Identification and characterization of starch and inulin modifying network of Aspergillus niger by functional genomics
Yuan, X.L.
Citation
Yuan, X. L. (2008, January 23). Identification and characterization of starch and inulin modifying network of Aspergillus niger by functional genomics.
Institute of Biology Leiden (IBL), Group of Molecular Microbiology, Faculty of Science, Leiden University. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/12572
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/12572
Note: To cite this publication please use the final published version (if
applicable).
Samenvatting
Aspergillusnigeris een (veel voorkomende) schimmel die van nature veel voorkomt inde
bodemengespecialiseerdisomtegroeienoporganischmateriaalvandodeplanten.Omdat
heteensaprofytischeschimmelis,produceertA.nigervelehydrolytischeenzymendieplant
polysacchariden(langesuikerketens)kunnenafbrekeninkleineremoleculen.Dezekunnen
(die) door de schimmel (kunnen) worden opgenomen en dienen als energiebron. Veel
enzymen die worden uitgescheiden door A.niger hebben potentiële toepassingen, en zijn
metnameinteressantvoor(in)devoedingsindustrie.Dezeinteresseisaanleidinggeweest
om een onderzoeksprogramma te starten waarbij met nieuwe technologieën het
enzymnetwerk dat betrokken is bij de afbraak van plant polysacchariden door A.niger te
bestuderen.Eénvandeuiteindelijkedoelenvanhetonderzoekisomhetsuikerafbrekende
enzymnetwerkinA.nigerbetertebegrijpenzodatdeenzymproductieendeefficiëntievan
de omzetting van bepaalde substraten kunnen worden gecontroleerd en verbeterd.
Daarnaast is de ontdekking van de nieuwe enzymactiviteiten van A. niger aanleiding
geweest voor veel wetenschappelijke en industriële interesse. Zowel voor het ontdekken
(de ontdekking) van nieuwe enzymen in A.niger als voor het identificeren van genen die
mogelijk betrokken zijn bij de afbraak van een bepaald substraat is gebruik gemaakt van
nieuwetechnologieën.DSMheeftalseerstedecompleteDNAvolgordevangenoomvanA.
niger bepaald. Met deze kennis heeft DSM ook zogenoemde microarrays ontwikkeld, die
gebruiktkunnenwordenomtemetenhoehoogeenbepaaldgentotexpressiekomt(Pelet
al.,2007).
Inditproefschriftzijnwegeïnteresseerdindemoleculairemechanismeswaarmee
A. niger de aanwezigheid van verschillende (vaak complexe) koolstofbronnen in zijn
omgeving registreert en hoe de aanwezigheid van sommige suikers de expressie van een
netwerk van genen, betrokken bij extracellulaire afbraak, opname en verder
metabolisering, kan activeren om een bepaald polysaccharide af te breken. Speciale
aandacht is er voor de identificatie van zogenaamde netwerk inducerende suikers
(inducers) en transcriptiefactoren die nodig zijn voor de expressie van genen die coderen
voor eiwitten die betrokken zijn in het afbreken polysacchariden. In dit proefschrift zijn
enzymnetwerken van A. niger die betrokken zijn bij de afbraak van zetmeel en inuline
bestudeerd. Zowel zetmeel als inuline zijn polysacchariden die door de plant gemaakt
wordenalsreservevoedsel,zgnopslagsuikers.Daarnaastiserookaandachtbesteedaanhet
bepalenvandebiochemischeactiviteitvannieuwontdekteenzymenenisgeprobeerd(is)
om voor deze activiteit een functionele rol in het metabolisme van A.niger te bepalen (te
plaatsen).
Samenvatting
Hoofdstuk 1 laat zien hoe belangrijk A.niger is als producent van enzymen en geeft een
overzicht van de huidige kennis over de enzymen die betrokken zijn in de afbraak of
modificatie van zetmeel en inuline in Aspergilli. De expressie en productie van enzymen
die zijn betrokken bij polysaccharide afbraak wordt sterk gereguleerd en gecontroleerd
door verschillende algemene transcriptiefactoren (CreA, AreA, PacC), en routespecifieke
transcriptiefactoren(AmyRandInuR).Dithoofdstukgeeftdelezereenoverzichtenenige
achtergrondinformatiemetbetrekkingtotdeverschillendetranscriptiefactoreninrelatietot
genexpressie.Totslotwordenderegulatiemechanismenbeschrevenvangenendiecoderen
voordeenzymendiebetrokkenzijnbijdemodificatieofafbraakvanpolysaccharidenen
debelangrijkeaspectenvandeverschillendetranscriptiefactorendiebetrokkenzijnbijdeze
regulatie.
Om nieuwe enzymen te kunnen identificeren die werkenop zetmeel eninuline, zijn twee
(aanpakken) onderzoekslijn, methode?? gevolgd. De eerste aanpak is beschreven in
Hoofdstuk 2 en is gebaseerd op de constructie van zetmeel en inuline specifieke cDNA
expressie banken door gebruik te maken vanGateway cloning technologie. Expressie
banken voor het screenen van zowel bacteriën (E. coli) als gist (S. cerevisiae) zijn
geconstrueerd en in detail beschreven. De banken zijn getransformeerd naar E. coli en S.
cerevisiaeentransformantenzijngescreend.Vanwegeproblemeninzowelhetbereikenvan
eenhoogexpressienivovandecDNAsindetransformantenenindelevensbatbaarheidvan
de transformanten is slechts een klein aantal van hen gescreend. We geven enkele
suggesties om de methoden voor constructie en screening van cDNA expressie banken te
verbeteren.
Een tweede aanpak om nieuwe enzymatische activiteiten te identificeren is door
gebruik te maken van functioneel gekarakteriseerde enzymen die zijn gerelateerd aan het
metabolismevanzetmeeleninulin.Deaminozuurvolgordevandezeeiwittenwordendan
dmv bepaalde computerprogramma’s vergeleken met de aminozuurvolgorde van alle
eiwitten zoals die voorspeld kunnen worden op basis van de genoomsequentie. Zoals in
Hoofdstuk 3is beschreven,kan zetmeel worden afgebroken door verschillende enzymen,
amylase,glucoamylaseenglucosidaseledenvandeglycosidehydrolase(GH)families
13, 15 en 31. Deze eiwitfamilies worden gekarakteriseerd door de aanwezigheid van
gebieden met sterk geconserveerde aminozuren zgn geconserveerde domeinen. Door het
zoekennaareiwittenmetvergelijkbaredomeinen,isdevolledigeverzamelingvanGH13,
15 en 31 familieleden herkend in het A. niger genoom en werden 17 nieuwe leden
geïdentificeerd.Deexpressieanalysevandegenendiecoderenvoordezeeiwittenlaateen
groot aantal van deze genen zien met onverwachte expressiepatroon: ze werden noch
geïnduceerd door maltose (het inducerende suiker voor de enzymen betrokken bij
zetmeelafbraak) noch was de expressie afhankelijk van de aanwezigheid van de AmyR
transcriptiefactor. Van slechts twee van de nieuw geïdentificeerde enzymen, een mogelijk
glucosidase (AgdB) en een mogelijk amylase (AmyC), kan op grond van het
expressieprofiel geconcludeerd worden dat ze een rol zouden kunnen spelen tijdens de
groei van A. niger op zetmeel. De mogelijke fysiologische functies van de andere
voorspelde familie GH13, GH15 and GH31 enzymen, inclusief voorspelde intracellulaire
enzymen en eiwitten die zijn geassocieerd met het celmembraan of de celwand in
alternatieveglucangerelateerdeprocessen,wordenbesproken.
Van de nieuw geïdentificeerde enzymen uit de GH13 familie werden drie leden
(AgtA, AgtB and AgtC) in detail verder bestudeerd. Deze eiwitten die hoge gelijkheid
vertonen met schimmel amylases, zijn speciaal omdat ze waarschijnlijk via een zgn.
GlycosylPhosphatidylInositolanchor (GPIanker) aan het plasmamembraan of aan de
celwandgebondenzijn.Opvallendwasookdatzeenkelesterkgeconserveerdeaminozuren
uitdeamylasefamiliemisten.Hoofdstuk4beschrijftdefunctionelekarakteriseringvan
twee van deze eiwitten (AgtA and AgtB). Beide eiwitten werden gezuiverd uit A. niger
stammen die deze eiwitten tot overexpressie brengen en werden biochemisch
gekarakteriseerd.DoorhetanalyserenvanhetgroeidefectvaneenagtAdeletiestamenvan
stammen die agtA of agtB tot overexpressie brengen is de functie van de eiwitten verder
bestudeerd.ZowelAgtAalsAgtBvertoneneenuniektype(1,4)glucanotransferase(EC
2.4.1.25)activiteit.DeletievanagtAinA.nigerresulteerdeineenstammeteenverhoogde
gevoeligheidvooreenstofdiedeopbouwvandecelwandverstoort,CalcofluorWhite,wat
duidt op een rol van dit eiwit tijdens de vorming van de celwand. Interessant is dat
homologenvanAgtAandAgtBookaanwezigzijninandereschimmelsoortenmetglucan
in hun celwand, maar niet in gist soorten die geen glucan in hun celwand hebben. Een
mogelijkefunctievandezeenzymenisdusdatzeeenrolspelenbijdesynthesevanhet
glucanindecelwand.
InHoofdstuk5onderzoekenwehetA.nigergenoomopdeaanwezigheidvanenzymenuit
deGH32familie,waarvanwordtvermoeddatzebetrokkenzijnbijdeafbraakvaninuline.
Twee nieuwe intracellulaire eiwitten, SucB en SucC, werden geïdentificeerd, naast drie al
bekende extracellulaire inulinolitische enzymen, SucA (invertase), InuE (exoinulinase) en
InuA(endoinulinase).Transcriptieanalyselietziendatdeextracellulaireenzymenopeen
gecoördineerde manier tot expressie komen en dat de inductie plaatsvindt op inuline en
sucrose.Detranscriptievandezegenenwasookondercontrolevandecatabolietrepressor
CreA.Verdereanalysegafookaandatsucroseofeensucroseafgeleidmolecuul,maarniet
fructose,alsinduceroptreedtvoordeexpressievaninulinolytischegeneninA.niger.
InHoofdstuk 6 onderzoeken we of SucB, één van de twee nieuw ontdekte
intracellulaire invertases, eenessentiële rol speelt bij het maken van de inducer betrokken
bij het inuline of sucrose katabolisme. Hiervoor zijn de phylogenetische, moleculaire and
biochemische karakteristieken van SucB bestudeerd. Van het gezuiverde SucB eiwit is
aangetoond dat het zich gedraagt als een invertase met transfructosylerende
eigenschappen.DeletievanhetsucBgeninA.nigerresulteerdenietinveranderingvande
groeiopinulinofsucrose,wataantoontdatSucBgeenessentiëlerollijkttespelentijdens
inulineofsucrosekatabolismeinA.niger.SucBzoudaarentegennodigkunnenzijnvoor
intracellulaire omzetting van sucrose naar fructose en glucose of voor de hydrolyse van
kleinefructooligosacchariden.
Samenvatting
Zoals in Hoofdstuk 5 is beschreven werd de expressie van de genen die coderen
voor de extracellulaire inulinolytische enzymen op eenzelfde wijze gereguleerd en
geïnduceerd door sucrose en inuline. Dit suggereert dat er een gemeenschappelijke
transcriptiefactor zou kunnen bestaan om de expressie van de genen te activeren in
aanwezigheid van een inducer. In Hoofdstuk 7 beschrijven we de identificatie en
karakteriseringvaneenZn(II)2Cys6typetranscriptiefactor,dieweInuRhebbengenoemd
(Inuline Regulator). De identificatie van inuR was gebaseerd op de inspectie van
genclusters in het A. niger genoom. Het inuR gen is geclusterd met sucB, een mogelijk
intracellulair invertase (Hoofstuk 6) en een gen dat waarschijnlijk codeert voor een
suikertransporter. Deletie van het inuR gen liet een sterke gereduceerde groei zien op
inulineensucrose.Inductievandegenendiecoderenvoordeextracellulaireinulinolytische
enzymenendesuikertransporternaastdeinuRtranscriptiefactorindeaanwezigheidvan
sucroseeninulinwasafhankelijkvanInuR.ExpressieanalysevanallegenenuithetA.niger
genoom onthulde de inductie van drie additionele genen die werden geïnduceerd op
sucrose op een InuR afhankelijke manier. Deze drie genen coderen voor mogelijke
suikertransporters die mogelijk betrokken zijn bij het transport van sucrose of sucrose
afgeleidesuikers(glucoseenfructose)overdeplasmamembraan.Despecificiteitvandeze
suikertransporters is een interessant onderwerp en wordt nu verder onderzocht dmv
biochemische analyses. In silico analyse van de promotergebieden van de door InuR
gereguleerdegenenonthuldeeenwaarschijnlijkebindingsplaatsvoorInuR.Dezebestaatuit
twee CGG triplets, gescheiden door acht nucleotiden, en komt voorin alle InuR
afhankelijke,sucrosegeïnduceerdegenen.Dezemogelijkebindingsplaatslijktergopdeal
bekendebindingsplaatsvandeAmyRtranscriptifactor(CGGN8(C/A)GG).Analysevande
dubbelmutant (amyRinuR) onthulde dat de twee transcriptiefactoren
hoogstwaarschijnlijk onafhankelijk van elkaar functioneren. Hoe de InuR en AmyR
transcriptiefactoren hun doelgenen bepalen en wat de specificiteit van de binding
veroorzaaktiseeninteressantonderwerpvoorverderonderzoek.
OnderdeinulinolytischegeneninA.nigerhebbenwehetinuEgengeïdentificeerd
alshetsterkstgeïnduceerdegenindeaanwezigheidvaninulineensucrose.InHoofdstuk
8 presenteren we, gebruikmakend van de inuE promoter en twee reporter genen (racA
G12V en Groen Fluorescerend Protein (GFP), een nieuwe screeningsmethode voor de
isolatievanmutantendiebetrokkenzijnbijinulineofsucrosesignalering.Dezegenetische
screen, gevolgd door de identificatie van de gemuteerde genen, zou de identificatie
mogelijk moeten maken van eiwitten die inducer moleculen genereren, transporteren of
registreren.Ookzoudengenendiecoderenvooreiwittendiebetrokkenzijnbijdeactivatie
van de InuR transcriptiefactor geïdentificeerd kunnen worden. Deze methode kan in het
algemeenwordengebruiktvoordeidentificatievantranscriptionfactormutanteninA.niger
en wellicht ook in andere schimmels. Tot slot wordt aan het eind van hoofdstuk 8,
gebaseerd op de laatste vier hoofdstukken (5 t/m 8), een speculatief model gepresenteerd
waarindemogelijkefunctievanverschillendeeiwittendiebetrokkenzijnbijdeafbraaken
opnamevaninulineeninulineafbraakproductendoorA.nigerwordtbeschreven.
