University of Groningen Novel therapeutic targets for the treatment of asthma van den Berg, M.P.M.

(1)

Novel therapeutic targets for the treatment of asthma

van den Berg, M.P.M.

DOI:

10.33612/diss.143959597

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2020

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

van den Berg, M. P. M. (2020). Novel therapeutic targets for the treatment of asthma: Focus on Arginase and TRPA1. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.143959597

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

548933-L-sub01-bw-vdBerg 548933-L-sub01-bw-vdBerg 548933-L-sub01-bw-vdBerg 548933-L-sub01-bw-vdBerg Processed on: 14-10-2020 Processed on: 14-10-2020 Processed on: 14-10-2020

(3)

Processed on: 14-10-2020 PDF page: 144PDF page: 144PDF page: 144PDF page: 144

144

Astma is een chronische luchtwegaandoening die een wereldwijd gezondheidsprobleem vormt. De ziekte wordt gekarakteriseerd door luchtweg-hyperreactiviteit, aanvallen van benauwdheid, luchtwegontsteking en luchtwegremodeling. Mensen van alle leeftijden kunnen lijden aan astma, al komt de ziekte meer voor onder kinderen. De ziekte is in de meeste landen verantwoordelijk voor minder dan 1% van de totale sterfte; het merendeel van deze doden is te voorkomen door juiste medische behandeling en het voorkomen van exacerbaties. De ziektelast onder zowel volwassenen als kinderen is daarentegen erg groot en heeft een grote impact op de maatschappij, economie, gezondheidszorg en - nog belangrijker - de kwaliteit van leven van astmapatiënten. De behandeling van astma is gericht op acute symptoomverlichting, het onder controle houden van symptomen en voorkomen van exacerbaties. Door de verbreding van onze kennis over de pathologie van astma en de realisatie van het bestaan van meerdere astmafenotypen en -endotypen, heeft er een verschuiving plaatsgevonden van een universele behandelwijze voor astma naar therapie op maat. Er is echter een substantiële groep astmapatiënten voor wie de huidige behandelingsopties niet afdoende effectief zijn. Patiënten met een Th2-lage astmavariant zijn dikwijls ongevoelig voor behandeling met corticosteroïden en andere ontstekingsremmende middelen. Voor behandelingsresistente patiënten met een Th2-hoge astmavariant zijn biologicals beschikbaar, gericht tegen bijvoorbeeld immunoglobuline E (IgE), de interleukine (IL)-4 receptor of IL-5/IL-5-receptoren. De effectiviteit van deze nieuwe biologicals is echter in veel patiënten niet optimaal, wat de noodzaak voor nieuwe therapieën voor astma onderschrijft. In de studies gepresenteerd in dit proefschrift zijn twee potentiële therapeutische aangrijpingspunten bestudeerd: arginase en TRPA1. Hierbij is de werking van nieuwe antagonisten gericht tegen deze twee aangrijpingspunten onderzocht. Arginase als een potentieel doelwit voor geneesmiddelen tegen astma

Arginase is het laatste enzym in de ureumcyclus in de lever en katalyseert de vorming van ureum en ւ-ornithine uit ւ-arginine. Metabolisme van ւ-ornithine resulteert in de vorming van ւ-proline en polyaminen, die betrokken zijn bij de aanmaak van respectievelijk collageen en bij celproliferatie en zo betrokken zouden kunnen zijn bij de luchtwegremodeling die plaats vindt bij astma. Arginase expressie is verhoogd bij astma, mede onder de invloed van de Th2-cytokinen IL-4 en IL-13, of door transforming growth factor (TGF)- β. Arginase draagt anderzijds bij aan astmapathofysiologie door het verlagen van de beschikbare hoeveelheid ւ-arginine, dat als substraat dient voor de vorming van stikstofmonoxide (NO) en ւ-citrulline door NO synthase (NOS). Door zijn bronchusverwijdende en ontstekingsremmende werking speelt NO geproduceerd door constitutief NOS (cNOS) in luchtwegepitheel en non-adrenerge, non-cholinerge inhiberende zenuwvezels een beschermende rol in de luchtwegen. Bij allergisch astma resulteert allergeenblootstelling in een tekort aan bronchusverwijdend en ontstekingsremmend NO, wat onder andere ten grondslag ligt aan de inductie van allergeen-geïnduceerde acute hyperreactiviteit na de vroege astmatische respons en luchtwegontsteking na de late astmatische respons. In 2002 toonde onze

(4)

145

onderzoeksgroep aan dat deze allergeen-geïnduceerde vermindering in cNOS-afhankelijke NO veroorzaakt wordt door een verhoogde arginase activiteit. Met behulp van perfusie-experimenten op trachea’s van allergische cavia’s, werd aangetoond dat de allergeen-geïnduceerde acute hyperreactiviteit volledig kon worden geremd door middel van farmacologische arginaseremming. Het beschermende effect van arginaseremming kon worden opgeheven door gelijktijdige incubatie met een NOS-antagonist. In hoofdstuk 2 tonen we aan dat ditzelfde mechanisme ook opgaat voor het ex vivo longplakjes model dat wordt gebruikt voor de valorisatie van onze nieuwe arginaseremmers. De proof-of-concept studie voor arginaseremmers als potentiële behandeling voor allergisch astma werd voor het eerst gepubliceerd in 2008. In deze studie toonde onze onderzoeksgroep aan dat inhalatie van de arginaseremmer 2(S)-amino-6-boronohexanoic acid (ABH) leidt tot een verlaagde allergeengevoeligheid in de luchtwegen, beschermt tegen de allergeen-geïnduceerde vroege en late astmatische reacties én de acute luchtweghyperreactiviteit na deze reacties, en bovendien de luchtwegontsteking vermindert. Ook uit bevindingen bij astmapatiënten blijkt een aannemelijke rol voor arginase in hun ziekte. In combinatie met de associatie tussen arginase 1 en arginase 2 genpolymorfismen en astma, de ernst van astma en de bronchusverwijder respons, leiden bovengenoemde bevindingen ertoe dat de interesse in arginase als mogelijk aangrijpingspunt voor geneesmiddelen bij de behandeling van allergisch astma werd gewekt.

Huidige status van arginaseremmers

Tot op heden zijn er geen arginaseremmers beschikbaar voor klinisch gebruik. De referentiestoffen ABH, Nω_{-hydroxy-nor-Arginine (nor-NOHA) en}

S-(2-boronoethyl)-ւ-cysteine (BEC) worden regelmatig gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, maar vertonen slechte farmacologische profielen in vivo en zijn om deze reden niet geschikt voor klinische toepassingen. Omdat arginase een belangrijke rol blijkt te spelen in verscheidene medische aandoeningen, waaronder longziekten, cardiovasculaire aandoeningen, reumatoïde artritis, diabetes en kanker, is de interesse in arginase als aangrijpingspunt voor geneesmiddelen toegenomen. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van meerdere gepatenteerde arginaseremmers, waaronder de SHK-serie die ontwikkeld is door de basiseenheid Drug Design (Rijksuniversiteit Groningen) en waarvan de functionaliteit wordt geëvalueerd in hoofdstuk 2. De nieuwe arginaseremmers SHK242 en SHK277 bleken effectieve remmers van zowel het recombinante arginase 1 als arginase 2 in

vitro, van de allergeen-geïnduceerde luchtwegvernauwing in cavia longplakjes ex vivo en van het ontstaan van de vroege en late astmatische reacties in een in vivo

cavia model van acute allergisch astma. De meeste gepatenteerde arginaseremmers, waaronder ook SHK242 en SHK277, bevinden zich nog in een preklinische fase. Tot op heden heeft slechts één arginaseremmer, INCB001158, fase-I/II-onderzoek bereikt. Dit is echter voor de toepassing in kankervormen die gekarakteriseerd worden door myeloïde suppressorcellen die arginase uitscheiden (o.a. darmkanker, niet-kleincellige longkanker) en niet voor astma.

(5)

146

Dat een arginaseremmer effectief blijkt in een in vitro-model, betekent niet per definitie dat deze net zo effectief is in meer complexe weefselmodellen die gebruikt worden voor ex vivo en in vivo studies. Dit laten we zien in hoofdstuk 2, waarin we de

in vitro- en ex vivo-effectiviteit van de referentie arginaseremmer ABH en de nieuwe

recent gepubliceerde en gepatenteerde Mars-verbinding met elkaar vergelijken. De bevindingen uit dit hoofdstuk benadrukken belangrijke verschillen in gedrag tussen in

vitro remming van het enzym in de reageerbuis enerzijds en effectiviteit in ex vivo en in vivo modellen anderzijds, waarbij weefselpenetratie en celopname van de actieve

verbinding een grote rol spelen. Hoewel de Marsverbinding namelijk effectiever blijkt dan ABH in het remmen van recombinante arginases in vitro, beschermt het minder goed tegen allergeen-geïnduceerde bronchoconstrictie in het ex vivo cavia longplakjesmodel. Wat betreft de bescherming tegen allergeen-geïnduceerde bronchoconstrictie ex vivo en in vivo vertonen de nieuwe arginaseremmers SHK242 en SHK277 tenminste een vergelijkbare effectiviteit met ABH. Verder onderzoek naar de farmacokinetische eigenschappen van SHK242 en SHK277, en hun effectiviteit in chronische astmamodellen en humane longplakjes moet nog worden verricht. De initiële resultaten met deze chemische verbindingen zijn echter veelbelovend voor de potentiële toepassing van arginaseremmers voor de behandeling van astma in de toekomst.

Een mogelijke zorg rondom het gebruik van arginaseremmers is het risico op schadelijke bijwerkingen, met name met betrekking tot ammoniadetoxificatie in de lever. Uit onderzoeken in diermodellen van atherosclerose en hypertensie is deze bijwerking echter niet naar voren gekomen, zowel na kortdurende als na langdurende systemische behandeling met arginaseremmers. Het uitblijven van deze bijwerking kan wellicht worden verklaard doordat de arginase expressie in de lever substantieel hoger is dan de expressie in andere organen, waaronder bloedvaten. Blijkbaar is de lage concentratie arginaseremmer die na systemische behandeling in de circulatie terechtkomt daardoor wel in staat om vasculaire functies te verbeteren, maar niet toereikend om een substantiële verlaging van de arginase activiteit in de lever te bewerkstelligen. Daarnaast worden astma en andere chronische longziekten in de regel lokaal behandeld door middel van inhalatie, wat de kans op systemische bijwerkingen nog verder verlaagt. Lokale behandeling heeft het voordeel dat lagere medicatiedoses kunnen worden gebruikt om de symptomen te verlichten in vergelijking met systemische behandeling. Aangezien NO een belangrijke rol speelt in de werking van vasculair endotheel, behoren veranderingen in het cardiovasculaire systeem tot de mogelijke bijwerkingen van het gebruik van arginase-remmers en verdienen daarom extra aandacht wanneer de veiligheid van arginase-remmers wordt geëvalueerd.

In diermodellen van astma en COPD leidt zowel systemische als lokale behandeling met arginaseremmers tot verhoging van de biologische beschikbaarheid van ւ-arginine en vermindering van symptomen. In hoofdstuk 3 beschrijven we dat veranderingen in ʟ-arginine homeostase, door veranderde arginase activiteit, NOS en asymmetrisch dimethylarginine (ADMA) activiteit en expressie, een belangrijke rol lijken te spelen bij verschillende comorbiditeiten van astma en COPD. Astma- en COPD-patiënten lijden

(6)

147

vaak namelijk niet alleen aan hun chronische longziekte, maar ook aan het optreden van diverse comorbiditeiten, zoals allergische dermatitis en rhinitis, en obstructief slaapapneu-syndroom bij astma en cardiovasculaire en cerebrovasculaire aandoeningen, longkanker en diabetes bij COPD. Bij zowel astma als COPD kan de aanwezigheid van comorbiditeiten de ziekteprogressie en levenskwaliteit van patiënten sterk beïnvloeden. Nader onderzoek moet uitwijzen of: 1) lokale veranderingen in het ʟ-argininemetabolisme in de longen kunnen bijdragen aan systemische comorbiditeiten in andere organen; 2) of de ʟ-arginine-onbalans als gevolg van systemische comorbiditeiten de ernst van astma en COPD kan beïnvloeden; en 3) of behandeling van luchtwegaandoeningen met een arginaseremmer ook leidt tot verlichting van symptomen die veroorzaakt worden door comorbiditeiten. Eerder ontdekten we dat inhalatie van de arginaseremmer ABH niet alleen luchtwegontsteking en -remodeling, maar ook rechterventrikelhypertrofie vermindert in een caviamodel van COPD. Bovendien resulteerde een verlaging van de circulerende ʟ-argininespiegels in verhoogde acute hyperreactiviteit in een muismodel van allergisch astma, en kan bij astmapatiënten een verband worden gevonden tussen systemische arginase-activiteit, plasma ʟ-arginine en longfunctie. Deze bevindingen indiceren dat er inderdaad een mogelijk verband bestaat tussen de effecten van lokale en systemische homeostase, en dat het lokaal herstellen van de ʟ-arginine-balans het bijkomend voordeel zou kunnen hebben van het verminderen van gelijktijdig optredende symptomen in andere organen.

Arginase 1 versus arginase 2 en de noodzaak voor iso-enzym-selectieve arginaser-emmers

De meeste organismen, waaronder de mens, brengen twee isovormen van arginase tot expressie, arginase 1 in het cytosol en arginase 2 in de mitochondria. De twee arginases worden gecodeerd door verschillende genen, die op verschillende chromosomen liggen, en komen differentieel tot expressie in het lichaam. Zowel arginase 1 als arginase 2 spelen een rol in ʟ-argininemetabolisme en in vitro lijken de twee enzymen een zo goed als identieke activiteit te bezitten. Of hun in vivo-rollen ook overlap vertonen is grotendeels onbekend. In zowel mensen als muizen resulteert deficiëntie van één van de arginase enzymen in hyperargininemie. Arginase 1-deficiënte muizen ontwikkelen hyperammonemie en sterven kort na de geboorte, terwijl arginase 2-deficiënte muizen slechts een milde vorm van hypertensie vertonen op een leeftijd van 8 tot 10 weken. Deze opvallende fenotypische verschillen wijzen op differentiële in plaats van vergelijkbare rollen voor de twee arginase enzymen. In macrofagen worden de twee arginase enzymen inderdaad verschillend geïnduceerd, afhankelijk van het fenotype van de cel; arginase 1 is een marker voor M2-macrofagen, terwijl arginase 2 geassocieerd wordt met M1-macrofagen.

Arginase 1 en arginase 2 lijken echter niet per definitie een differentiële rol te hebben. Er zijn namelijk bevindingen dat mensen die lijden aan autosomale recessieve arginase 1-deficiëntie, een verhoogde arginase 2 expressie vertonen. Met een ruw geschatte incidentie van 1 op 950.000 levendgeborenen kan arginase 1-deficiëntie

(7)

148

getypeerd worden als een zeldzame ziekte. Arginase 1-deficiënte patiënten vertonen hyperargininemie met spastische paraparese, progressieve neurologische en intellectuele beperkingen, aanhoudende groeivertraging en infrequente episodes van hyperammonemie. Extraneurologische symptomen van de ziekte zijn zeldzaam en komen voornamelijk voor in de lever en het skelet. Symptomen in de lever kunnen variëren van licht hepatocellulair letsel met korte episodes van verhoogde levertransaminasen, tot licht disfunctioneren met stollingsafwijkingen en tot acuut leverfalen. De eerste symptomen die kenbaar worden zijn normaalgesproken neurologisch van aard en treden op bij kinderen in de leeftijd van 2 tot 4 jaar. Strikte dieetinterventie (o.a. eiwitbeperking in combinatie met aanvulling met een mix van essentiële aminozuren vrij van ւ-arginine), ւ- ornithine suppletie en/of het gebruik van NO-wegvangers, kunnen mogelijk verdere neurologische achteruitgang voorkomen en leiden tot gedeeltelijk herstel. Vermoed wordt dat de inductie van arginase 2 de hyperargininemie en hyperammonemie gedeeltelijk tegengaat, wat zou wijzen op de mogelijkheid van partiële compensatie van arginase 1 door arginase 2.

Ook in de long is de mogelijk differentiële betrokkenheid van arginase 1 en arginase 2 nog onduidelijk. Bij astmapatiënten blijkt de expressie van beiden iso-enzymen verhoogd te zijn in luchtwegen en serum. Daarnaast bleek arginase 2 drie uur na allergeenprovocatie al geïnduceerd te worden in een muismodel van allergisch astma, terwijl arginase 1 pas na 18 uur werd geïnduceerd. Opvallend is dat bij vergelijking van inductie van de twee arginase iso-enzymen in verschillende allergisch astmamodellen, die gebruik maken van verschillende antigenen, diersoorten en -stammen, naar voren komt dat voornamelijk arginase 1 wordt geïnduceerd, terwijl arginase 2 niet of slechts in geringe mate wordt geïnduceerd. Daarnaast worden arginase 1 en arginase 2 genpolymorfismen geassocieerd met verschillende aspecten van astma; arginase 1 genpolymorfismen zijn onder andere gelinkt aan de mate van hyperreactiviteit en effectiviteit van β₂ -agonisten en inhalatiecorticosteroïden, terwijl arginase 2 genpolymorfismen gelinkt kunnen worden aan het risico op astma, mate van luchtwegobstructie ernst van hyperreactiviteit en β₂-agonist geïnduceerde bronchusverwijding. Deze bevindingen duiden er dus inderdaad op dat de twee arginase enzymen verschillende rollen vervullen in astma. Er zijn aanwijzingen dat inductie van het arginase 1 enzym hoofdzakelijk verantwoordelijk is voor de verhoogde arginase activiteit die gevonden wordt in astmapatiënten. Daarnaast indiceren verschillende dierstudies dat arginase 1 betrokken is bij astma via substraatcompetitie met NOS, en correleert de inductie van arginase 1 over de tijd met het ontstaan, de persistentie en de resolutie van acute hyperreactiviteit in reactie op methacholine in een muismodel van IL-13-geïnduceerde astma. De rol van arginase 2 in astma is daarentegen controversiëler, mede omdat er aanwijzingen zijn voor zowel gunstige als nadelige effecten van arginase 2.

Xu en collega’s waren de eersten die stelden dat een verhoogde expressie van arginase 2 gunstige effecten zou kunnen hebben bij astma. In hun onderzoek toonden ze aan dat een verhoogd mitochondriaal ʟ-argininemetabolisme door arginase 2 leidt tot een toename van het oxidatief metabolisme. Hierdoor wordt de pro-inflammatoire

(8)

149

IL-13-gemedieerde signalering geremd, wat leidt tot minder Th2-gemedieerde ontsteking in de long bij astma. Daarnaast vertonen arginase 2-deficiënte muizen een verhoogde mate van luchtwegontsteking als reactie op allergeenprovocatie en verhoogde mestcel-gemedieerde luchtwegvernauwing vergeleken met wildtype dieren. In Hoofdstuk 5 vonden wij een beschermende rol voor arginase 2 in mestcellen, waarbij arginase 2 mestceldifferentiatie naar een allergisch fenotype voorkomt. Dit mechanisme wordt gemedieerd via regulatie van het ʟ-ornithinemetabolisme door arginase 2, en zou ten grondslag kunnen liggen aan het beschermende effect van arginase 2 op mestcel-gemedieerde luchtwegvernauwing in een ex vivo muismodel van luchtwegvernauwing. Arginase katalyseert de omzetting van ʟ-arginine naar ʟ-ornithine, dat door ornithinedecarboxylase verder kan worden gemetaboliseerd tot polyaminen. Van polyaminen is bekend dat ze essentieel zijn voor celgroei en -functie, en er zijn aanwijzingen dat polyaminen, die via omzetting door arginase van ʟ-arginine zijn afgeleid, een rol spelen bij de proliferatie van onder meer endotheelcellen, T - en B-cellen.

Arginase 2-deficiëntie muizen vertonen zowel verhoogde eosinofiele/Th2-gemedieerde luchtwegontsteking als neutrofiele/Th1/Th17-gemedieerde ontsteking. Daarom kan ւ- argininemetabolisme door arginase 2 betrokken zijn bij zowel Th2-gemedieerd als Th1/Th17-gemedieerd astma, wat de betrokkenheid van arginase 2 bij verschillende astmatische fenotypen suggereert. Deze betrokkenheid van arginase 2 kan worden verklaard door zijn rol in het ʟ-ornithinemetabolisme en/of door interacties met iNOS via citroenzuurcyclusactiviteit in de mitochondriën en intracellulair ւ-argininemetabolisme, onafhankelijk van substraatcompetitie. Er wordt verondersteld dat ւ-ornithine gevormd door arginase 2 in de mitochondriën via ornithine-aminotransferase, wordt omgezet tot glutamaat. Glutamaattransaminatie via ornithine-oxaloacetaat leidt vervolgens tot de vorming van aspartaat, dat via argininosuccinaatsynthetase en argininosuccinaatlyase fungeert als bron voor de vorming van ւ-arginine, dat op zijn beurt weer gebruikt wordt door iNOS voor de productie van NO. Veelvoorkomende arginase 2 genpolymorfismen die leiden tot een lagere arginase-activiteit en hoge fractionele uitgeademde NO (F_ENO)-spiegels, bleken gerelateerd te zijn aan een ernstiger astmafenotype. Over het algemeen lijden astmapatiënten met een hoge F_ENO aan een ernstigere astmavariant en hebben ze een hogere kans op het optreden van exacerbaties, dan astmapatiënten met lage F_ENO. Het hoge F_ENO-niveau wordt verondersteld het resultaat te zijn van iNOS-activiteit, zoals geïllustreerd door verhoogde hoeveelheden F_ENO bij iNOS-transgene muizen. Ook is verhoogde iNOS-expressie in luchtwegepitheel van astmapatiënten gekoppeld aan een hoge F_ENO. Naast verhoogde iNOS-expressie bleken F_ENO-hoge astmapatiënten hogere lactaatniveaus in de luchtwegen te hebben en, al lijkt dit contra-intuïtief, verhoogde expressie van arginase 2 in luchtwegepitheel, vergeleken met F_ENO-lage astmapatiënten. Bronchiale iNOS-transgene epitheelcellen hebben een verhoogde lactaatproductie en verminderde oxidatie van glucose, wat suggereert dat iNOS een verschuiving veroorzaakt van oxidatieve naar anaërobe glycolyse. Gelijktijdige inductie van iNOS en arginase 2 in bronchiale epitheelcellen resulteerde nog steeds in

(9)

150

een verhoogde lactaatproductie, maar ook in een toename van oxidatie van glucose. Xu et al. suggereerde dat de verhoogde arginase 2-niveaus het remmende effect van door iNOS geproduceerde NO op het oxidatieve glucosemetabolisme onderdrukken, wat suggereert dat arginase 2, via zijn rol in ւ-argininemetabolisme, gedeeltelijk kan beschermen tegen de nadelige effecten van NO op de mitochondriale respiratie. Echter, veel is nog onbekend over deze complexe metabole rol van arginase 2 en iNOS, en over hoe hun interactie de pathofysiologie van astma beïnvloedt.

Onderzoeken in verschillende diermodellen tonen de betrokkenheid van arginase 1 in luchtweghyperreactiviteit en -ontsteking, en geven aan dat remming van arginase 1 mogelijk een veelbelovende benadering is voor de behandeling van astma. Tot op heden zijn er geen arginase 1-selectieve remmers beschikbaar. Aangezien bovengenoemde bevindingen een beschermende rol voor arginase 2 suggereren, is voorzichtigheid geboden bij het gebruik van niet-iso-enzym-selectieve arginaseremmers bij astmapatiënten. Deze zouden de beschermende effecten van arginase 2 kunnen beïnvloeden, wat mogelijk leidt tot verergering van astmasymptomen in plaats van symptoomverlichting. Tot dusverre toonden onze en andere studies naar het effect van ABH in diermodellen van allergisch astma geen aanwijzingen voor deze mogelijke bijwerkingen, zelfs niet wanneer de arginaseremmer twaalf opeenvolgende weken werd toegediend. Het is mogelijk dat arginase 2, vanwege zijn locatie in de mitochondria, moeilijker te bereiken is voor arginaseremmers dan het cytosolische arginase 1. Bovendien kan het zijn dat het positieve effect van het remmen van arginase 1 simpelweg groter is dan de bijwerkingen veroorzaakt door gelijktijdige arginase 2-remming. Arginase 1-selectieve remmers hebben echter nog steeds de voorkeur voor de behandeling van astma, aangezien ABH arginase 2-activiteit in mestcellen lijkt te onderdrukken. Bovendien zouden arginase 1- en arginase 2-selectieve remmers de studie naar de differentiële rollen van de twee arginase-enzymen enorm helpen, waardoor een beter begrip zou ontstaan van de rol van arginase bij astma.

De ontwikkeling van arginase iso-enzym-specifieke remmers blijkt een uitdagend project. De enzymatisch actieve delen van arginase 1 en arginase 2 vertonen 100% overeenkomst in aminozuursequentie waardoor de vaak gebruikte ontwerpstrategie voor enzymremmers, namelijk het nabootsen van substraatbinding in het actieve deel van het enzym, niet mogelijk is. In een samenwerkingsverband met de basiseenheid Drug Design (Rijksuniversiteit Groningen), dat geen onderdeel uitmaakt van het werk in dit proefschrift, ontwikkelden we een analoog van de C-terminus van humaan arginase 1. Dit synthetische peptide, REGNH, werkt als een allostere arginaseremmer. De C-terminale staart speelt een belangrijke rol bij het behoud van de trimere eiwitsamenstelling van arginase die nodig is voor de katalytische omzetting van ւ-arginine. Eerder werd al aangetoond dat manipulatie van de C-terminale aminozuursamenstelling van arginase 1 (bijv. middels vervanging van Arg-308 door alanine of middels verwijdering van de S-vorm) resulteert in activiteitsverlies onder fysiologische pH-omstandigheden. In ons onderzoek lijkt REGNH zowel arginase 1 als arginase 2 te inhiberen. De allosterische benadering lijkt echter wel een geschikte strategie voor de ontwikkeling van arginase

(10)

151

1- en/of arginase 2-selectieve remmers, aangezien de aminozuursequentie van de C-terminale staart van humaan arginase 1 en arginase 2 geen overlap vertonen. Daarnaast is de peptide homologie van de twee isoenzymen slechts 60%.

TRPA1 als een potentiële behandeling voor astma

Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) is een belangrijke sensor voor schadelijke prikkels en weefselschade. In de luchtwegen dragen TRPA1-kanalen op sensorische neuronen bij aan verschillende luchtwegverschijnselen, zoals bronchoconstrictie, slijmsecretie en de hoestreflex. Daarnaast blijkt TPRA1 in niet-neuronale cellen bij te dragen aan luchtwegontsteking. Veel bekende exogene TRPA1-agonisten kunnen ook astma-aanvallen veroorzaken. Bovendien worden verschillende endogene TRPA1-inducerende stoffen geproduceerd in de longen van astmapatiënten en zijn ze betrokken bij astmapathofysiologie. Verschillende studies, waaronder ons eigen werk in hoofdstuk 5, tonen de betrokkenheid van neuronale TRPA1-kanalen bij astma aan en ook niet-neuronaal TRPA1 wordt verondersteld bij te dragen aan de astmapathofysiologie. Opvallend is dat TRPA1-agonisme op zichzelf niet in staat is om acute hyperreactiviteit of histamine-afgifte te induceren in een caviamodel van allergisch astma. Dit suggereert dat TRPA1-agonisme bijdraagt aan bronchoconstrictie in plaats van het te veroorzaken, wat ook onderschreven wordt door de bevindingen dat TRPA1-antagonisme en -deletie in staat zijn om acute hyperreactiviteit te verminderen.

Veel astmapatiënten lijden aan een verhoogde hoestreflex. TRPA1-kanalen spelen hierin een waarschijnlijke rol, aangezien activering van TRPA1-kanalen resulteert in de activering van bronchopulmonale C-vezels in zowel muis- als rattendiermodellen en in de inductie van hoest bij cavia’s en gezonde vrijwillige proefpersonen. De betrokkenheid van TRPA1 bij zoveel aspecten van de astmapathologie (o.a. hoest, luchtwegontsteking, slijmafscheiding en bronchoconstrictie), maakt het een aantrekkelijk aangrijpingspunt voor astmabehandeling omdat TRPA1-antagonisme luchtwegverwijdende, hoestprikkeldempende en ont s tekingsremmende effecten kan combineren. De aantrekkelijkheid van TRPA1-antagonisten als behandelingsoptie voor astma wordt nog verder benadrukt door het feit dat TRPA1 betrokken blijkt te zijn bij zowel allergisch als niet-allergisch astma. Opvallend is dat de betrokkenheid van door mestcellen tot expressie gebracht TRPA1 lijkt te verschillen per astmafenotype, aangezien mestcellen cruciaal bleken te zijn bij door TRPA1-gemedieerde acute hyperreactiviteit in een muismodel van chemicaliën-geïnduceerd astma met 2,4-tolueendi-isocyanaat, terwijl mestcellen niet werden beïn v loed door TPRA1 antagonisme in een caviamodel voor allergisch astma. Voorzichtigheid is echter geboden bij het verklaren van deze waargenomen verschillen in de betrokkenheid van door mestcellen tot expressie gebracht TRPA1, aangezien ook soort-specifieke verschillen tussen mestcellen een rol kunnen spelen in bovenstaande bevindingen.

(11)

152

Huidige status van TRPA1 antagonisten

De betrokkenheid van TRPA1 bij verschillende ziekten, waaronder verschillende pijnaandoeningen en chronische hoest, maakt TRPA1 een interessant therapeutisch doelwit. Er zijn momenteel geen klinisch goedgekeurde TRPA1-antagonisten. Desalniettemin wordt de mogelijke effectiviteit van TRPA1-remmers voor de behandeling van luchtwegaandoeningen erkend, en er zijn verschillende patenten ingediend voor het gebruik van TRPA1-antagonisten bij deze ziekten. Meerdere studies hebben aangetoond dat TRPA1-antagonisten de symptomen van astma kunnen verlichten. De nieuwe TRPA1-antagonist HC030031 is in staat de late allergische reactie en door acetylcholine veroorzaakte acute hyperreactiviteit te verminderen in knaagdiermodellen van allergisch astma. Daarnaast is HC030031 in staat om de integriteit van de epitheliale barrière te verbeteren in een model van beroepsastma. GRC 17536 verminderde de acute hyperreactiviteit, luchtwegeosinofilie en slijmproductie in een muismodel voor astma en onderdrukte de vroege luchtwegreactiviteit en eosinofieleninfiltratie in een caviamodel van allergisch astma. Daarnaast verminderde CB-625 de late allergische reactie en antigeen-geïnduceerde acute hyperreactiviteit in een schapenmodel van astma. In hoofdstuk 6 presenteren we de nieuwe TRPA1-remmer, BI01305834, die beschermt tegen allergeen-geïnduceerde acute hyperreactiviteit na de vroege allergische reactie, en de ontwikkeling van de vroege en late allergische reactie in een caviamodel van acuut allergisch astma. Daarnaast leidde toediening van BI01305834 tot verminderde allergeen- en histamine geïnduceerde luchtwegvernauwing en tot verlichting van de door allergeen veroorzaakte bronchoconstrictie. Verschillende TRPA1-antagonisten hebben de eerste stadia van klinische ontwikkeling bereikt, voornamelijk voor pijn-gerelateerde aandoeningen. GRC 17536 bereikte fase I/IIa- en fase II-onderzoek voor inhalatiestudies voor respectievelijk milde astma en refractaire chronische hoest. In beide onderzoeken leidde behandeling met GRC 17536 niet tot een verbeterde klinische uitkomst, d.w.z. afname van FEV₁ tijdens de late allergische reactie (astma) of hoestfrequentie (hoest), vergeleken met de placebogroep. Aangezien de resultaten van deze studies tot nog toe niet in de literatuur zijn gepubliceerd, blijft het nog onduidelijk of er aanwijzingen waren voor target engagement.

Er zijn aanwijzingen dat neuronale TRPA1 reageert op koude-stimuli. In tegenstelling tot andere TRP-familieleden, is TRPA1 echter niet betrokken bij de regulering van de lichaamstemperatuur. Het wordt daarom onwaarschijnlijk geacht dat TRPA1-antagonisten de lichaamstemperatuur beïnvloeden, wat ook werd bevestigd in een onderzoek waarbij CB-625 werd toegediend aan gezonde vrijwilligers. BI01305834, de nieuwe TRPA1-antagonist die in dit proefschrift wordt gepresenteerd, vertoont een uitstekende selectiviteit tegen structureel-gerelateerde TRP-kanalen. Kruisreactiviteit met andere TRP-kanalen die betrokken zijn bij lichaamstemperatuurregulatie wordt daarom niet verwacht. Verder moet er rekening gehouden worden met onbedoelde neveneffecten op mechanismen die onder invloed staan van niet-neuronale TRPA1; TRPA1-antagonisme kan bijvoorbeeld TRPA1’s vermogen om bacteriële infecties te detecteren beïnvloeden. TRPA1-deficiënte muizen zijn echter levensvatbaar

(12)

153

en vruchtbaar, zien er normaal uit en vertonen geen auditieve abnormaliteiten of verminderde gevoeligheid voor warmte en kou. Ook wildtype muizen behandeld met een TRPA1-antagonist vertonen geen tekenen van veranderde koudeperceptie of regulatie van de lichaamstemperatuur. Deze bevindingen wijzen op een gezond fenotype ondanks deletie of blokkering van TRPA1. De bovengenoemde waarnemingen en het feit dat de klinische onderzoeken met GRC 17536 geen duidelijke bijwerkingen aan het licht brachten, zijn veelbelovende indicaties dat de mogelijke toekomstige toepassing van TRPA1-remmers veilig kan zijn.

Conclusie

Zowel arginase als TRPA1 lijken veelbelovende aangrijpingspunten te zijn voor de behandeling van astma. Er zullen echter nog vele stappen ondernomen moeten worden voordat arginaseremmers en/of TRPA1 antagonisten beschikbaar zijn voor klinisch gebruik. Desalniettemin dragen de bevindingen in dit proefschrift bij aan het ontwikkelingsproces door inzicht te geven in het de rol van arginase en TRPA1 bij astma, en door nieuwe antagonisten tegen beide aangrijpingspunten te presenteren:

• De nieuwe farmacologische verbindingen SHK242 en SHK277 zijn potente arginaseremmers die mogelijk gebruikt kunnen worden bij behandeling van allergisch astma, aangezien ze arginase in vitro inhiberen en beschermen tegen allergische luchtwegresponsen ex vivo en in vivo (hoofdstuk 2).

• De beschermende werking van arginaseremmers bij allergische luchtwegresponsen wordt primair gemedieerd door een verhoogde afgifte van brochusverwijdend NO in de luchtwegen, met een verminderde luchtwegrespons tot gevolg (Hoofdstuk 2). • Een verstoorde ʟ-arginine homeostase, door veranderingen in de activiteit en

expressie van arginase, NOS en ADMA, speelt niet alleen een belangrijke rol in de chronische luchtwegaandoeningen astma en COPD, maar lijkt ook van belang te zijn bij meerdere comorbiditeiten (Hoofdstuk 3).

• Arginase 2 heeft een beschermende rol op mestcelafhankelijke luchtwegvernauwing, die het gevolg is van de inhibitie van mestceldifferentiatie naar een allergisch fenotype, en gemedieerd wordt door regulatie van het ʟ-ornithine metabolisme (Hoofdstuk 4).

• BI01305834 is een nieuwe potente TRPA1-antagonist die beschermt tegen acute hyperreactiviteit en de vroege en late allergische reacties in vivo, en tegen allergeen en histamine-geïnduceerde luchtwegvernauwing ex vivo. Daarnaast biedt het verlichting na allergeen geïnduceerde bronchoconstrictie, onafhankelijk van luchtwegontsteking (hoofdstuk 5).

• Zowel neuronaal als niet-neuronaal TRPA1 speelt een rol in allergeen geïnduceerde luchtwegvernauwing (hoofdstuk 5).

(13)

(14)

boterham nam, want zo’n sollicitatiegesprek is door de volle agenda’s natuurlijk alleen tijdens lunchtijd te plannen. En Amalia die bemoedigend naar me lachte. Ik twijfelde of ik als bioloog wel aan jullie eisen voldeed en toen jullie vroegen naar mijn kennis van de farmacie zonk de moed me helemaal in de schoenen. Dat dit proefschrift nu hier ligt, geeft al aan dat die eerste reis naar Groningen niet mijn laatste is geweest. Sterker nog, als het moet leg ik het stuk tussen Hattem en Groningen zelfs met de ogen dicht af. Toegegeven, dat is niet heel moeilijk aangezien het grootste deel met de trein kan, maar doe het toch maar eens.

Dat brengt mij vanzelf bij het eind van deze (trein)reis, het dankwoord. Van alle hoofdstukken uit dit proefschrift is de druk tot presteren hier toch wel het hoogst, want funfact: het dankwoord is een van de meest gelezen hoofdstukken uit een proefschrift. Als ik hiervoor anekdotisch bewijs mag aanvoeren, wat niet algeheel geaccepteerd is binnen de wetenschap maar dit hoofdstuk staat buiten het oordeel van het beoordelingscomité dus wie doet me wat, is het dankwoord persoonlijk het eerste hoofdstuk waar ik naartoe blader als ik een vers gedrukt proefschrift in handen krijg. Een wijze vrouw vertelde me eens dat het dankwoord belangrijk is voor het afsluiten en afscheid nemen van je promotietijd. Het gunt je een kijkje achter het wetenschappelijke masker van de promovendus, wat in mijn ogen nooit verkeerd is. Dus laat ik beginnen met nog een wetenschappelijk discutabele praktijk, schaamteloze zelfcitatie, en dan zullen we zien of ik jullie, en vooral ook mijn eigen, verwachtingen waar kan maken.

(15)

156

Onderzoek is een teamsport - M.P.M. van den Berg, 2020

Herman, je heette me die eerste dag niet alleen welkom in Groningen, maar je liet me me daar ook welkom voelen. Wat was, en is, jouw positieve kijk een verademing in vergelijking tot de houding van vele anderen die ik tijdens en na mijn sollicitaties heb ontmoet. Je gunde me de eer om jouw laatste promotiestudent te zijn, aangesteld op het project waar jij al die jaren naartoe hebt gewerkt. Hopelijk heb ik je niet teleurgesteld. Jouw ongekende precisie en wetenschappelijke enthousiasme hebben dit proefschrift gemaakt tot wat het is. Daarvoor en voor al het andere, de steun, gezelligheid, inspiratie, wil ik je bedanken.

Reinoud, mijn dagelijkse begeleider, eerste promotor en naar mijn mening, de terechte winner van de GSS PhD Supervisor of the Year-verkiezing 2019, en ik ben natuurlijk helemaal niet bevooroordeeld. Je inspireert en stimuleert, biedt een luisterend oor, relativeert, lacht, troost en zoekt mee naar een oplossing voor elk probleem. Waar Herman degene was voor wie ik naar Groningen kwam, was jij degene voor wie ik door bleef gaan. Ik gun alle promovendi een begeleider zoals jij.

My sincere gratitude goes towards the members of my reading committee, Prof. dr. Janette Burgess, Prof. dr. Gaetano Caramori, and Prof. dr. Gert Folkerts. Thank you for your thorough reading of my thesis. I hope we will have a lively discussion during my defense.

I would like to thank all consortium partners (Philip Elsinga, Gonçalo dos Santos Clemente, Inês Farinha Antunes, Aren van Waarde, Alex Dömling and Santosh Kurhade), NWO Program Officers (Ellen Fedes and Rob Hermans), and the members of the User Committee (Astrid Alewijnse, Rafael Vélez, Dorothee Laan, Rogier Buijsmans and Maarten van de Berge). Gonçalo, good luck finishing your thesis, you can do it! Thank you to all coauthors that helped shaping the chapters of this thesis. Ido Kema and Martijn van Faassen for their help in histamine determinations. Harm Maarsingh for laying the groundwork of my research and his terrific knowledge on arginase and NO. David Lamb and his co-workers at Boehringer Ingelheim, and Maarten van de Berge for the pleasant collaboration on the TRPA1 chapter. And Craig Wheelock, David Fuchs and Toni Checa for analyzing arginine metabolites for chapter 5. Also, my gratitude towards the coauthors of other articles I got the chance to be involved in: Sergei Lunev, Kai Gao and Matthew Groves, Jelle Folkerts, and Mikael Adner, Brendan Canning, William Ford, Patricia Ramos Ramírez, Mark Birrell, Eva Stoffels, Lennart Lundblad, Gunnar Nilsson, Henric Olsson, Maria Belvisi and Sven-Erik Dahlén.

(16)

157

To all colleagues of Molecular Pharmacology, my MF Family, an everchanging group, but always there when needed. For the third time I’m unable to have a proper goodbye from all of you, so I will have to try my best to put it down in words in this acknowledgement instead. Thank you for all good mornings and goodbyes, for all lunch breaks and cakes, for all the parties and celebrations, for all laughter and tears, for both the scientific and personal support. I will use the next section to personally thank some of you. I would like to name you all, but I won’t, I’m too afraid I will forget to mention someone (call it healthy aging, postpartum dementia or simply a fuzzy mind) and that wouldn’t do you justice. You were all part of my PhD journey, you were all my Groningen family, I couldn’t have done this without you.

Inge, we begonnen samen aan onze promotie en ook al verschilt de route van onze reis, toch bereiken we bijna gelijktijdig de eindstreep. Wat heb jij veel bereikt de afgelopen 4,5 jaar en wat ben ik trots op je. Hopelijk ben je dat zelf ook. Ik kijk met veel plezier terug op onze weekend treinreizen van het eerste half jaar, onze persoonlijke retraite op Schiermonnikoog en alle andere dingen die we samen hebben gedaan. En ik hoop dat we nog lang contact mogen houden.

Martina, een van de powervrouwen van Moleculaire Farmacologie. Het is een zonnige donderdag in juli, labdag 2018. In een slecht verlichte escape room daalt het besef in: “there’s no escaping Martina”. Als je ergens voor gaat, dan ga je er ook echt voor. Soms hard tegen hard, soms in drie talen tegelijk, maar altijd recht vanuit je hart. Danke für alles.

Amalia, you were there on the day of my job interview, sitting next to me, encouraging and reassuring me. Thank you for your kindness on that first day, and on all the days that came after it.

Janneke, het was een nek-aan-nekrace, maar het is je toch gelukt om eerder afscheid te nemen van de groep. De volgende generatie MFers zal het zonder al jouw kennis en ervaring moet stellen. Bedankt dat ik daar nog wel van heb mogen profiteren. Pien, mijn mede-Wageninger bij MF. Nog steeds vraag ik me af of wij elkaar niet al ergens van moeten kennen en die vraag zal me ook nog wel langer bezighouden ben ik bang. In ieder geval ben ik blij dat ik je nu ken en mee mag lachen met je aanstekelijke lach. Je positiviteit, creativiteit en zoektocht naar zelfontplooiing zijn bewonderingswaardigheid. Bedankt dat je voor mij een stukje Wageningen naar het verre Groningen bracht. Susan, het voelt alsof je mijn hele promotieonderzoek bij MF hebt gewerkt, maar in werkelijkheid was het maar een krappe 1,5 jaar. Bedankt dat ik altijd mijn dingetje bij je kwijt kon, voor alle gezelligheid, het samen cavia’s knuffelen, de theepauzes,

(17)

158

je voorliefde voor alles wat zoet en chemisch smaakt, je Groningse nuchterheid. En bedankt ook dat ik Mirthe mocht gebruiken als testcavia voor mijn knutselpraktijken. Annet, als ik aan jou denk zie ik je voor me staan met je armen gespreid, klaar voor een knuffel. In deze tijd besef ik me extra hoe belangrijk een knuffel is, zeker die van jou, vol warmte, genegenheid en bewustzijn, helemaal hier, in het moment. Wat ben ik dankbaar voor alle knuffels die ik van jou heb mogen ontvangen, alle begrip, kalmte, steun, warmte die uit ze sprak. Dankzij jou neem ik me voor meer te genieten van alle knuffels die komen, ze te ervaren in het moment, in te ademen en te accepteren. Namasté, Annet, namasté.

Loes, ik leerde je eerst kennen als collega. Gedreven en efficiënt op de werkvloer, en gezellig en betrokken daarbuiten. Toen ik later de kans om onder jouw supervisie aan het TRPA1 project te werken, bevestigde dat alleen maar het beeld dat ik al van je had. Loes, bedankt voor de prettige samenwerking, de gezellige carpoolritjes, het advies rondom mijn promotieonderzoek en de gesprekken over het moederschap.

Anita, bedankt dat je mij en Inge onder je vleugel nam tijdens onze eerste weken bij MF.

Haoxiao and Bing. You both gave me the honor of being your paranimph, and later of being the godmother of your beautiful Alice. We were brought together by a single lab technique: PCLS. You taught me this beautiful, and sometimes frustrating, technique and everything involved with it. During that time, I got the chance to get to know you, hear your wonderful love story (that you can tell just as beautiful as Bing, Haoxiao) and to become your friend. Haoxiao, our friendship deepened after you got pregnant and moved to Zwolle, and we started spending a lot of time on the train together, sharing stories, laughter, tears and tea. I wish you a bright future, full of love and happiness, and count myself lucky knowing that we will stay friends in the future as well.

Birgit, you came to Groningen in the last stage of your PhD, giving me the opportunity to see you shine during your defense. You are an amazing person. Although I was sad to see you return to Germany, I’m happy how everything turned out for you. And funny enough, the travel time from my (new) home to your place is not much longer than to Groningen.

Fransien, we werden pas in de eindfase van mijn promotietraject collega’s, maar toch voelt het alsof we elkaar al veel langer kennen. Bedankt voor je vrolijke lach, enthousiasme, vriendelijke woorden en adviezen. We spraken er nooit over, maar bedankt ook voor je duurzame insteek. Onze wereld heeft meer mensen zoals jij nodig.

(18)

159

En dan, mijn kantoor, mijn veilige thuisbasis binnen Moleculaire Farmacologie. Dit zal ik in twee talen schrijven, zodat Xinhui het nu in het Engels kan begrijpen en later ook in het Nederlands (no pressure at all). Het schrijven van dit deel heb ik het langst uitgesteld, want dit is het moeilijkst om af te sluiten.

And finally, my office, my safe haven at Molecular Pharmacology. I will write this in two languages: in English to make sure Xinhui understands it now, and in Dutch so she can understand it in the future as well (no pressure at all). I have long postponed writing this part, as it is the hardest to say farewell to.

Toen ik mijn promotietraject begon deelde ik mijn kantoor met drie analisten: Carolina, Mark en Sophie. Tegen de verwachtingen in (niet die van mij), zorgden zij ervoor dat ik me in een mum van tijd thuis voelde op de afdeling en op de hoogte was van alles wat er speelde.

When I started my PhD, I shared an office with three technicians: Carolina, Mark and Sophie. Against expectations (not mine), they immediately made me feel at home at the department, and kept me up-to-date with everything that happened.

Mark, jouw praatjes, positieve insteek en gevoel voor humeur maakten dat ik me op mijn plek voelde in ons kantoor, bedankt daarvoor, en ook voor jouw mooie plek bij het raam. Jouw plek, of eigenlijk mijn oude plek, werd later ingenomen door Xinhui. En ik weet niet hoe of wanneer het gebeurde, maar ineens waren we meer dan een kantoor, we waren Roomies. Roomies die lief en leed delen. Roomies die elkaar kopjes thee brengen, die altijd voor elkaar klaar staan en alles voor elkaar doen. Roomies voor het leven.

Mark, your jokes, positive attitude and sense of humor made me feel at ease in our office, thank you for this, and for your nice window spot. Your spot, or actually my old spot was later occupied by Xinhui. And I can’t remember how or when it happened, but suddenly we became more than an office, we became Roomies. Roomies who shared everything. Roomies who made each other cups of tea, who were always there for each other and did everything they could for one another. Roomies for life.

(19)

160

Carolina, mijn persoonlijke yogi. Vanaf het begin hadden we een onverklaarbare band. Jij leerde me dat sommige dingen zeer complex zijn, maar ze toch ook gewoon te accepteren zoals ze zijn. Als ik mijn ogen sluit en aan jou denk, zie ik ons pratend in ons kantoor, stoelen gedraaid, starend uit het raam. Het is regelmatig in me opgekomen dit beeld vast te leggen, maar ik vrees dat mijn tekenkunsten er geen recht aan zullen doen. Daarom speciaal voor jou deze visualisatie: een fijne, warme plek om naar terug te keren, een plek waar je altijd thuis kunt komen en waar ik er altijd voor je ben.

Carolina, my personal yogi. From the beginning we had an unexplainable connection. You taught me that although some things can be very complex, you can still accept them the way they are. When I close my eyes and think of you, I see us talking in our office, chairs turned towards the window, staring outside. It has often came to my mind to capture this image, but I’m afraid my artistic talent will not do it justice. Therefore, especially for you, this visualization: a nice and warm place to always return to, a place that always feels like home and where I’ll always be there for you. Sophie, waar moet ik beginnen? We

noemden jou wel eens lachend mijn PhD-coach, en dat ben je ook. Echt. Maar je bent nog zoveel meer dan dat. Je bent mijn vraagbak, mijn kritische noot, mijn persoonlijke orakel. Mijn mede-caviaknuffelaar, mijn handwerkgekkie, mijn adphieseur. Mijn klankbord, mijn inspirator, mijn medemama.

Sophie, where shall I start? We once jokingly called you my PhD-coach, and you truly are. But you are so much more than that. You are my Wikipedia, my critical note, my personal oracle. My fellow guinea pig cuddler, my needlework-manic, my adphisor. My sounding board, my inspirator, my fellow mama.

Maar bovenal ben je mijn vriendin. Zelfs als jouw vriendschap het enige is wat ik van mijn jaren in Groningen zou overhouden, zou het alles meer dan waard zijn geweest. Het mag dan wel zo zijn zoals het is en gaan zoals het gaat, dat ik jou en de meisjes heb mogen leren kennen en deel uit mag maken van jullie leven, daar ben ik dankbaar voor.

But above all, you are my friend. Even if your friendship would be the only thing that remained of my Groningen adventure, it would have been worth it. And it may as well be as it is and goes as it goes, but I am forever grateful I got to have met you and your girls, and to have gotten the opportunity to be part of your lives.

(20)

161

Xinhui, mijn lieve, grappige, intelligente, avontuurlijke en bovenal gekke Chinees. Het voelt alsof we vrienden waren vanaf de dag dat we elkaar ontmoeten. Ik kan me niet herinneren hoe het gegaan is, behalve dat je niet meer met Reinoud durfde te praten nadat ik je een filmpje liet zien van hem in een rokje – sorry Reinoud -. Ik zou hiervoor mijn verontschuldigen aan willen bieden, ware het niet dat ik me er niet schuldig over voel. Wel voel ik me enigszins schuldig dat ik je mee heb gesleept op dat kampeeravontuur in de V.S., maar geef toe, het was geweldig. Xinhui, jij bent een van de meest geweldige personen die ik ontmoet heb, en er zijn je er toch al een aantal voorgegaan (zoals je in dit dankwoord kunt lezen nadat je Nederlands hebt geleerd of de tijd hebt genomen het te vertalen met Google Translate). Blijf lachen, blijf vechten, blijf jezelf. Ik hou van je zoals je bent, mijn Chinese zus, en ik zal altijd van je blijven houden.

Xinhui, my bright, funny, intelligent, adventurous and crazy Chinese girl. It feels like we have been friends since the day we first met. I have no recollection of how it truly went, bearing that you didn’t dare to talk to Reinoud after me showing you the movie where he is wearing a mini skirt. – I’m sorry, Reinoud- I would like to apologize for that, except that I’m not sorry at all. I might feel a little bit sorry for dragging you on that camping adventure in the U.S. though, but admit it, it was amazing. Xinhui, you are one of the most amazing persons I’ve met, and I have met some amazing people before (as you can read in this acknowledgement after you’ve learned Dutch or took the time to copy-and-paste to Google Translate). Keep on smiling, keep on fighting, keep being you. I love you for who you are, my Chinese sister, and I will love you always.

Het is voor mij al een tijdje duidelijk dat twee van mijn Roomies mijn paranimfen zouden zijn en ik ben heel blij dat ze daar zelf ook zo over dachten.

It has long been obvious to me that two of my Roomies would be my paranymphs and I am very happy that they thought the same.

Tijdens mijn promotietijd heb ik het geluk gehad om een aantal voortreffelijke studenten te mogen begeleiden. Pieter, Henrik, Imke, Stefani en Isis, wat was het een plezier om met jullie te mogen werken. En wat ben ik jullie dankbaar voor al het werk dat jullie hebben verzet. Pieter, jij was mijn eerste student en hebt daarmee een belangrijke rol gespeeld in mijn vorming tot dagelijkse begeleider. De experimenten uit jouw masterproject hebben de basis gevormd voor het mestcellenwerk in hoofdstuk 5. Stefani, jij koos voor een masterproject bij Moleculaire Farmacologie omdat je het wetenschappelijk onderzoek wilde ervaren. Een keuze die lef vereist, want jij trad daarmee bewust buiten je comfortzone. En ook al kwam je erachter dat je je toch meer op je gemak voelt in de apotheek, je hebt het geweldig gedaan. Ik durf niet eens te tellen hoeveel contractiecurves je hebt uitgevoerd om al het werk in hoofdstuk 2,

(21)

162

en alle data die dat artikel niet hebben behaald, voor elkaar te krijgen. Mijn dank is groot! Imke, jij was niet één, maar twee keer mijn student. Nadat je samen met Henrik jouw bachelorproject bij mij had gedaan, kwam je terug naar Moleculaire Farmacologie voor jouw masterproject. Het voelt als een eer dat je andere gave projecten afwees om met mij onderzoek te doen naar arginase en mestcellen. En als laatste, maar zeker niet de minste, Isis. Tijdens onze eerste ontmoeting herkende ik mezelf in jou, dat hield op toen ik je in het lab aan het werk zag. Daar ben je in je element, doelbewust en zelfverzekerd, ongelofelijk goed. Pieter, Henrik, Imke, Stefani en Isis, bedankt! Ik wens jullie alle succes in zowel jullie professionele als persoonlijke toekomst. Het spijt me dat ik jullie niet uit kan nodigen voor mijn verdediging, ik had jullie er graag bij gehad, dit verdienen jullie eigenlijk ook.

It was only after leaving Groningen that I realized how unique and special it is to have been able to be part of an institute like GRIAC and I will be forever grateful for it. To all GRIAC members: you are an amazing group of people, enthusiastic and involved scientist and physicians, that truly invest in junior researchers like myself. It was amazing to experience that where ever you go, you (almost) always have a fellow Groninger around. Special thanks for Hataitip (always interested and kind), and Orestes and Jorrit (sorry for never showing you the mouse PC₂₀).

Bedankt aan alle medewerkers van het UMCG-CDP. Minke bedankt voor de altijd welkome ontvangst in het gebouw en Annemieke voor de hulp met de operaties. En Ar, wat had ik zonder jou gemoeten? Ik wil je niet alleen bedanken voor al jouw hulp en goede zorg voor de cavia’s, maar ook voor de hartelijke begroetingen, de goede gesprekken, de persoonlijke interesse. Als jij binnenkort met pensioen gaat moet niet alleen het CDP, maar ook Moleculaire Farmacologie een geweldige collega missen. Mijn dank ook aan de Nederlandse Spoorwegen die de dagelijkse verbinding vormden tussen Zwolle en Groningen. Die mij een plek boden om in alle vroegte te beginnen met werken, om vriendschappen te sluiten, een boek te lezen, te haken of gewoon een beetje uit het raam te staren. En die soms een beetje extra avontuur in mijn dag brachten.

Denise en Karen, Xinhui en ik leerden jullie kennen op de eerste NRS longcursus. Er was ons een vol uitdagend programma over longaandoeningen beloofd. Wat ons niet was beloofd, maar wat wel kregen, en wat wat mij betreft ook zeker in de promotiemail had mogen staan, was dat we de kans zouden krijgen om een vriendschap aan te gaan met twee geweldige Rotterdamse promovendi. Bedankt organisatie, en een nog grotere dank aan Karen en Denise voor alles wat we tot nu toe hebben gedeeld en alles wat nog gaat komen. Karen, op het moment dat ik dit schrijf zijn we slechts een paar dagen verwijderd van jouw promotie. Ik weet zeker dat je het geweldig gaat doen/ hebt gedaan!

(22)

163

Aan mijn nieuwe collega’s bij het TechMed Centre, de projectleiders en onderzoekers van het TOPFIT Citizenlab en Miriam, bedankt voor het begrip tijdens de afronding van mijn promotieonderzoek en bedankt voor het vertrouwen in de toekomst. Ondanks al het thuis werken, voel ik me ook bij jullie thuis.

Papa, toen ik aan mijn promotieonderzoek begon zei je dat Groningen wel erg ver is, en dat je daarom niet regelmatig op bezoek zou komen. Je kwam welgeteld een keer, een halfjaar later, om me te helpen naar Hattem te verhuizen. Hopelijk kom je binnenkort nog een keer mee naar Groningen voor mijn verdediging, zodat ik je kan laten zien wat ik allemaal heb gedaan. Bedankt dat je altijd voor me klaarstaat, altijd trots op me bent en altijd in me gelooft. Voor mij ben en blijf je altijd mijn lieve papa, mijn held. En Leonie, bedankt dat je bent wie je bent en er bent zoals je er bent. Een warm hart vol liefde voor jou.

Mama, bedankt voor de steun, de knuffels, de bemoedigende woorden. Voor het oppassen zodat ik ongestoord kon schrijven. Bedankt, dat je mijn moeder bent. Willem, bedankt voor jouw interesse in mijn werk, het altijd willen begrijpen wat ik deed en doe. Ik zeg het niet vaak, maar dat betekent erg veel voor me.

Bianca, mijn kleine grote zus. Je beschikt over een toewijding en doorzettingsvermogen waar menig promotiestudent (mijzelf inbegrepen) iets van kan leren. Wat ben ik trots op jou!

De familie Asbreuk: mijn schoonouders, Joseph en Sjanne, bedankt.. voor alles. Ieke en Mark, Ruben en Stefanie; ik weet dat het soms moeilijk te begrijpen was wat ik deed tijdens mijn promotieonderzoek en dat Google Translate het er ook niet echt duidelijker op maakte. Dankzij jullie sta ik, of eigenlijk zit ik op dit moment, letterlijk waar ik nu zit. Jullie boden mij de warmte, gezelligheid (en een borrel op zijn tijd) in Twente waardoor ik Tim uiteindelijk zijn zin gaf en met hem mee naar De Hoeve verhuisde. – Ook credits voor de Kameraden hier! – Dat ik daardoor jullie geweldige kinderen, Sten en Soof, van zo dichtbij mag zien opgroeien, met Bernd mag zien spelen, betekent meer voor mij dan ik in woorden kan uitdrukken.

Anna, lieve beste Anna. Jij hebt al zoveel van mij gezien, we hebben samen al zoveel meegemaakt. Ik ben blij dat hier eindelijk een plek is om je daarvoor te bedanken. Jij bent degene die er altijd was, is en zal zijn, die me eerlijk zegt waar het op staat ook als ik het niet wil horen. We hebben samen gelachen, gedanst, geleefd, gehuild en dat alles zou ik met niemand anders willen doen. Ook al wonen we nu verder uit elkaar, dat gevoel blijft. Als jij mij vraagt wat ik later het aller-allerliefst wil worden is dat nog steeds jouw buurvrouw.

(23)

164

Milou, Machteld en Roelof, natuurlijk horen jullie in dit dankwoord thuis. We zijn stuk voor stuk verschillend, maar we blijven toch altijd Wageningse biologen. Bedankt voor de mogelijkheid om ongegeneerd te klagen, te relativeren en vooral ook goed nieuws te delen en vieren. Jullie zijn ook geweldig!

Dat je best je eigen familie best mag kiezen heb ik geleerd in Wageningen, of eigenlijk koos zij mij. Het studentenhuis aan de Dijkstraat, 7-up, dat mooie huis vlakbij de Uiterwaarden: mijn Wageningse familie. Het leven in 7-up, de plek waar ik al vroeg werd klaargestoomd voor mijn rol als moeder, hoe cliché het ook klinkt, al mijn huisgenoten daar hebben mij gemaakt tot wie ik nu ben, en gebracht waar ik nu ben. Daarvoor, en voor alle koppen thee, dansjes tijdens het afwassen, keukenfeestjes, kamersafari’s, koekjes eet-slachtoffers, marktdates en alle andere dingen die ik vergeet, ben ik jullie allemaal (ook degene die ik hierna niet bij naam ga noemen) dankbaar. Koen, jij bent en blijft mijn anker. Sorry dat ik je soms op de gekste momenten bel, maar zeg nou zelf, wie wil zo’n geweldig persoon nou niet spreken. Tristin, wanderer, dreamer, believer. Always ready for an adventure, always there for a hug. I hope you know you will always have a home with me. Elisa en Marlies, jullie zijn het bewijs dat vriendschap geen grenzen kent. Elisa, in de kamer tegenover de mijne, waar ik meer tijd doorbracht dan in die van mezelf, waar we kletsen, theedronken, carcassonne speelden, wijn dronken en waar ik altijd net iets langer bleef hangen dan verstandig was. Overal waar jij bent is voor mij automatisch thuis. En Marlies, wat ben ik blij dat jij bij ons kwam wonen. Voor jou reis ik de wereld over, voor jou staat mijn deur (en mijn schoenenkast) altijd open. Naomi, bedankt voor de wekelijkse yogamomenten die me hielpen mijn adem weer terug te vinden en in staat stelden weer met beiden benen stevig in het moment te aarden. Bedankt ook voor de kopjes thee, het luisterende oor, de gezelligheid en warmte. Hattem is voor mij onlosmakelijk met jouw kleine yogastudio verbonden. Bernd, mijn kleine man. De personen die roepen dat je promotiefase het beste moment is om moeder te worden, hebben vast zelf geen kinderen. Het was niet altijd makkelijk om naast al mijn aandacht en liefde voor jou nog plek te vinden voor mijn promotieonderzoek. Gelukkig bood de Coronasituatie respijt en kreeg ik de kans om het moederschap en promoveren dagelijks te combineren. Wat was het heerlijk om die extra maanden met jou thuis te hebben, en je te zien groeien tot het lieve, slimme en tikkeltje eigenwijze jongetje dat je nu bent. Jouw schaterlach is het mooiste geluid dat ik ken. Blijf jezelf. Mama houdt van jou.

En dan de laatste persoon in deze lijst: Tim, de coauteur van zoveel van mijn hoofdstukken die nooit in een proefschrift opgeschreven zullen worden, maar die minstens net zo belangrijk en zoveel dierbaarder zijn dan alles wat ik ooit in een proefschrift zal kunnen opschrijven. Ik heb lang overdacht wat ik hier neer zou moeten zetten, ik vraag me af of de woorden ooit in staat zullen zijn de lading van mijn gevoel

(24)

165

genoeg te dekken. Waarschijnlijk niet. Maar dat geeft niet. Ik zit hier aan de eettafel in ons nieuwe huis en ik voel me dankbaar. Dankbaar voor die ene gekke avond in de IC. Dankbaar dat je de moeite nam om half Facebook af te zoeken om mijn naam te vinden. Dankbaar voor al je aanmoedigingen, je steun, je knuffels, je praktische oplossingen als ik daar niet op zat te wachten. Dankbaar voor alles wat ons leven samen ons heeft gebracht en nog gaat brengen. Dankbaar voor jou, gewoon om wie je bent.

Mariska van den Berg Sint Isidorushoeve, 2020

(25)

166

Curriculum vitae

The author of this thesis was born in Boxmeer, The Netherlands, on the 9th of August in 1992. After finishing her pre-university education (Scholengemeenschap Stevensbeek, atheneum, Stevensbeek) in 2010, she studied Biology at Wageningen University. During her Bachelor studies, she majored in Human and Animal Health and wrote her Bachelor thesis on the epigenetic effect of bisphenol A on obesity, at the department of Human and Animal Physiology (Supervised by dr. K.J. Teerds). Furthermore, she completed a minor in Education, for which she performed an internship at RSG Lingecollege in Tiel, and obtained a second-degree biology teaching qualification. In 2013 she obtained her Bachelor’s degree, after which she started her Master studies, specializing in Health and Disease. During her Master’s she was a student-assistant for the first year’s Bachelor course Introduction in the Environmental Sciences. She performed an internship at Immunology, Infection and Inflammation, at the University of Aberdeen, United Kingdom (supervised by dr. A.M. Hall and Prof. dr. R.N. Barker) where she studied the role of regulatory T-cells and follicular T-helper cells in autoimmune hemolytic anemia. Her master thesis, on the effect of A. bisporus on dendritic cell maturation and T-helper cell differentiation in allergy, was performed at the department of Nematology, Wageningen University (supervised by dr. ir. A. Schots). After completing her Master in 2016, she initiated her PhD study at the department of Molecular Pharmacology, University of Groningen, where she worked on a research project funded by NWO AES (13547) under the supervision of Prof. dr. R. Gosens and Prof. dr. H. Meurs. Her research focused on the role of arginase and TRPA1 in asthma and the valorization of novel arginase and TRPA1 inhibitors. The results of her PhD study are presented in this thesis. At the end of her PhD term, Mariska successfully applied for a position within the TOPFIT program at the University of Twente in Enschede.

(26)

167

List of Publications

Full papers

M.P.M. van den Berg, H. Meurs, R. Gosens. Targeting arginase and nitric oxide metabolism in chronic airway diseases and their co-morbidities. Current opinion in pharmacology, 2018, 40: 126-133.

J. Folkerts, F. Redegeld, G. Folkerts, B. Blokhuis, M.P.M. van den Berg, M.J.W. de Bruijn, W.F.J. van Ijcken, T. Junt, S. Tam, S.J. Galli, R.W. Hendriks, R. Stadshouders, M. Maurer. Butyrate inhibits human mast cell activation via epigenetic regulation of FcεRI-mediated signaling. Allergy, 2020, 75:1966-1978.

M.P.M. van den Berg, S.H. Kurhade, H. Maarsingh, S. Erceg, I.R. Hulsbeek, P.H. Boekema, L.E.M. Kistemaker, M. van Faassen, I.P. Kema, P.H. Elsinga, A.S.S. Dömling, H. Meurs, R. Gosens. Pharmacological screening identifies SHK242 and SHK277 as novel arginase inhibitors with efficacy against allergen-induced airway narrowing in vitro and in vivo. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2020, 374(1):62-73.

M. Adner, B.J. Canning, H. Meurs, W. Ford, P. Ramos Ramirez, M.P.M. van den Berg, M.A. Birrell, E. Stoffels, L.K.A. Lundblad, G.P. Nilsson, H.K. Olsson, M.G. Belvisi, S. Dahlén. Back to the future: re-establishing guinea pig in vivo asthma models. Clinical Science, 2020, 134(11):1219-1242.

Published abstracts

M.P.M. van den Berg, S.H. Kurhade, S. Lunev, H.J.R. van Faassen, I.S.T. Bos, A.B. Zuidhof, M. Groves, I.P. Kema, A. Dömling, H. Meurs, R. Gosens. The In Vitro and Ex Vivo Efficacy of Novel Arginase Inhibitors for the Treatment of Allergic Asthma. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine, 2018, 197:2.

M.P.M. van den Berg, S.H. Kurhade, S. Erceg, S. Lunev, I.S.T. Bos, A.B. Zuidhof, M. Groves, A.S.S. Dömling, H. Meurs, R. Gosens. Exploring the in vitro and ex vivo efficacy of novel arginase inhibitors for the treatment of allergic asthma. Allergy, 2018, 73:343. M.P.M. van den Berg, S. Nijboer-Brinksma, I.S.T. Bos, M. van den Berge, D. Lamb, M. van Faassen, I.P. Kema, R. Gosens, L.E.M. Kistemaker. A novel TRPA1 antagonist inhibits ovalbumin-induced bronchoconstriction in guinea pig models. European Respiratory Journal, 2019, 54:2.