in een hyperosmotische omgeving bevindt. Dit wordt gerealiseerd door activatie van de ERK/Akt pathway, wat uiteindelijk het gen NFAT5 activeert.
Activatie van het NFAT5-gen zorgt voor een verlaging of onderdrukking van collageen I synthese, terwijl het de collageen II synthese aanzienlijk bevordert (Van der Windt et al., 2010). Figuur 5 laat zien hoe het proces te werk gaat in muizen (Fenton et al., 2007).
Het is vrijwel zeker dat de signaaltransductie net zo verloopt in mensen als in muizen.
TonEBP en HIF-1α
TonEBP induceert Heat Shock Protein-70-transcriptie (Hsp-70) in NPcs indien ze zich van normoxische naar hypoxische omgeving begeven (bijv. door extractie uit mens). Het Hsp-70 zorgt er voor dat HIF-1α gedegradeerd wordt en zodoende geen hypoxische genen geactiveerd worden.
Dit effect is alleen merkbaar in de eerste 24 uur, na de veranderende kweekcondities (Gogate et al., 2012). Dit geeft weer, dat een experiment met NPcel-kweken in ieder geval, wanneer in vitro gekweekt, langer dan 24 uur moet duren, zodat de NPcs kunnen aanpassen aan de nieuwe kweekcondities.
Tevens zijn TonEBP en Hsp70 verantwoordelijk voor de inhibitie van angiogenese-factoren. Zodoende zullen de cellen geen signalen geven om nieuwe bloedvaten te vormen. Indien de osmolariteit daalt, wat het geval is in degeneratieve TWSen, zal het inhibitoire signaal dus mogelijk komen te vervallen, waardoor het mogelijk wordt gemaakt om angiogenese te realiseren (Gogate et al., 2012).
Combinatiestudies
Osmolariteit en Mechanische Stress
Door volumeverschillen die optreden in de NP, zullen er ook verschillen optreden in de krachtwerking op de TWSen. Zo is aangetoond dat het volume in de NP een belangrijke determinant is voor de gevoeligheid van NPcs op mechanische stress (Bush et al., 2005). Dit wordt verder uitgediept in het hoofdstuk Mechanische Druk.
Osmolariteit en Hypoxie
Van Dijk et al. hebben reeds combinatiestudies uitgevoerd met de hyper- osmotische en hypoxische kweekcondities.
Hieruit is gebleken dat inderdaad het verhogen van de osmolariteit én het kweken onder hypoxische omstandigheden, de NPcs sterker terugbrengt naar het originele fenotype, dan wanneer er onderzoek gedaan wordt met slechts één van deze kweekcondities (Van Dijk et al., 2013).
Samenvattend,
de extracellulaire omgeving is van groot belang bij het kweken van NPcs. De heersende osmolariteit kan via meerdere manieren invloed uitoefenen op NPcs. Uit
Figuur 4 – mRNA expressie van aggrecaan en collageen type II neemt toe en de mRNA expressie van collageen type I neemt af naarmate osmolariteit stijgt.- aangepast naar Wuertz et al., 2007.
Figuur 5 – Signaaltransductieroute van TonEBP in muizen. TonEBP activeert Hsp-70 en voorkomt apoptose door een hyperosmotische omgeving. – Fenton et al., 2007
7
het literatuuronderzoek is gebleken dat een hyperosmotische omgeving van rond de 500 mOsm/kg de optimale osmolaire kweekconditie is voor humane NPcs.
Net zoals hypoxie, is hyper- osmolariteit een onmisbare factor bij het kweken van NPcs, om te voorkomen dat deze opzwellen of collageen I gaan produceren.
De invloed op collageen II en aggrecaan niveaus moet nog verder worden onderzocht, maar kunnen reeds als positief worden bevonden.
Mechanische Druk
De functie van de TWSen is om de druk die op de wervelschijven staat, op te vangen en te verdelen. Het zijn als het ware de schokdempers van het lichaam (Buckwalter, 1995).
Door deze mechanische druk kunnen de TWSen inbuigen, waardoor de druk wordt verdeeld over de gehele AF (figuur 6). In een gezond individu bedraagt deze druk overdag gemiddeld ongeveer 0.75 MPa. De druk is het laagst wanneer men ligt (0.1 – 0.2MPa), en het hoogst wanneer men voorovergebogen zit (1.5 – 2.5 MPa) (Wilke et al., 1999).
De opvang van de druk wordt binnen de TWSen verzorgd door de aanwezige ECM-moleculen. Het collageen-netwerk kan zorgen voor bepaalde rekkracht en zet ook de AF vast aan de omliggende wervelschijven (Urban & Roberts, 2003). Ook is er collageen IX in de NP gevonden, waarvan wordt gedacht dat deze cross-links vormt tussen collageen-fibrillen en zodoende de structuur nog meer verstevigt (Eyre et al., 2001).
Aggrecaan zorgt er voor dat de NP gehydrateerd blijft en dus de osmotische gradiënt relatief gelijk blijft (figuur 7). Door invloeden van mechanische druk wordt deze
hyperosmotische omgeving echter ook beïnvloedt naarmate de druk toeneemt en de dag afloopt (Wuertz et al., 2007). Zoals eerder genoemd bij het hoofdstuk Hyperosmolariteit wordt het vocht in de AF geduwd, naarmate de dag vordert. De mechanische druk en osmolariteit staan, in het geval van NPcs, dus nauw in verband met elkaar.
Er zijn reeds een aantal experimenten uitgevoerd die de effecten van artificiële mechanische druk op NP trachtten te illustreren. Deze experimenten zijn echter lastig te realiseren, omdat er nog geen machine bestaat, die een precieze in vivo situatie kan reproduceren. De in vivo situatie verschilt vanzelfsprekend tussen elk individu, aangezien de één juist veel aan sport doet, terwijl de ander liever de hele dag televisie kijkt (Massey et al., 2011). Verwacht wordt, dat wanneer iemand veel sport, zijn of haar TWSen eerder zullen slijten dan iemand die de hele dag zit. Dit is lang niet altijd het geval, beweging is namelijk essentieel om de diffusie van voedingsstoffen beter en sneller te laten verlopen (Wilke et al., 1999). Deze mechanische stimulering is dus noodzakelijk voor gezond TWS-weefsel.
In de meeste gevallen, ook in het geval van TWSen, worden bepaalde types mechanische druk onderscheiden. Dit zijn;
hydrostatische druk, cyclische rek/spanning en (af)schuifspanning. De hydrostatische druk in de NP is hoofdzakelijk afhankelijk van de wisselende osmolariteit. Door de hoge osmolariteit wordt er veel water aan- getrokken, wat tegen de AF aandrukt, wat voor een terugwerkende kracht zorgt. Indien de NP dus wordt ingebogen, zal deze hydrostatische druk alleen maar verhogen (Wuertz et al., 2007; figuur 6). In degenererende TWSen neemt deze hydrostatische druk drastisch af. Dit type druk is onder andere ook verantwoordelijk voor het in laten klappen van mogelijk vormende bloedvaten en neuronen (Adams et al., 2014). Het is dus goed mogelijk dat door afname van deze druk, de degeneratie bevordert.
Cyclische rek komt voornamelijk voor in de AF. Dit komt doordat de collageen-fibrillen van de AF zo zijn gepositioneerd, dat ze diagonaal tegen de NP staan. Indien de NP dus tegen de AF aandrukt, zal deze de druk, in zekere zin,
Figuur 6 – Verschillende soorten mechanische druk op de TWS. C = compressie, P = hydrostatisch, T = cyclisch. – Adams & Roughley, 2006.
cirkelvormig doorgegeven worden, door de gehele annulus (Adams & Roughley, 2006;
figuur 6).
Afschuifspanning wordt veroorzaakt doordat een individu zijwaarts buigt. De ene kant van de TWS wordt dan samengedrukt, terwijl de andere helft vergoot. Het is in ratten in vivo aangetoond, dat wanneer er constante afschuifspanning wordt uitgeoefend op TWSen, dit degeneratie in de NP zal induceren (Kim et al., 2012).
Dus, het is een onbetwistbaar feit dat mechanische factoren, in een in vitro onderzoek moeten worden meegenomen.
Momenteel zijn er een aantal modellen beschikbaar voor in vitro studies, die de hydrostatische druk, cyclische spanning en afschuifspanning kunnen nabootsen (Neidlinger-Wilke et al. 2005; figuren 8, 9).
Er zijn weinig studies gedaan naar de effecten van bepaalde druk op NPcs in een in vitro situatie. Wuertz et al. zijn in staat geweest om 3D-gekweekte NPcs onder hydrostatische druk óf cyclische spanning te zetten, met behulp van specifieke machinerie (Wuertz et al., 2007).
Het is ook mogelijk om een bepaalde standaard bioreactor te gebruiken. Zo kan er een spinning flask of rotating wall worden gebruikt om afschuifspanning te induceren (Schulz & Bader, 2007). Het nadeel van bioreactoren en andere machinerie, is dat deze meestal één type mechanische druk kunnen nabootsen. In de fysiologische situatie is vanzelfsprekend continu wisseling en combinatie tussen alle typen krachten.
Tegenwoordig zijn er ook ontwikkelingen ontstaan naar het maken van een artificiële AF + hyaliene eindplaat. Dit zou de fysiologische toestand beter nabootsen dan complexe machinerie en ook betrouw- baardere resultaten geven (Van Dijk et al., 2013).
Combinatiestudies
Mechanische druk en Osmolariteit
Momenteel zijn er weinig studies gedaan die beide druk en osmolariteit als kweekcondities hebben toegepast. In het hoofdstuk Zuurgraad wordt een eventueel combinatiemechanisme besproken.
Om enkel de mechanische druk als kweekconditie te gebruiken heeft weinig zin.
Indien mechanische kweekcondities gecombineerd worden met andere kweekcondities, zoals hyperosmolariteit en zuurgraad, is het zinvol.
Figuur 8 – Schematisch overzicht van machine die cyclische spanning kan aanbrengen. De siliconen bolletjes bewerkstelligen de spanning. – Neidlinger-Wilke et al. 2005
Figuur 9 – Schematisch overzicht van machine die hydrostatische druk kan aanbrengen. – Neidlinger-Wilke et al. 2005
Figuur 7 – Osmotisch (en druk-) gradiënt van een gezonde TWS weergegeven in MPa. – Massey et al., 2011
9 Samenvattend,
2D Versus 3D
Bij hedendaags onderzoek in het biomedisch vakgebied, wordt zoveel mogelijk gewerkt met 3D celkweken, in plaats van 2D.
2D celkweken worden voornamelijk gebruikt voor farmacologisch onderzoek, aangezien 2D kweken ideaal zijn om de initiële cellulaire respons te bestuderen op toediening van een bepaalde drug. Ook worden ze binnen het biomedisch vakgebied veel gebruikt om de cel- populatie te expanderen.
Een kritiek punt bij het expanderen van de celkweek, is dat bij NPcs de cellen na 2 à 3 generaties (“passes”) drastisch beginnen te de- differentiëren (Shen et al., 2013). Indien men dus meer cellen nodig heeft, dan dat wat tot zijn of haar beschikking staat, zal de onderzoeker gedwongen zijn de cellen te expanderen en hoogstens een generatie 3 cellijn te gebruiken voor de experimenten.
Opmerkelijk is, dat onlangs een immortale NP-cellijn is ontwikkeld, die zelfs na tientallen generaties, ACAN en COL2A1 (de complementaire genen van aggrecaan en collageen II) bleven expresseren in een 2D en 3D celkweek. Deze cellijn is ontwikkeld door middel van een transfectie met het HPV (Liu et al., 2014). Deze immortale cellijn is niet carcinogeen en kan dus een geschikt model vormen voor in vitro onderzoeken, zonder dat wetenschappers zich zorgen hoeven te maken over het aantal generaties cellijnen.
Om de fysiologische omgeving zo accuraat mogelijk na te bootsen, moet er vanzelfsprekend een 3D kweek worden gebruikt. 3D kweekmogelijkheden voor chondrocyt-achtigen, zoals NPcs, zijn gelimiteerd tot voornamelijk alginaat balletjes, pellet kweken en collageen I matrices (Pei et al., 2012; Van Dijk et al., 2013). Alle drie de bovenstaande kweektypen zijn onvoldoende representatief voor de fysiologische condities van NPcs. Er wordt hierbij geen rekening gehouden met de aanwezigheid van collageen II en aggrecaan in de NP, laat staan de omringende collageen I structuur van de AF.
2D kweken moeten enkel worden gebruikt om de cel-populatie te expanderen.
Voor specifiek onderzoek naar NPcs is het van belang dat er 3D kweken moeten worden gebruikt.
Zuurgraad
Vanwege het feit dat NPcs afhankelijk zijn van voornamelijk anaeroob metabolisme en diffusie, zal er veel melkzuur ophopen als afvalproduct van dit proces (Grunhagen et al., 2006). De dalende pH-waarde in de ECM, ten gevolge van deze afscheiding van melkzuur, heeft invloed op de GAG-synthese, maar niet op de collageen synthese (Wu & Chen, 2000). Indien de pH- waarde daalt wordt er, onder andere, meer aggrecaan geproduceerd, die de positief geladen ionen kan wegvangen. De osmolariteit is zodoende ook afhankelijk van de extracellulaire pH-waarde. Maar wat regelt nu de pH-waarde?
Onlangs is gebleken dat NPcs genen uiten die zorgen voor aanmaak van Acid- Sensing Ion Channels (ASICs). Deze ASICs zijn in staat te openen, wanneer in de ECM de pH-waarde zodanig daalt, dat de omgeving haast toxisch is voor de cellen. Alleen de specifieke subtypen ASIC1, ASIC2 en ASIC3 worden geuit op NPcs membranen (Cuesta et al., 2014).
Voor elk verschillend subtype ASIC is een drempel-pH-waarde wanneer ze openen.
Wanneer de pH-waarde in de ECM daalt tot de bijbehorende waarden, zullen de ASICs activeren en actief Na+, K+ en Ca2+ de cel binnen pompen. De verwachting is, dat deze kation- influx voor proliferatie en enzymatische activatie zorgt binnen de NPcs, maar specifieke signaaltransductieroutes zijn nog onbekend (Cuesta et al., 2014).
Combinatiestudies pH en mechanosensing
Zoals eerder genoemd in het hoofdstuk Mechanische Druk, zijn cellen in staat te reageren op verschillende typen druk. Naarmate men leeft neemt de druk op de TWSen alleen maar toe (Massey et al., 2011). Het is gebleken dat de bovengenoemde ASIC-mRNAs, méér worden geuit wanneer er meer sprake is van mechanische druk. Er wordt gedacht dat de krachten in staat zijn de kanalen te sluiten, waardoor deze ASICs mechanosensoren worden (Cuesta et al., 2014).
Er zijn vooralsnog weinig artikelen geschreven over de effecten van veranderende extracellulaire pH-waarden op NPcs. Het blijkt desondanks een belangrijk aspect te zijn, waar nog meer onderzoek naar moet worden verricht.
Samenvattend, Samenvattend,
Vergelijking en Optimalisering
De momenteel gebruikte kweek- condities van NPcs zijn niet optimaal.
Het voorgaande literatuuronderzoek heeft de hedendaags gebruikte kweek- condities besproken, uitgediept en soms in verband met elkaar gebracht.
In het volgende gedeelte zullen deze kweekcondities met elkaar en onderling worden vergeleken, waaruit uiteindelijk een literair en analytisch onderbouwd advies ontstaat, die de huidige kweek-opties van NPcs moet verbeteren. Elke kweekconditie heeft verschillende invloeden op het cellulaire metabolisme van NPcs. Dit kan tot zekere wijze terug worden geleidt tot het moleculaire niveau, maar nog lang niet alle signaaltransductieroutes zijn bekend.
Hypoxische Omgeving
Een onmisbare kweekconditie. Samen met hyperosmolariteit beïnvloedt het intracellulaire signaaltransducties, waardoor de NPcs collageen II en aggrecaan gaan produceren. De hypoxische omgeving in de NP wordt veroorzaakt door een gebrek aan bloedtoevoer. Voedingsstoffen diffuseren via de hyaliene eindplaat richting de NP. Het fysiologische zuurstofpercentage in de NP bedraagt ongeveer 1-2%. Deze fysiologische conditie kan zonder enige problemen in het laboratorium worden nagebootst, door middel van het gebruik van een hypoxische incubator en mogelijk additioneel gebruik van deferoxamine. Ook met de lage concentratie voedingsstoffen moet rekening worden gehouden; 1g glucose/L medium is optimaal.
Hyperosmolariteit
Hyperosmolariteit is de meest belangrijke kweekconditie voor NPcs. De signaaltransductie van TonEBP en Hsp-70 zijn onmisbaar in een gezonde NP-celkweek.
De hoge osmolariteit bevordert de invloed
van een hypoxische omgeving, maar ook in een normoxische omgeving laat de hyper- osmotische omgeving effecten zien in NPcs.
Een hyperosmotische omgeving voor NPcs is gemakkelijk te realiseren. Men moet goede keuzes maken, met welke stof ze het groeimedium hyperosmotisch maken. De osmolariteit van een vloeistof wordt vaak verhoogd met simpel NaCl. Dit is voor NPcs echter erg ongeschikt, omdat de aanwezige AISCs er voor kunnen zorgen dat de cellen deze Na+-ionen kunnen gaan uitwisselen, waardoor ongewenste intracellulaire signaal- transducties in werking worden gesteld. Het gebruik van polyethyleenglycol, zoals gedemonstreerd door Van Dijk et al., lijkt een goede stof te zijn om het medium op voldoende hoge osmolariteit te brengen.
De cytotoxische eigenschappen van polyethyleenglycol op NPcs is nog niet voldoende onderzocht.
De meest ideale situatie is daarom, om in plaats van polyethyleenglycol, een matrix van collageen II met aggrecaan te maken. Dit is echter nog niet haalbaar, vanwege de minder rigide structuur van collageen II. Tevens zal dit histologische studies naar eiwitproductie nutteloos maken, omdat de matrix-eiwitten reeds als scaffold fungeren. De optimale osmolariteit voor NPcs heeft een breed grensgebied; 450 tot 550 mOsm/kg.
Mechanische Druk
Wanneer er enkel geëxperimenteerd wordt met verschillende typen druk op NPcs, zal het resultaat niet veelbelovend zijn.
Experimenten waarbij druk werd uitgeoefend op de NP (hydrostatisch/cyclisch /afschuif- spanning), gaven in combinatie met een andere kweekconditie, wel goede resultaten.
Zo werden sommige effecten geamplificeerd, waarbij ongewenste effecten werden verminderd. Na het ontdekken van de AISCs, is mechanische druk alleen maar meer van belang.
11
2D Versus 3D
Bij het kweken van NPcs moet altijd een 3D opzet worden gebruikt. Een optimale 3D scaffold voor NPcs, is helaas nog niet ontwikkeld. Wat optimaal zou zijn, is een netwerk van collageen II fibrillen, waar de NPcs in kunnen groeien. Op dit moment worden NPcs nog vaak in alginaat, in pellet cultures of in collageen I matrices gekweekt;
dit is verre van optimaal. Door de invloed van collageen I zullen de NPcs ondervinden dat ze tegen de AF aan liggen en zodoende een ander genetisch patroon gaan uiten. Een goede opzet is al gemaakt; Van Dijk et al.
heeft een artificiële AF gemaakt. Indien deze AF geoptimaliseerd wordt (met collageen II en aggrecaan supplementen), zal dit een optimale kweekconditie zijn voor NPcs.
Zuurgraad
Waar in de literatuur te weinig rekening mee wordt gehouden is de zuurgraad van de ECM. Er is onlangs aangetoond dat NPcs specifieke zuur-gevoelige kanalen op het membraan uiten, waarmee ze kation-influx kunnen reguleren. Fysiologisch gezien zal de pH-waarde in de NP lager liggen, dan men eerst veronderstelde. Dit vanwege het melkzuurmetabolisme van de NPcs. Er moet nog onderzoek gedaan worden naar wisselingen in de pH-waarden binnen de NP in vivo. Ik kan om deze reden, nog geen advies uitspreken over de optimale pH-waarde voor NPcel-kweken. Waarschijnlijk zal dit lager zijn, dan de fysiologische waarde van ~7.4.
Conclusie
Onderrugpijn is tot nu toe een blijvend probleem in onze vergrijzende maatschappij.
Indien men tracht een oplossing te vinden voor dit pathologische fenomeen, zal een goed in vitro model moeten worden opgesteld.
Hedendaagse in vitro modellen limiteren zich tot één of twee verschillende kweekcondities, terwijl humane Nucleus Pulposus cellen continu meerdere factoren te verduren krijgen. Deze in vitro modellen zijn daarom onvoldoende terug te leiden naar de in vivo
situatie en worden in mijn optiek daarmee ongeschikt geacht. De kweekcondities, die in dit verslag besproken zijn, moeten daarom in de juiste balans en toedracht worden gebruikt tijdens het kweken van NPcs in vitro.
Vanwege het feit dat een aantal biomaterialen niet beschikbaar zijn (collageen II matrix, artificiële annulus) en de invloed van de zuurgraad op NPcs nog onduidelijk is, heb ik deze factoren niet specifiek meegenomen in mijn advies.
Uiteindelijk kom ik dan tot het volgende beargumenteerde advies; “Nucleus Pulposus cellen dienen gekweekt te worden in een hypoxische, hyperosmotische 3D constructie, waarbij idealiter rekening wordt gehouden met een diurnaal patroon van krachtwerking.”1
1 N.B.; Deze scriptie bestaat uit ~5600 woorden
13 Persoonlijk heb ik van het schrijven van deze scriptie erg genoten. Nadat het een aantal dagen flink wat stress heeft opgeleverd, ben ik tevreden met het uiteindelijke resultaat. Het literatuuronderzoek heeft mij verder weten te enthousiasmeren voor het onderzoeksleven en tevens in het behandelde onderwerp; de degeneratie van tussenwervelschijven.
Graag wil ik hier nog de mogelijkheid nemen om een aantal mensen te bedanken; Prof. Dr. Ruud Bank, voor het begeleiden bij het maken van deze scriptie. PhD Jelena Celeketic-Popov, die mij enthousiast heeft weten te maken voor het onderwerp. En 'last, but not least', Alice Hulzebos, Shanna Zwartscholten en Rianne Lovers voor het proofreaden van deze scriptie.
Allen bedankt!
Nawoord
Referenties
1. Adams, M. A., Lama, P., Zehra, U., & Dolan, P. (2014). Why do some intervertebral discs degenerate, when others (in the same spine) do not? Clinical Anatomy (New York, N.Y.),
2. Adams, M. A., & Roughley, P. J. (2006). What is intervertebral disc degeneration, and what causes it? Spine, 31(18), 2151- 2161.
3. Brinckmann, P., Frobin, W., Hierholzer, E., & Horst, M. (1983). Deformation of the vertebral end-plate under axial loading of the spine. Spine, 8(8), 851-856.
4. Buckwalter, J. A. (1995). Aging and degeneration of the human intervertebral disc. Spine, 20(11), 1307-1314.
5. Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., & Hall, A. C. (2005). Viability and volume of in situ bovine articular chondrocytes-changes following a single impact and effects of medium osmolarity. Osteoarthritis and Cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society,13(1), 54-65.
6. Chan, W. C., Au, T. Y., Tam, V., Cheah, K. S., & Chan, D. (2014). Coming together is a beginning: the making of an intervertebral disc. Birth Defects Research.Part C, Embryo Today : Reviews, 102(1), 83-100.
7. Cuesta, A., Del Valle, M. E., Garcia-Suarez, O., Vina, E., Cabo, R., Vazquez, G., et al. (2014). Acid-sensing ion channels in healthy and degenerated human intervertebral disc. Connective Tissue Research, 55(3), 197-204.
8. Eyre, D. R., Wu, J. J., Fernandes, R. J., Pietka, T. A., & Weis, M. A. (2002). Recent developments in cartilage research:
matrix biology of the collagen II/IX/XI heterofibril network. Biochemical Society Transactions, 30(Pt 6), 893-899.
9. Feng, G., Li, L., Liu, H., Song, Y., Huang, F., Tu, C., et al. (2013). Hypoxia differentially regulates human nucleus pulposus and annulus fibrosus cell extracellular matrix production in 3D scaffolds. Osteoarthritis and Cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society,21(4), 582-588.
10. Fenton, R. A., & Knepper, M. A. (2007). Mouse models and the urinary concentrating mechanism in the new millennium. Physiological Reviews, 87(4), 1083-1112.
11. GenBank, Database via PubMed geraadpleegd met zoekterm “aggrecan”. Strausberg et al., 2007.
12. Gogate, S. S., Fujita, N., Skubutyte, R., Shapiro, I. M., & Risbud, M. V. (2012). Tonicity enhancer binding protein (TonEBP) and hypoxia-inducible factor (HIF) coordinate heat shock protein 70 (Hsp70) expression in hypoxic nucleus pulposus cells: role of Hsp70 in HIF-1alpha degradation. Journal of Bone and Mineral Research : The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research, 27(5), 1106-1117.
13. Grunhagen, T., Wilde, G., Soukane, D. M., Shirazi-Adl, S. A., & Urban, J. P. (2006). Nutrient supply and intervertebral disc metabolism. The Journal of Bone and Joint Surgery.American Volume, 88 Suppl 2, 30-35.
14. Henriksson, H. B., & Brisby, H. (2013). Development and regeneration potential of the mammalian intervertebral disc. Cells, Tissues, Organs, 197(1), 1-13.
15. Ishihara, H., & Urban, J. P. (1999). Effects of low oxygen concentrations and metabolic inhibitors on proteoglycan and protein synthesis rates in the intervertebral disc. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society, 17(6), 829-835.
16. Ishihara, H., Warensjo, K., Roberts, S., & Urban, J. P. (1997). Proteoglycan synthesis in the intervertebral disk nucleus: the role of extracellular osmolality. The American Journal of Physiology, 272(5 Pt 1), C1499-506.
17. Johnson, W. E., Caterson, B., Eisenstein, S. M., Hynds, D. L., Snow, D. M., & Roberts, S. (2002). Human intervertebral disc aggrecan inhibits nerve growth in vitro. Arthritis and Rheumatism, 46(10), 2658-2664.
18. Johnson, W. E., Caterson, B., Eisenstein, S. M., & Roberts, S. (2005). Human intervertebral disc aggrecan inhibits endothelial cell adhesion and cell migration in vitro. Spine, 30(10), 1139-1147.
19. Kandel, R., Iu, J., & Santerre, P. (2014). Inner and Outer Annulus Fibrosus Cells Exhibit Differentiated Phenotypes and Yield Changes in Extracellular Matrix Protein Composition in Vitro on a Polycarbonate Urethane Scaffold. Tissue Engineering.Part A,
20. Kim, J., Yang, S. J., Kim, H., Kim, Y., Park, J. B., Dubose, C., et al. (2012). Effect of shear force on intervertebral disc (IVD) degeneration: an in vivo rat study. Annals of Biomedical Engineering, 40(9), 1996-2004.
21. Liu, M. C., Chen, W. H., Wu, L. C., Hsu, W. C., Lo, W. C., Yeh, S. D., et al. (2014). Establishment of a promising human nucleus pulposus cell line for intervertebral disc tissue engineering. Tissue Engineering.Part C, Methods, 20(1), 1-10.
22. Macfarlane, G. J., Thomas, E., Croft, P. R., Papageorgiou, A. C., Jayson, M. I., & Silman, A. J. (1999). Predictors of early improvement in low back pain amongst consulters to general practice: the influence of pre-morbid and episode-related factors. Pain, 80(1-2), 113-119.
23. Massey, C. J., van Donkelaar, C. C., Vresilovic, E., Zavaliangos, A., & Marcolongo, M. (2012). Effects of aging and degeneration on the human intervertebral disc during the diurnal cycle: a finite element study. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society, 30(1), 122-128.
24. Minegishi, H., Fukashiro, S., Ban, H. S., & Nakamura, H. (2013). Discovery of Indenopyrazoles as a New Class of Hypoxia Inducible Factor (HIF)-1 Inhibitors. ACS Medicinal Chemistry Letters, 4(2), 297-301.
25. Neidlinger-Wilke, C., Wurtz, K., Liedert, A., Schmidt, C., Borm, W., Ignatius, A., et al. (2005). A three-dimensional collagen matrix as a suitable culture system for the comparison of cyclic strain and hydrostatic pressure effects on intervertebral disc cells. Journal of Neurosurgery.Spine, 2(4), 457-465.
26. Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., & Takahashi, K. (2014). Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. The Spine Journal : Official Journal of the North American Spine Society,
27. Pei, M., Shoukry, M., Li, J., Daffner, S. D., France, J. C., & Emery, S. E. (2012). Modulation of in vitro
microenvironment facilitates synovium-derived stem cell-based nucleus pulposus tissue regeneration. Spine, 37(18), 1538- 1547.
28. Risbud, M. V., Guttapalli, A., Stokes, D. G., Hawkins, D., Danielson, K. G., Schaer, T. P., et al. (2006). Nucleus pulposus cells express HIF-1 alpha under normoxic culture conditions: a metabolic adaptation to the intervertebral disc
microenvironment. Journal of Cellular Biochemistry, 98(1), 152-159.
29. Robins, J. C., Akeno, N., Mukherjee, A., Dalal, R. R., Aronow, B. J., Koopman, P., et al. (2005). Hypoxia induces chondrocyte-specific gene expression in mesenchymal cells in association with transcriptional activation of Sox9. Bone, 37(3), 313-322.
30. Rodriguez, A. G., Slichter, C. K., Acosta, F. L., Rodriguez-Soto, A. E., Burghardt, A. J., Majumdar, S., et al. (2011).
Human disc nucleus properties and vertebral endplate permeability. Spine, 36(7), 512-520.
31. Shen, J., Hu, Z., Zhong, X., Wang, D., & Xu, L. (2013). Restoring phenotype of dedifferentiated normal nucleus pulposus cells by resveratrol. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi = Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi = Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 27(5), 547-553.
15
32. Sivan, S. S., Roberts, S., Urban, J. P., Menage, J., Bramhill, J., Campbell, D., et al. (2014). Injectable hydrogels with high fixed charge density and swelling pressure for nucleus pulposus repair: biomimetic glycosaminoglycan analogues. Acta Biomaterialia, 10(3), 1124-1133.
33. Tao, Y. Q., Liang, C. Z., Li, H., Zhang, Y. J., Li, F. C., Chen, G., et al. (2013). Potential of co-culture of nucleus pulposus mesenchymal stem cells and nucleus pulposus cells in hyperosmotic microenvironment for intervertebral disc
regeneration. Cell Biology International, 37(8), 826-834.
34. Tran, C. M., Fujita, N., Huang, B. L., Ong, J. R., Lyons, K. M., Shapiro, I. M., et al. (2013). Hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and CCN2 form a regulatory circuit in hypoxic nucleus pulposus cells: CCN2 suppresses HIF-1alpha level and transcriptional activity. The Journal of Biological Chemistry, 288(18), 12654-12666.
35. Urban, J. P., & McMullin, J. F. (1985). Swelling pressure of the inervertebral disc: influence of proteoglycan and collagen contents. Biorheology, 22(2), 145-157.
36. Urban, J. P., & Roberts, S. (2003). Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy, 5(3), 120-130.
37. van der Windt, A. E., Haak, E., Das, R. H., Kops, N., Welting, T. J., Caron, M. M., et al. (2010). Physiological tonicity improves human chondrogenic marker expression through nuclear factor of activated T-cells 5 in vitro. Arthritis Research &
Therapy, 12(3), R100.
38. van Dijk, B., Potier, E., & Ito, K. (2011). Culturing bovine nucleus pulposus explants by balancing medium osmolarity. Tissue Engineering.Part C, Methods, 17(11), 1089-1096.
39. van Dijk, B. G., Potier, E., & Ito, K. (2013). Long-term culture of bovine nucleus pulposus explants in a native environment. The Spine Journal : Official Journal of the North American Spine Society, 13(4), 454-463.
40. Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., & Claes, L. E. (1999). New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine, 24(8), 755-762.
41. Wu, Q. Q., & Chen, Q. (2000). Mechanoregulation of chondrocyte proliferation, maturation, and hypertrophy: ion- channel dependent transduction of matrix deformation signals. Experimental Cell Research, 256(2), 383-391.
42. Wuertz, K., Urban, J. P., Klasen, J., Ignatius, A., Wilke, H. J., Claes, L., et al. (2007). Influence of extracellular osmolarity and mechanical stimulation on gene expression of intervertebral disc cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society, 25(11), 1513-1522.
