Site-selective modification of aminoglycoside antibiotics for therapeutic and diagnostic
applications
Warszawik, Eliza
DOI:
10.33612/diss.154330217
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from
it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Warszawik, E. (2021). Site-selective modification of aminoglycoside antibiotics for therapeutic and
diagnostic applications. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.154330217
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Chapter 6
6.1 ENGLISH SUMMARY
Aminoglycosides are a potent class of broad-spectrum bactericidal antibiotics, which have been in use for the last few decades. This class of drugs is especially valuable in the treatment of bacterial infections caused by aerobic Gram-negative pathogens. As highly water-soluble, small organic molecules with multiple sites accessible for modification, aminoglycosides are promising starting building blocks for the development of new leads. Aminoglycosides and their derivatives showed great potential for the development of new compounds with antimicrobial activity against resistant bacteria. However, the further use of aminoglycosides and the development of new leads requires a better understanding of the drug modes of action and their derivatives and getting more insights into mechanisms of bacterial resistance.
In Chapter 1, the structures, mode of action, and currently known mechanisms of bacterial resistance to aminoglycosides are described. Moreover, some of the most potent strategies to overcome bacterial resistance to aminoglycosides are reviewed.
Chapter 2 describes the design and chemical modification of the aminoglycoside neomycin B to improve
its antimicrobial function against resistant bacteria. Applying chemo- and regioselective modification methods in 5 synthetic steps, short alkyl chains (methyl, propyl, hexyl) or di-alkyl (di-methyl) moieties were introduced into the 3-N position of the important 2-DOS ring. The new derivatives were tested against the Gram-negative bacterium, Escherichia coli (E. coli) and E. coli carrying the AAC(3)IIIa resistance enzyme. We found that all developed derivatives showed reduced activity against the non-resistant strain in comparison to unmodified neomycin B. We hypothesize that this reduction of activity might be due to reduced binding affinity to the ribosomal binding site. However, we observed that the introduction of such relatively simple structural alternation (N-alkylation) can restore the antimicrobial function of aminoglycosides against resistant strains. While the activity of neomycin B was completely diminished, the newly developed 3-N alkylated derivatives showed significantly improved antimicrobial activity against the strain carrying the AAC(3)IIIa resistance. Further, we crystalized and resolved the structure of the previously unknown AAC(3)IIIa enzyme, the first member of the AAC(3)IIIa family, in complex with its natural substrates and the newly developed, most potent derivative 3-N-methyl neomycin B. We proposed the mechanism of enzymatic modification catalyzed by the enzyme in the presence of the substrate neomycin B. The examination of the binding mode of neomycin B and the newly developed 3-N-methylated derivative showed that the compound binds to the enzyme in a changed configuration. In particular, the ring II, carrying the methyl residue, is mislocated. Being too far from the active centre of the enzyme, the acetylation at the 3-C position cannot take place, therefore, the bacterial resistance can be overcome.
Summary
207
6
To inhibit the future development of new mechanisms of bacterial resistance to aminoglycosides, in Chapter 3, we aimed to achieve spatial and temporal control over aminoglycoside activity by transforming the drug to a temporarily inactivated derivative, which can be re-activated by light. In this proof-of-concept study, neomycin B was protected with the photocleavable protecting group dimethoxy-o-nitrobenzyl, which reduced the activity of neomycin B eight-fold. Upon irradiation with light at 365 nm, the photoprotecting group was irreversibly cleaved and the activity of the antibiotics was fully restored. As the exposure to the inactivated drug would not cause environmental pressure on bacteria, the presented approach seems to be a very promising strategy in overcoming the environmental build-up of antimicrobial resistance against aminoglycosides.
In Chapter 4, we synthesised a library of fluorescently labelled aminoglycosides and investigated their photophysical properties, structure related function, activity and the uptake in E. coli. Various red absorbing (cyanine 5; sulfonated cyanine 5 and ATTO647N) and green-absorbing (rhodamine B derivatives) fluorescent dyes were attached to the antibiotic scaffold at positions 3-C in neomycin B, paromomycin, amikacin, neamine, in position 6’-N (tobramycin) and in position 6’’’-N (paromomycin), which led to reduction of the antimicrobial activity of the antibiotics. The developed compounds were further applied to image E. coli. We found that properties of the fluorophore (charge and hydrophobicity), as well as, properties of the aminoglycoside scaffold (core size, the number of amine groups attached and position of dye attachment) significantly influence the uptake efficiency of different conjugates. In particular, the presence of negative charges in the fluorophore structure disturbed the interactions of the conjugate with bacterial membranes, while conjugates lacking negative charges at the core were efficiently taken up into the bacterial cytosol. For the series carrying the same fluorescent dye accumulation of the conjugates depended on the number of the amine groups attached to the antibiotic scaffold. Moreover, we showed that upon irradiation of bacteria treated with the selected probe Neomycin B-RhoB, the cytosolic accumulation of the compound increased in a laser power dependant manner. The increased uptake of the conjugate was caused by membrane leakage and eventually led to bacterial cell death, which might further expand the applicability of this probe as photosynthesizer for photodynamic therapy. Those findings may also help in the future design of new derivatives combating Gram-negative species. The excellent photophysical properties, ability to interact with bacterial membranes and lack of antimicrobial activity make the developed conjugates good candidates as probes for bacterial imaging via fluorescence methods.
In Chapter 5, we applied the selected conjugates developed in Chapter 4 and additionally synthesized
Neomycin B-Cy5 as probes for imaging of various Gram-negative and Gram-positive bacteria. The probes
showed stability at physiological conditions, lacked antimicrobial activity against E. coli and S. aureus, and were non-toxic to mammalian cells. With minimal staining procedure and short incubation times (within
minutes) the probes enable rapid identification of Gram-negative bacteria in-vitro. High intensities of fluorescence signals were obtained even when applied at nanomolar concentrations. The fluorescently labelled aminoglycosides allowed specific identification of E. coli infections in -vivo in mouse models rendering the developed fluorescent aminoglycoside conjugates very promising tracers for in-situ diagnostics of infections induced by Gram-negative bacteria.
6.2 SAMENVATTING
Aminoglycosiden beschrijven een krachtige klasse binnen een breed spectrum van antibiotica, welke in de afgelopen decennia veelvuldig zijn gebruikt. Deze klasse antibiotica is vooral van grote waarde in de bestrijding van bacteriële infecties, veroorzaakt door aerobe, gramnegatieve pathogenen. Aminoglycosiden zijn zeer goed in water oplosbare, kleine organische moleculen met meerdere bindingsplaatsen, gereed voor modificaties, wat maakt dat zij veelbelovende bouwblokken zijn voor de ontwikkeling van nieuwe ‘leads’. Aminoglycosiden en derivaten daarvan hebben veel potentie laten zien in de ontwikkeling van nieuwe verbindingen met antimicrobiële activiteit tegen resistente bacteriën. Desalniettemin, het toekomstig gebruik van aminoglycosiden en de ontwikkeling van nieuwe ‘leads’ vereist een dieper begrip van het werkingsmechanisme van de antimicrobiële stof en haar derivaten, alsmede meer inzicht in de mechanismen van bacteriële resistentie.
In Hoofdstuk 1 worden de structuren en werkingsmechanismen van, evenals de huidig bekende mechanismen van bacteriële resistentie tegen aminoglycosiden uiteengezet.
Hoofdstuk 2 beschrijft het ontwerp en chemische modificatie van het aminoglycoside neomycine B om de
werking tegen antimicrobiële resistentie te verbeteren. Door het toepassen van chemo- en regioselectieve modificatie methoden in vijf synthetische stappen zijn korte alkyl ketens (methyl, propyl, hexyl) of di-alkyl (di-methyl) delen geïntroduceerd op de 3-N positie van de belangrijke 2-DOS ring. De nieuw gevormde derivaten werden getest tegen de gramnegatieve bacteriën Escherichia coli (E. coli) en het AAC(3)IIIa resistente enzym dragende E. coli. Alle ontwikkelde derivaten lieten een gereduceerde activiteit tegen de non-resistente stam zien, in vergelijking met ongemodificeerd neomycine B. Wij stellen de hypothese op dat deze reductie in activiteit zou kunnen komen door de gereduceerde bindingaffiniteit met de bindingsplaats in het ribosoom. Echter, observeerden we dat de introductie van zulke relatief simpele structurele wijzigingen (N-alkylering) de antimicrobiële functie van de aminoglycosiden tegen resistente stammen kan herstellen. Terwijl de activiteit van neomycine B compleet teniet was gedaan, lieten de nieuw ontwikkelde 3-N ge-akyleerde derivaten een significante verbetering zien in antimicrobiële activiteit tegen de stam die het AAC(3)IIIa resistente enzym droeg. Daarnaast hebben we de structuur van het
Summary
209
6
voorheen onbekende AAC(3)IIIa enzym, het eerste lid van de AAC(3)IIIa familie, in complex met zijn natuurlijke substraten en het nieuw ontwikkelde, krachtigste derivaat 3-N-methyl-neomycine B gekristalliseerd en opgelost. Wij hebben hier het mechanisme van enzymatische modificatie, gekatalyseerd door het enzym in het bijzijn van het substraat neomycine B voorgesteld. Het toetsen van het bindingsmechanisme van neomycine B en het nieuw ontwikkelde 3-N-gemethyleerde derivaat lieten zien dat de verbinding bindt aan het enzym in een aangepaste configuratie. Meer specifiek, de ring II, welke het methyl residu draagt, is misplaatst. Door de grote afstand tot het actieve centrum van het enzym kan de acetylering op de 3-C positie niet plaatsvinden, met als gevolg dat de bacteriële resistentie kan worden overkomen.
Om verdere ontwikkelingen van nieuwe mechanismen voor bacteriële resistentie tegen aminoglycosiden tegen te gaan, hebben we in Hoofdstuk 3 gedoeld op het bereiken van ruimtelijke en tijdelijke controle over aminoglycoside activiteit door de stof te transformeren in een tijdelijk, inactief derivaat, welke gereactiveerd kan worden door licht. In deze ‘proof-of-concept’ studie werd neomycine B beschermd met het door licht splitsbare, beschermende dimethoxy-o-nitrobenzyl, welke de activiteit van neomycine B in achtvoud reduceert. Na bestraling met licht van 365 nm werd de lichtbeschermende groep irreversibel gesplitst en de werd de activiteit van het antibioticum volledig hersteld. Doordat blootstelling van de bacteriën aan de geïnactiveerde stof geen omgevingsstressfactoren veroorzaken, lijkt de hier gepresenteerde aanpak een erg veelbelovende strategie in het overkomen van omgevingsfactor-gerelateerde opbouw van antimicrobiële resistentie tegen aminoglycosiden.
In Hoofdstuk 4 hebben we een groot aantal fluorescent gelabelde aminoglycosiden gesynthetiseerd en hun fotofysische eigenschappen, structuur-gerelateerde functie, activiteit, en opname in E. coli bestudeerd. Verscheidene, rood-absorberende (Cyanine 5; gesulfoneerd Cyanine 5 en ATTO647N) en groen-absorberende (Rhodamine B derivaten) fluorescente stoffen werden gehecht aan het antibacteriële netwerk op positie 3-C in neomycine B, paromomycine, amikacine, neamine, in positie 6’-N (tobramycine) en in positie 6’’’-N (paromomycine), wat leidde tot een afname in antimicrobiële activiteit van de antibiotica. De ontwikkelde stoffen werden verder toegepast om E. coli te visualiseren. We observeerden dat de eigenschappen van het fluorofoor (lading en hydrophobiciteit), alsmede de eigenschappen van het aminoglycoside netwerk (kern grootte, aantal gehechte aminegroepen en positie van gehechte kleurstof) de opname efficiëntie van verscheidene conjugaten significant beïnvloedden. In het bijzonder, de aanwezigheid van negatieve ladingen in de structuur van het fluorofoor verstoorde de interactie van het conjugaat met de bacteriële membranen, terwijl conjugaten, welke geen negatieve ladingen droegen in de kern, efficiënt werden opgenomen in het bacteriële cytosol. Voor de groep die dezelfde fluorescente stof droegen hing de accumulatie van de conjugaten af van het aantal aminegroepen gehecht aan het antibacteriële netwerk. Bovendien, hebben we laten zien dat na bestraling van bacteriën behandeld met
de geselecteerde derivaat Neomycine B-RhoB, de accumulatie van de stof in het cytosol verhoogde, direct correleerbaar aan de kracht van de laser. De verhoogde opname van het conjugaat werd veroorzaakt door membraanlekken en leidde uiteindelijk tot celdood. Dit zou de toepasbaarheid van deze sonde verder kunnen verbreden, als fotosensitizer in photodynamische therapie. Deze bevindingen zouden ook kunnen bijdragen in de toekomstige ontwikkeling van nieuwe derivaten gericht tegen gramnegatieve soorten. De excellente, fotofysische eigenschappen, vermogen om interactie aan te gaan met bacteriële membranen, en de afwezigheid van antimicrobiële activiteit maken deze ontwikkelde conjugaten uitstekende kandidaten als sondes voor het visualiseren van bacteriën via fluorescente methoden.
In Hoofdstuk 5 hebben we de in Hoofdstuk 4 geselecteerde conjugaten toegepast en, hieraan toevoegend, hebben we Neomycine B-Cy5 gesynthetiseerd als sondes voor het visualiseren van verscheidene gramnegatieve en grampositieve bacteriën. De sondes lieten stabiliteit zien onder fysiologische condities, vertoonden geen antimicrobiële activiteit tegen E. coli en S. aureus, en waren non-toxisch voor zoogdiercellen. Met een minimale kleuringsprocedure en korte incubatie tijden (binnen minuten) maakten de sondes een snelle identificatie van gramnegatieve bacteriën in-vitro mogelijk. Hoge intensiteit van het fluorescente signaal werd verkregen, zelfs na het toevoegen van nanomolaire concentraties. De fluorescent gelabelde aminoglycosiden maakten specifieke identificatie van E. coli infecties in-vivo mogelijk, in muis modellen, wat erop duidt dat deze ontwikkelde, fluorescente aminoglycoside conjugaten zeer veelbelovende klikstoffen kunnen zijn in in-situ diagnostiek bij infecties met gramnegatieve bacteriën.
6.3 STRESZCZENIE
Aminoglikozydy są liczną grupą antybiotyków o slinym działaniu bakteriobójczym i szerokim spektrum działania. Antybiotyki te są w użyciu przez ponad sześćdziesiąt lat i liczne z nich są szczególnie cenne w leczeniu infekcji bakteryjnych wywołanych przez Gram-ujemne bakterie tlenowe. Jako związki organiczne o relatywnie małym rozmiarze, wysokiej rozpuszczalności w wodzie i posiadające wiele grup funkcyjnych, aminoglikozydy są obiecującymi substratami do stworzenia nowych leków. Aminoglikozydy i ich pochodne wykazują ogromny potencjał do budowy nowych związków przeciwdrobnoustrojowych aktywnych przeciwko bakteriom wysokoodpornym na antybiotyki. Jednak dalsze zastosowanie tej grupy leków i ich pochodnych wymaga lepszego zrozumienia sposobu ich działania oraz uzyskania lepszego wglądu w liczne mechanizmy oporności bakteryjnej.
W Rozdziale 1 przedstawione zostały struktury, sposób działania oraz obecnie rozpoznawalne mechanizmy oporności bakteryjnej na aminoglikozydy. Ponadto, opisano wybrane, najbardziej obiecujące ze strategii pozwalających na przezwyciężenie oporności bakteryjnej na aminoglikozydy.
Summary
211
6
Rozdział 2 opisuje chemiczną modyfikację wybranego antybiotyku aminoglikozydowego neomycyny B.
Związek ten został zmodyfikowany w celu poprawy jego działania przeciwdrobnoustrojowego przeciwko Gram-negatywnym bakteriom antybiotykoopornym. Centralny pierścień 2-desoksysteptaminowy (2-DOS), niezwykle ważny dla aktywności tej grupy antybiotyków, został zmodyfikowany w pięciu etapach, stosując
chemo- i regioselektywne metody synthezy organicznej. Grupa aminowa przyłacząnoa do pierscienia 2-DOS została zmodyfikowana poprzez wprowadzenie krótkich łańcuchów alkilowych (grupę metylową,
propylową, heksylową) lub ugrupowania di-alkilowe (di-metylowe). Aktywność nowych pochodnych została przetestowana na wybranych bakteriach Gram-ujemnych, Escherichia coli (E. coli) oraz E. coli, posiadającymi enzym oporności 3-N-acetyltransferazę typu IIIa ((AAC(3)IIIa)). W porównaniu z niemodyfikowaną neomycyną B, wszystkie opracowane pochodne wykazywały zmniejszoną aktywność przeciwko nieopornemu szczepowi. Została postawiona hipoteza, że zmniejszenie aktywności wywodzi się ze zmniejszena powinowactwa wiązania nowych pochodnych do rybosomu.
Zaobserwowano jednak, że wprowadzenie takiej stosunkowo prostej przemiany strukturalnej (łańcucha N-alkilowego) przywróciło działanie antybakteryjne aminoglikozydów przeciwko szczepowi opornemu.
Podczas gdy niezmodyfikowana neomycyna B była całkowicie nieskuteczna, nowo opracowane 3-N alkilowane pochodne wykazały znacznie zwiększoną aktywność bakteriobójczą przeciwko szczepowi
niosącemu oporność wywołaną przez obecność enzymu AAC (3)IIIa. Ponadto, struktura tego wcześniej nieznanego enzymu została skrystalizowana i rozwiązana w kompleksie z jego naturalnymi substratami i nowo opracowaną, najaktywniejszą pochodną 3-N-metylo-neomycyną B. Został zaproponowany mechanizm modyfikacji enzymatycznej katalizowanej przez ten enzym w obecności substratu neomycyny B. Porównanie trybu wiązania neomycyny B i 3-N-metylowanej neomycyny B z enzymem pozwoliło zaobserwować, że nowo opracowany związek wiąże się z enzymem w zmienionym trybie. Pierścień II, niosący grupę metylową, jest przemieszczony i będąc zbyt daleko od aktywnego centrum enzymu, acetylacja w pozycji 3-C nie może mieć miejsca. W związku z tym, nowy związek pozostaje aktywny przeciwko bakteriom odpornym.
Aby zahamować przyszły rozwój nowych mechanizmów oporności bakteryjnej na aminoglikozydy, w Rozdziale 3 podjelismy próbę uzyskania kontroli nad aktywnością aminoglikozydów w przestrzeni i czasie. Poprzez przekształcenie leku w tymczasowo dezaktywowaną pochodną, którą można ponownie aktywować światłem. Neomycynę B zabezpieczono światłoczułą grupą zabezpieczającą dimetoksy-orto-nitrobenzylową, co zmniejszyło aktywność neomycyny B ośmiokrotnie. Po napromieniowaniu światłem UV o długości fali 365 nanometrów, grupa fotozabezpieczająca została nieodwracalnie usunięta i aktywność antybiotyków została w pełni przywrócona. Ponieważ narażenie na nieaktywny lek nie powoduje presji środowiskowej na bakterie, przedstawione podejście wydaje się być bardzo obiecującą strategią
w przezwyciężaniu narastającego w środowisku oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe przeciwko aminoglikozydom.
W Rozdziale 4 zsyntezowano szereg fluorescencyjnie oznakowanych aminoglikozydów oraz zbadanano ich właściwości fotofizyczne, funkcję związaną ze strukturą, aktywność oraz sposób, w jaki związki te oddziałują z Gram-ujemnymi bakterimi E. coli. Barwniki fluorescencyjne absorbujące w pasmie czerwonym (cyjanina 5; sulfonowana cyjanina 5 oraz ATTO647N) i absorbujące w paśmie zielonym (pochodne rodaminy B) zostały przyłączone do struktury antybiotyku w pozycjach 3-C- (w neomycynie B; paromomycynie, amikacynie, neaminie); 6’-N (w tobramycynie) lub 6 ’’’- N (w paromomycynie), co we wszystkichh przypadkach zablokowało aktywność bakteriobójczą antybiotyków. Opracowane związki zastosowano następnie do obrazowania E. coli. Okazało się, że właściwości fluoroforu (ładunek, hydrofobowość), a także własciwości aminoglikozydu (liczba pierścieni, liczba przyłączonych grup aminowych i pozycja przyłączenia barwnika) znacząco wpływają na efektywność odziaływania pochodnych z bakteriami. W szczególności, obecność ładunków ujemnych w strukturze fluoroforu zaburzała interakcje koniugatu z błonami bakteryjnymi, podczas gdy pochodne pozbawione ładunków ujemnych w rdzeniu fluoroforu były skutecznie internalizowane do cytozolu bakteryjnego. Dla serii związków z tym samym barwnikiem fluorescencyjnym przyłączonym do różnych antybiotyków, efektywność internalizacji pochodnych do cytozolu zależała od liczby grup aminowych obecnych w strukturze aminoglikozydu.
Odkrycia te mogą pomóc w przyszłym zaprojektowaniu nowych pochodnych zwalczające gatunki Gram-ujemne. Doskonałe właściwości fotofizyczne, zdolność do interakcji z błonami bakteryjnymi i brak aktywności przeciwbakteryjnych sprawiają, że opracowane koniugaty są również dobrymi kandydatami do zatosowania jako barwniki do obrazowania bakteryjnego metodami mikroskopii fluorescencyjnej.
Ponadto wykazano, że po napromieniowaniu bakterii, które były wystawione na działanie wybranym, nieaktywnym związkiem (konigatem neomycyny B z rodaminą B) swiatłem o długosci fali 560 nm, akumulacja cytozolowa związku wzrosła w sposób zależny od mocy naświetlania lasera. Zwiększona akumulacja związku w cytozolu była spowodowana zwiększoną przepuszczalnością błony bakteryjnej, co ostatecznie doprowadziło do śmierci komórek bakteryjnych. Te wyniki mogą dodatkowo rozszerzyć zastosowanie tego związku jako fotosyntezatora do terapii fotodynamicznej.
W Rozdziale 5, wybrane fluorescencyjnie odnaczone związki opracowane w Rozdziale 4, oraz dodatkowo zsyntetyzowany koniugat neomycyny B z cyjaniną 5 zostały zastosowane do obrazowania różnych bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Po wykazaniu stabilności w warunkach fizjologicznych, braku aktywności przeciwbakteryjnej przeciwko E. coli i S. aureus i braku toksyczności dla komórek eukariotycznych. Przy minimalnej procedurze barwienia i krótkich czasach inkubacji (w ciągu kilku minut) umożliwiają szybką identyfikację bakterii Gram-ujemnych in vitro. Wysokie natężenia sygnałów
Summary
213
6
fluorescencyjnych uzyskano nawet przy zastosowaniu w stężeniach nanomolarnych. Fluorescencyjnie znakowane aminoglikozydy umożliwiły swoistą identyfikację zakażeń E. coli in vivo w modelach myszy, dzięki czemu opracowane fluorescencyjne koniugaty aminoglikozydów są bardzo obiecującymi wskaźnikami do diagnostyki in situ infekcji wywołanych przez bakterie Gram-ujemne.
