Preclinical evaluation of anti-restenotic therapies and drug-
eluting stents : efficacy and safety considerations
Pires, Nuno Miguel Marques
Citation
Pires, N. M. M. (2007, March 22). Preclinical evaluation of anti-restenotic therapies and drug-eluting stents : efficacy and safety considerations.
Department of Cardiology, Faculty of Medicine / Leiden University Medical Center (LUMC), Leiden University. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/11455
Version: Not Applicable (or Unknown) License:
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/11455
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
SUMMARY AND CONCLUSIONS 12
The goal of this thesis was to develop strategies to evaluate anti-restenotic pharma- cological therapies. First, the objective was to develop and optimize a novel method for local drug delivery in combination with the well-established cuff-induced neoin- tima formation model in the mouse femoral artery – the “drug-eluting cuff” model.
After this, the newly established mouse model was used for studying the vascular pathology of mice treated with the most well-known anti-restenotic compounds to inhibit or prevent intimal hyperplasia and/or accelerated atherosclerosis used cur- rently in combination with the drug-eluting stents (DES) technology. Furthermore, the drug-eluting cuff model was used for the rapid characterization and screening of a series of compounds with potential anti-restenotic capacity to be used in combina- tion with the DES platform.
Post-angioplasty restenosis is the main drawback of percutaneous coronary inter- ventions (PCI). DES have recently been shown to be effective to prevent this pathol- ogy. Chapter 2 is a review of the concept of the DES. This review describes the results of several DES clinical trials and discusses some major topics as long-term efficacy, side effects and implantation techniques from a clinical point-of-view. It is shown that there is success and failure in the new field of DES. So far, the anti- restenotic compounds sirolimus and paclitaxel are the most promising drugs.
Nevertheless, longer follow-up of current clinical studies is mandatory with regard to long-term efficacy and potential side effects. For general wide-spread application of DES many questions still need to be answered. At the moment, long-term follow- up (> 3 years) have demonstrated that both sirolimus- and paclitaxel-eluting stents are superior over bare-metal stents to prevent in-stent restenosis. Recent head-to- head comparisons between both stents suggest that paclitaxel-eluting stent is either of comparable or inferior efficacy (assessed by angiographic end points) with a sim- ilar safety profile (MACE) when compared with the sirolimus-eluting stent.
Nevertheless, DES technology still raises safety-related questions such as late stent thrombosis, malapposition or incomplete opposed stent struts, and local polymer hypersensitivity reactions. As implied in the term “drug-eluting stent”, the drug is only one of the three parts involved in this novel technology. Studies addressing both the stent design and the release kinetics/polymer coating are also of impor- tance.
Chapter 3 focuses on the current efficacy and safety problems related to the use of DES. Furthermore, the use of animal models in general and of a novel murine model
in particular in evaluating the existing and forthcoming compounds to be used in
12
201
combination with the DES platform technologies is discussed and illustrated. DES to prevent in-stent restenosis after angioplasty are a new field in interventional car- diology and have yield promising short-term results. However, efficacy- and safety- related concerns have been rose recently which are difficult to address in human clinical studies. Although efficacy and safety need ultimately to be determined clin- ically, preclinical testing of candidate drugs in well-defined animal models is neces- sary to gain insight into the basic biological responses to candidate compounds. The present chapter illustrates the use of a new animal model to evaluate the existing and forthcoming candidate compounds for DES. This novel mouse model enables rapid screening of candidate drugs for DES and the establishment of dose-response relationships with respect to both therapeutic and harmful effects on the vessel wall.
The results from drug testing using this model could help to quickly and cost-effec- tively establish the dose range of candidate drugs with reasonable potential for DES.
The development of the drug-eluting cuff mouse model is described in chapter 4.
The novel drug-eluting cuff was constructed from a blended polymeric formulation of poly(ε-caprolactone) and poly(ethylene glycol) and simultaneously induces reproducible intimal hyperplasia and allows local delivery of anti-restenotic com- pounds to the cuffed vessel segment. As a proof-of-principle, it is demonstrated that paclitaxel- and rapamycin-eluting cuffs give a sustained release of the encapsulated drug for at least three weeks, in vitro. Consequently, this sustained release resulted in a substantially reduced neointima formation for both anti-restenotic agents test- ed, in vivo, with no systemic adverse effects or effect on control cuffed contralateral femoral arteries. This new approach provides the possibility to evaluate the effec- tiveness and safety of new anti-restenotic agents to be used in combination with the DES strategy in a rapid and easy animal model of restenosis. Especially the fact that it is established for use in the mouse makes application in combination with various transgenic (atherosclerotic) mouse strains possible with all the advantages for detailed analysis of the underlying pathological effects.
In chapter 5 the effect of systemic and local dexamethasone treatment on neointi- ma formation inhibition in the femoral artery cuff-induced mouse model of resteno- sis is assessed. More importantly, the microscopic histopathologic alterations after local delivery of dexamethasone on arterial wall integrity and adverse vascular toxic effects are evaluated. In this chapter it is described that both systemic and local dex- amethasone therapy leads to an inhibition of neointimal growth in a murine model of vascular hyperplasia. Nonetheless, systemic dexamethasone treatment is associ-
ated with systemic side effects. Local delivery of dexamethasone leads to an aboli- tion of the systemic side effects but is associated with medial atrophy, reduced vas- cular smooth muscle cells (SMC) and collagen content, increased number of apop- totic cells and internal elastic lamina fracture. These outcomes point to a loss of vas- cular integrity, particularly at high concentrations. The results of this study indicate that although local dexamethasone delivery has the potential to inhibit neointima formation, the toxic-therapeutic window in which the delicate balance between maximal anti-proliferative effects and minimal effects on vascular pathology is rela- tively narrow since vascular pathobiological side effects are already detected at rel- atively low, but effective, doses of dexamethasone in the drug-eluting cuffs.
Neointima formation after vascular injury is usually studied in healthy, normocho- lesterolemic animals, whereas patients undergoing PCI often have a prolonged his- tory of hypercholesterolemia and diseased atherosclerotic coronary arteries. Hence, DES may not only affect the formation of in-stent restenosis but might also affect the formation or progression of atherosclerotic lesions and thus stabilization grade of the pre-existing treated/stented plaques. Chapter 6 describes the vascular histopathological responses of murine diseased atherosclerotic arteries to sirolimus and paclitaxel. Here it is shown that local delivery of sirolimus and paclitaxel equal- ly inhibit progression of cuff-induced neointima formation on pre-existing athero- sclerotic lesions after secondary (drug-eluting) cuff placement. Nevertheless, delete- rious effects on vascular pathology for higher concentrations of paclitaxel, but not sirolimus were found. Furthermore, it is revealed that the expression of diverse inflammation-, vessel wall composition and remodeling-, and especially apoptosis- related genes are differently expressed in response to the two drugs. Altogether, this indicates that although the anti-restenotic efficacy of both compounds is indis- putable, the local vascular (adverse) effects are divergent between sirolimus and paclitaxel. These differential responses between sirolimus and paclitaxel may explain some of the remaining question of DES. Further studies investigating the effect of these compounds on critical mechanisms of neointima formation and vas- cular healing are warranted. For future developments in DES era, lessons from pre- clinical studies in conjugation with results from clinical evaluations are indispensa- ble for overcoming the problems of current DES platforms.
In the quest to develop pharmacological strategies for preventing and/or inhibiting neointimal hyperplasia after vascular injury the GENetic DEterminants of
Restenosis (GENDER) project, including 3104 consecutive patients after successful
12
203
PCI was used to scan a broad spectrum of genes and their polymorphisms and, thereby, get an overview of which processes are involved in the development of restenosis. As described in chapter 7, the purpose of this association study was to evaluate in a large unselected study population whether a variety of inflammatory genetic determinants can predict the risk of clinical restenosis after PCI. This objec- tive was addressed by using a two-step approach. First, the association was deter- mined between 48 polymorphisms in 34 genes in pathways possible involved in the inflammatory process and subsequently in the femoral artery cuff-induced mouse model of restenosis to study the potential causal involvement of these inflammato- ry genes obtained in the first step. It was shown that genetic variants in inflamma- tion-related factors play an important role in the development of restenosis.
Polymorphisms were found in four inflammation-related genes that predict resteno- sis: β2-adrenergic receptor, CD14, colony-stimulating factor 2, and eotaxin gene.
These genes were further validated for their involvement in the process of resteno- sis, at the mRNA level, in the mouse model of cuff-induced neointima formation.
These results can further contribute to the unraveling of the process of restenosis and thereby provide novel therapeutic targets. This chapter underscores the power of this translational approach based on a combined analysis of large patient popula- tions and specific interventions in mouse models.
The pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNFα) is a key regula- tor of inflammatory responses and may exert critical influence on the development and extension of restenosis. Chapter 8 describes the systematic genotyping of the GENDER population for six polymorphisms in the TNFα gene. The role of TNFα in restenosis development was also assessed in detail in ApoE*3-Leiden transgenic mice, TNFα-null mice and by local delivery of a TNFα biosynthesis inhibitor, thalidomide. The -238G-1031T haplotype of the TNFα gene increased clinical and angiographic risk of restenosis. Preclinical data showed that TNFα mRNA was sig- nificantly, time-dependently, upregulated upon vascular injury. Mice lacking TNFα or locally treated with thalidomide, by means of a thalidomide-eluting cuff, showed a strong neointima formation inhibition. Taken together, TNFα plays an important role in restenosis development and pharmacological modulation of TNFα may be an anti-restenotic strategy.
17β-estradiol (E2) is also known to have anti-restenotic properties. Estrogen recep- tor alpha (ERα) has been demonstrated to mediate E2 anti-restenotic properties.
However the role of ERβ is not fully elucidated. In chapter 9, the respective role of
vascular ERα and ERβ in the anti-restenotic properties of E2 was investigated in the drug-eluting cuff model by local delivery of an ERα- and of an ERβ-selective agonist.
Here it is demonstrated that in addition to ERα, ERβ-specific activation leads to neointima formation inhibition in a murine model of restenosis. These data reveal a yet unidentified protective role of ERβ in injury-induced neointima formation.
The phenotypic modulation of SMC from quiescent, differentiated cells into activat- ed proliferating cells plays a key role in restenosis. The nuclear orphan receptor Nur77 has been shown, in the past, to be involved in such phenotypic changes.
Furthermore, it has been shown recently that 6-mercaptopurine (6-MP) increases Nur77 transactivation. In chapter 10 it is investigated whether 6-MP protects against restenosis through activation of the nuclear receptor Nur77. These data clearly demonstrate that activation of Nur77 by 6-MP inhibits SMC proliferation, a hallmark of restenosis. In addition, by using a murine model of neointima forma- tion, evidence is provided supporting the hypothesis that activation of Nur77 by 6- MP drug-eluting cuffs inhibits neointima formation. Therefore, activation of the nuclear receptor Nur77 by 6-MP or by other activators/agonists may be a rational approach to treat (in-stent) restenosis.
Finally the last chapter, chapter 11, describes a new possible application for the drug-eluting cuff mouse model. Here are described the means to conditionally mod- ify genes at a predefined and localized region of a blood vessel using a drug-eluting cuff which induce highly localized Cre-mediated recombination in the unique SM- CreERT2(ki)/rosa26 mouse without affecting additional (non-targeted) SMC. Thus, this technology enables physical limitation to the exposed area that can subsequent- ly undergo Cre-mediated recombination.
Conclusions
Restenosis is the main drawback of percutaneous coronary interventions (PCI).
Recently, drug-eluting stents were introduced successfully in clinical practice lead- ing to a drop in the post-angioplasty restenosis rate. Nevertheless, safety and effica- cy concerns related to the active compounds of such stents still exist. This thesis aimed at the development of a local delivery system, in combination with the cuff- induced mouse model of neointima formation, in order to closely mimic the DES
mode-of-action and to further answer to such remaining questions related to this
12
205
novel technology. Altogether, these comprehensive studies on efficacy and safety of anti-restenotic compounds using a novel developed mouse model of neointimal hyperplasia have resulted in a thorough understanding of the mode-of-action of these anti-restenotic drugs on neointimal hyperplasia inhibition as well as to further assess the potential adverse effects on vessel wall biology and on the (treated) pre- existing underlying atherosclerotic lesions. Especially the discovery of novel anti- restenotic strategies to be used in combination with the DES technology is of spe- cially importance for further preclinical studies in more advance animal models of restenosis (e.g. porcine coronary artery model) as well as directly in the field of interventional cardiology per se.
SAMENVATTING EN CONCLUSIES
Het doel van dit proefschrift was het ontwikkelen van strategieën ter evaluatie van farmacologische therapieën ten behoeve van restenose preventie. In de eerste plaats was het doel het ontwikkelen en optimaliseren van het “drug-eluting cuff” model.
Hierin is een nieuwe methode van lokale stoffen gecombineerd met het ‘cuff-geïn- duceerde’ neointima formatie model in de Arteria (a.) femoralis van de muis. Hierna werd dit geoptimaliseerde muismodel gebruikt voor het bestuderen van vaatwand pathologie in de muis na behandeling met diverse restenose remmers die momenteel in de kliniek gebruikt worden in ‘drug-eluting stents’ (DES) ter preven- tie van intima hyperplasie en/of versnelde atherosclerose. Voorts werd dit model gebruikt voor snelle karakterisatie en screening van potentieel anti-restenotische werking van stoffen, die eventueel kunnen worden toegepast in DES.
Restenose die optreedt na het toepassen van angioplastiek (“dotteren”), is het groot- ste nadeel van percutane coronaire interventies (PCI). Van DES is recent aange- toond dat dit een effectieve methode is om dergelijke pathologie te voorkomen. In hoofdstuk 2 is het concept van DES nader toegelicht in de vorm van een overzichtsverhaal. In deze review worden de resultaten van een aantal clinical trials betreffende DES beschreven. Voorts worden belangrijke onderwerpen als effec- tiviteit op de lange termijn, bijwerkingen en implantatie technieken vanuit klinisch oogpunt uitgebreid behandeld. Hierin wordt duidelijk dat het nieuwe gebied van DES ‘ups and downs’ kent. Paclitaxel en sirolimus worden tot dusver gezien als de meest veelbelovende stoffen. Een lange termijn follow-up van de huidige klinische studies is echter noodzakelijk voor het in kaart brengen van de effecten en bijw- erkingen op de lange termijn. Alvorens DES op algemenere schaal kunnen worden toegepast dient een groot aantal vragen nog beantwoord te worden. Lange termijn follow-up onderzoeken (> 3 jaar) laten op dit moment zien dat zowel sirolimus als paclitaxel-eluting stents superieur zijn in het voorkomen van in-stent restenose in vergelijking met de authentieke metalen stent. Een vergelijkend onderzoek tussen sirolimus en paclitaxel-eluting stents wijst uit dat de paclitaxel eluting stent qua effectiviteit gelijk is dan wel minder effectief (gebaseerd op angiografische eindpun- ten), met eenzelfde veiligheidsprofiel (MACE, Major Adverse Coronary Events), dan de sirolimus eluting stent. Ondanks de huidige kennis, brengt de DES technologie nog steeds een groot aantal veiligheidsgerelateerde problemen op zoals: trombose in de stent, incorrecte positie en verschuiving van de stent, onvoldoende uitzetten van de stent of lokale overgevoeligheidsreacties voor het gebruikte polymeer.
209
In hoofdstuk 3 worden de huidige effectiviteit en veiligheidsproblemen van DES nader belicht. Daarnaast wordt het algemene gebruik van diermodellen besproken en in het bijzonder een nieuw muismodel ter evaluatie van het gebruik van bestaande en nieuwe stoffen in combinatie met de DES techniek toegelicht.
De toepassing van DES met als doel het voorkomen van in-stent restenose na angio- plastiek is een nieuw domein binnen de interventie cardiologie met veelbelovende resultaten op de korte termijn. Echter, recentelijk zijn er veel twijfels ontstaan over de effectiviteit en de veiligheid van deze toepassing, waarover humane klinische studies geen duidelijkheid kunnen geven. Ondanks het feit dat veiligheid en effec- tiviteit uiteindelijk klinisch getoetst dienen te worden, is het preklinisch toetsen van potentieel werkzame stoffen in representatieve diermodellen nodig om inzicht te verkrijgen in de basale biologische reactie hierop. In dit hoofdstuk wordt een nieuw diermodel gepresenteerd waarin bestaande en nieuwe potentieel werkzame stoffen worden getest voor hun toepassing in DES. Met behulp van dit muismodel is het mogelijk een snelle screening uit te voeren van deze stoffen in DES. Daarnaast kun- nen aan de hand van dit model dosis-respons relaties met betrekking tot thera- peutische en schadelijke effecten op de vaatwand worden geanalyseerd.
De ontwikkeling van het ‘drug-eluting-cuff’ muismodel wordt beschreven in hoofd- stuk 4. De nieuwe ‘drug-eluting-cuff’ bestaat uit een polymeer mengsel van poly ε-caprolactone en polyethylene glycol. Gebruik van dit mengsel heeft een tweeledig doel; enerzijds zorgen het voor repreduceerbare inductie van intima hyperplasie anderzijds zorgen het voor lokale afgifte van anti-restenotische stoffen aan het vaat- segment waar de cuff zich omheen geplaatst is. Als ‘proof-of-principle’ is middels een in vitro experiment aangetoond dat paclitaxel- en rapamycine-‘eluting-cuffs’ in staat zijn om gedurende tenminste 3 weken een constante hoeveelheid van de in de cuff opgenomen stof af te geven. Als gevolg van deze constante afgifte werd, in vivo, een substantiële afname van neointima formatie voor beide geteste anti-restenoti- sche stoffen gezien waarbij geen systemische bijwerkingen optraden. Met behulp van deze nieuwe benadering is effectiviteit en veiligheid van nieuwe anti-restenotis- che stoffen, voor toepassing in DES snel en eenvoudig te testen in een diermodel voor restenose. Dit is in het bijzonder van belang aangezien het model is opgezet voor toepassing bij muizen, waardoor de toepassing bij diverse transgene (eventueel met een atherosclerose achtergrond) muizenstammen mogelijk is, met alle voorde- len van gedetailleerde analyse van onderliggende pathologische effecten.
In hoofdstuk 5 worden de effecten van systemische en lokale behandeling met dexamethason op remming van neointima formatie in a. femoralis onderzocht, met behulp van het ‘cuff-induced’ restenose muismodel. Evaluatie van de microscopis- che histopathologische veranderingen in de samenstelling van de arteriële vaatwand na lokale afgifte van dexamethason is een belangrijk onderdeel in dit hoofdstuk. In het huidige hoofdstuk wordt beschreven dat zowel, systemisch als lokale dexam- ethason therapie leidt tot een remming van neointima vorming in een muismodel van vasculaire hyperplasie. Echter, het systemisch gebruik van dexamethason kent een aantal algemene negatieve bijwerkingen. Lokale afgifte van dexamethason leid- de niet tot systemische bijwerkingen, maar leidde tot atrofie van de media, een ver- minderd aantal gladde spiercellen, een verminderde hoeveelheid collageen, een toe- name van het aantal apoptotische cellen en breuken in de interne lamina elastica.
Deze uitkomsten duiden op verlies van de vaatwand integriteit, voornamelijk bij hoge concentraties. De resultaten van deze studie geven aan dat, ondanks het feit dat lokale afgifte van dexamethason een remming geeft van neointima formatie, het tox- isch-therapeutisch raam, de fijne balans tussen maximale antiproliferatieve effecten en minimale vasculaire pathologie, relatief nauw is: al bij een relatief een lage, maar effectieve, dosis dexamethason is sprake van vasculaire pathobiologische bijwerkin- gen.
Vaatschade en daarop volgende neointima formatie, wordt meestal bestudeerd in gezonde, normocholesterolemische dieren, terwijl het meerendeel van de patiënten die PCI ondergaan een uitgebreide geschiedenis hebben van hypercholesterolemie en aangetaste atherosclerotische coronair arteriën. Deze nieuwe benadering maakt het mogelijk de effectiviteit en veiligheid van nieuwe anti-restenotische stoffen, die in combinatie met DES gebruikt zouden kunnen worden, te evalueren in een snel en eenvoudig restenose diermodel. Vandaar, dat DES niet alleen van invloed zijn op de formatie van ‘in-stent’ stenose, maar ook een effect hebben op de formatie en pro- gressie van onderliggende atherosclerotische laesies en daarmee de mate van stabil- isatie van reeds bestaande, maar behandelde/gestente plaques. In hoofdstuk 6 wordt de vasculaire histopathologische respons op het gebruik van sirolimus en paclitaxel van aangetaste atherosclerotische arteriën in de muis beschreven. Hieruit blijkt dat lokale afgifte van sirolimus en paclitaxel een gelijkmatige remming geeft van de progressie van ‘cuff-geïnduceerde’ neointima formatie na pre-existerende atherosclerotische laesies na secundaire plaatsing van de ‘drug-eluting cuff’.
Gebruik van paclitaxel in hogere concentraties leidde tot schadelijke effecten met betrekking tot vaatwand pathologie. Bij sirolimus was van een dergelijk effect geen
211
sprake. Daarnaast werd, als reactie op beide stoffen, een verschil gevonden in expressie van diverse genen die gerelateerd zijn aan ontsteking, vaatwand samen- stelling, remodeling, en in het bijzonder apoptosis. Dit samengenomen geeft een zonder twijfel vergelijkbaar anti-restenotisch effect van beide stoffen aan, echter betreffende de lokale vasculaire bijwerkingen zijn paclitaxel en sirolimus verschil- lend. Dit verschil in reactie geeft wellicht antwoorden op enkele open vragen met betrekking tot DES. Verder onderzoek naar de effecten van deze stoffen op kritieke mechanismen van neointima formatie en vasculaire genezing is zeker nodig. Voor toekomstige ontwikkelingen op gebied van DES zijn de conclusies van preklinische studies in combinatie met resultaten van klinische evaluaties onmisbaar om de huidige vraagstukken van het DES platform het hoofd te bieden.
Het GENetic DEterminants of Restenosis (GENDER) project, waarin 3104 patiën- ten die PCI hadden ondergaan, waren geïncludeerd, werd gebruikt om nieuwe far- macologische strategieën te ontwikkelen ter preventie en remming van neointima hyperplasie na vaatschade. In dit project werd een breed spectrum van genen en bijbehorende polymorfismen gescreend om zodoende een overzicht te krijgen van de processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van restenose. Zoals beschreven in hoofdstuk 7, was het doel van deze studie om in een grote populatie te evalueren of een verscheidenheid van genetische inflammatoire determinanten het risico op restenose na PCI kunnen voorspellen. Deze evaluatie vond in twee stappen plaats.
Allereerst, werd naar het verband gezocht tussen 48 polymorfismen, in 34 genen, en mechanismen die mogelijk betrokken zijn bij het inflammatoire proces. Vervolgens werden deze inflammatoire genen bestudeerd in het a. femoralis “cuff-induced”
restenose muismodel, om een potentieel causaal verband aan te tonen. Hiermee werd aangetoond dat een aantal van de genen waarin genetische variatie van inflam- matie gerelateerde factoren werd gevonden een belangrijke rol spelen bij de ontwik- keling van restenose. Polymorfismen werden gevonden in vier inflammatie gerela- teerde genen die restenose kunnen voorspellen: β-2 adrenerge receptor, CD14, colony-stimulating factor 2, en het eotaxin gen. Deze genen zijn vervolgens op mRNA niveau verder gevalideerd voor hun betrokkenheid bij het restenose proces in het muismodel. De resultaten hiervan kunnen een verdere bijdrage leveren bij het in kaart brengen van het restenose proces en nieuwe therapeutische doelen aandra- gen. In dit hoofdstuk wordt de essentie onderstreept van de gevolgde translationele benadering, gebaseerd op een gecombineerde analyse van een grote patiënt popu- latie en specifieke interventies in een muismodel.
Pro-inflammatoire cytokine tumor necrose factor alpha (TNFα) speelt een sleutelrol bij inflammatoire reacties en heeft vermoedelijk een belangrijke invloed op het ontstaan en van de verdere ontwikkkeling van restenose. In hoofdstuk 8 wordt de systematische genotypering van de GENDER populatie voor zes polymorfismen in het TNFα gen beschreven. De rol van het TNFα gen in ontwikkeling van restenose werd ook gedetailleerd onderzocht in APOE*3-Leiden, TNFα knockout muizen en door lokale afgifte van een TNFα biosynthese remmer, thalidomide. Het 238G- 1031T haplotype van het TNFα gen vergroot de klinische en angiografische kans op restenose. Preklinische data liet zien dat het mRNA niveau van TNFα significant, tijdsafhankelijk, opgereguleerd was op het moment van vaatschade. TNFα knockout muizen en muizen die lokaal met thalidomide zijn behandeld, door middel van een thalidomide afgevende cuff, lieten een sterke remming zien van neointima formatie.
Dit samengenomen, geeft aan dat TNFα een belangrijke rol speelt bij het ontwikke- len van restenose en farmacologische modulatie van TNFα zou een mogelijke anti- restenose strategie kunnen zijn.
17β-oestradiol (E2) heeft ook anti-restenotische eigenschappen. Van oestrogeen receptor alpha (ERα) is aangetoond dat het de anti-restenotische eigenschappen van E2 medieert. De rol van ERβ is echter nog niet volkomen duidelijk. In hoofdstuk 9, wordt de rol van zowel ERα als die van ERβ met betrekking tot de anti-resteno- tische eigenschappen van E2 onderzocht aan de hand van het ‘drug-eluting cuff’
model door lokale afgifte van een ERα- of ERβ-selectieve agonist. Hier wordt getoond, dat in aanvulling op ERα, ERβ-specifieke activatie leidt tot remming van neointima formatie in een muismodel voor restenose. Aan de hand van deze data komt een tot nog toe onbekende beschermende rol van ERβ tegen schade geοn- duceerde neointima formatie aan het licht.
De fenotypische modulatie van gladde spiercellen van latente, gedifferentieerde cellen naar geactiveerde prolifererende cellen speelt een belangrijke rol in restenose.
Van de nuclear orphan receptor Nur77 is in het verleden aangetoond dat deze betrokken is bij een dergelijke verandering van fenotype. Daarnaast is recentelijk aangetoond dat 6-mercaptopurine (6MP) de transactivatie van Nur77 doet toene- men. In hoofdstuk 10 wordt bestudeerd of 6-MP een beschermende rol heeft tegen het optreden van restenose door het activeren van de nucleaire receptor Nur77. Deze data laat duidelijk zien dat activatie van Nur77 door 6-MP proliferatie van gladde spiercellen, een belangrijk kenmerk van restenose, remt. In aanvulling hierop werd extra ondersteuning geleverd aan de hypothese, dat activatie van Nur77 door 6-MP
213
‘drug-eluting cuffs’ de vorming van neointima remt, met data verkregen met behulp van een muismodel voor neointima formatie. Zodoende lijkt activatie van de nucle- aire receptor Nur77 door 6-MP, of andere activatoren / agonisten van deze “orphan receptor”, een rationele benadering voor het behandelen van ‘in-stent’ restenose.
In het laatste hoofdstuk, hoofdstuk 11, wordt een mogelijk nieuwe toepassing voor het ‘drug-eluting cuff’ muismodel beschreven. Zo wordt de manier beschreven om genen te reguleren in een vooraf gedefinieerd en lokaal gebied van een bloedvat.
Hierbij wordt, met behulp van een ‘drug-eluting cuff’, een Cre-gemedieerde recom- binatie in de unieke SM-CreERT2(ki)/rosa26 muis bewerkstelligd, zonder daarbij andere dan tot de doelgroep behorende cellen te raken. Deze technologie maakt een fysieke begrenzing van het blootgestelde gebied mogelijk, waarin vervolgens Cre- gemedieerde recombinatie plaats kan vinden.
Conclusies
Restenose is het grootste nadeel van percutane coronaire interventies (PCI). De recentelijke succesvolle introductie van ‘drug-eluting stents’, als klinische toepass- ing, heeft het aantal gevallen van restenose na angioplastiek doen dalen. Echter, over de veiligheid en effectiviteit van de gebruikte actieve stoffen in deze stents bestaan nog veel twijfels die tot vragen leiden. Dit proefschrift had de ontwikkeling van een systeem voor lokale afgifte in combinatie met een muismodel voor ‘cuff- induced’ neointima formatie als doel. Aan de hand hiervan kon de DES methode zo dicht mogelijk in de muis benaderd worden om een antwoord te kunnen geven op de vragen betreffende deze nieuwe technologie. Samenvattend, bij de in dit proef- schrift beschreven studies is gekeken naar effectiviteit en veiligheid van anti- restenotische stoffen met behulp van een nieuw opgezet muismodel voor neointima hyperplasie. Dit heeft geleid tot een degelijk inzicht in de wijze waarop anti-resteno- tische stoffen invloed hebben op remming van neointima hyperplasie. Voorts heeft het geleid tot het verder onderzoeken van de mogelijke bijwerkingen van deze stof- fen op de vaatwand biologie en op de (behandelde) pre-existerende onderliggende atherosclerotische laesies. In het bijzonder de ontdekking van nieuwe anti-resteno- tische strategieën om te gebruiken in combinatie met DES technologie is van bijzon- der belang voor verdere preklinische studies in meer geavanceerde restenose dier- modellen (bijv. coronair arterie model in het varken) en voor toepassing in het veld van de interventie cardiologie.
SUMÁRIO E CONCLUSÕES
O principal objectivo da presente tese foi o desenvolvimento de novas estratégias para a avaliação de terapias farmacológicas anti-reestenose. O objectivo proposto foi o de desenvolver e optimizar uma nova metodologia para a libertação localizada de fármacos em conjugação com o reconhecido modelo de formação de neoíntima induzida pela colocação de um colar exterior na artéria femoral do ratinho – o “colar com libertação controlada de fármacos”. Este novo modelo animal foi utilizado para estudar a patologia vascular em ratinhos com os compostos anti-reestenose usados actualmente em combinação com a tecnologia dos stents com libertação controlada de fármacos (SLCF) para inibir ou prevenir a formação de neoíntima e/ou arte- riosclerose acelerada. Posteriormente, o modelo do colar com libertação controlada de fármacos foi utilizado para a caracterização e identificação de diversos fármacos com possíveis propriedades anti-reestenose para serem utilizados em combinação com a plataforma dos SLCF.
A principal limitação da intervenção coronária percutânea (ICP) é a reestenose após angioplastia. O capítulo 2 é uma revisão do conceito dos SLCF. Este capítulo descreve o resultado de vários estudos clínicos com SLCF e discute tópicos impor- tantes, de um ponto de vista clínico, tais como eficácia a longo prazo, efeitos nocivos e técnicas de implementação. Na nova área de investigação dos SLCF foi demonstra- do que existe, igualmente, sucesso e fracasso. Até à data, os fármacos anti- reestenose mais promissores são o sirolimus e o paclitaxel. No entanto, o seguimen- to dos doentes por um período mais longo de tempo após a ICP é obrigatório para uma avaliação cuidada da sua eficácia a longo prazo e hipotéticos efeitos nocivos.
Para uma aplicação generalizada dos SLCF ainda há muitas questões que necessitam de resposta. Até ao momento, o seguimento dos doentes a longo prazo (> 3 anos) demonstrou que ambos os stents com libertação controlada de sirolimus e paclita- xel são superiores aos stents livres de fármacos na prevenção da reestenose intra- stent. Recentes comparações entre os dois stents sugerem que o stent com libertação controlada de paclitaxel possui uma eficácia comparável ou inferior (confirmado por angiografia) com uma segurança semelhante relativamente ao stent com libertação controlada de sirolimus. A tecnologia dos SLCF ainda está envolta em questões rela- cionadas com segurança, tais como trombose tardia do stent, má colocação do stent e reacções locais de hipersensibilidade ao polímero que reveste o stent. Como está implícito na terminologia “stents com libertação controlada de fármacos”, o fárma- co constitui apenas uma das três partes desta nova tecnologia. Estudos que descrevam o design do stent, a cinética de libertação de fármacos e o revestimento polimérico do stent são também de vital importância para o sucesso dos SLCF.
217
O capítulo 3 foca os problemas de eficácia e de segurança relacionados com o uso dos SLCF. Aqui é, também, discutido e ilustrado o uso de modelos animais em geral, e de um modelo de ratinho em particular, na avaliação dos fármacos existentes e vindouros para serem utilizados em combinação com a plataforma tecnológica dos SLCF. Os SLCF para prevenir reestenose intra-stent após angioplastia são uma nova área de investigação em cardiologia de intervenção que geraram resultados promis- sores a curto prazo. No entanto, a sua eficácia e segurança têm sido recorrentemente questionadas mas tais questões são difíceis de endereçar em estudos clínicos. Apesar da eficácia e segurança dos SLCF terem de ser obrigatoriamente comprovadas clini- camente, a avaliação pré-clinica de fármacos com possíveis propriedades anti- reestenose é necessária para um melhor conhecimento destes fármacos nas respostas biológicas básicas. Aqui é demonstrado o uso de um novo modelo animal para a avaliação de fármacos existentes e vindouros para possível uso em combi- nação com os SLCF. Este novo modelo em ratinhos permite a rápida identificação de fármacos para uso nos SLCF bem como o estudo de seus efeitos terapêuticos e nocivos na vasculatura.
O desenvolvimento do modelo do colar com libertação controlada de fármacos em ratinhos é descrito no capítulo 4. Este novo modelo foi construido a partir de uma mistura polimérica de ε-policaprolactona e polietilenoglicol. Esta mistura induz hiperplasia reproduzível da íntima e simultaneamente permite a libertação contro- lada de fármacos localmente para o vaso sanguíneo. Como prova do seu funciona- mento foi demonstrado que colares com libertação controlada de sirolimus e pacli- taxel permitem uma libertação controlada, in vitro, durante três semanas.
Consequentemente, esta libertação controlada de sirolimus e paclitaxel resultou na inibição da formação de neoíntima, in vivo, sem quaisquer efeitos sistémicos nocivos. Esta nova metodologia permite a avaliação de novos fármacos anti- reestenose em relação à sua eficácia e segurança num modelo animal de reestenose rápido e simples. Esta caracterização pré-clínica poderá levar à sua futura utilização em combinação com os SLCF. O facto deste modelo ter sido desenvolvido, especial- mente, para ser utilizado em ratinhos permite a sua aplicação em conjugação com diversas estirpes de ratinhos transgénicos (arterioscleróticos), o que permite uma análise detalhada dos efeitos patológicos subjacentes.
No capítulo 5 foi analisado o efeito do tratamento sistémico e local com dexameta- sona na inibição da formação de neoíntima no modelo de reestenose induzida pelo colar exterior na artéria femoral do ratinho. As alterações histopatológicas foram
avaliadas após o tratamento local com dexametasona no que diz respeito à integri- dade vascular e efeitos nocivos. Neste capítulo é descrito como ambos os tratamen- tos com dexametasona, sistémico e local, levam a uma inibição da formação de neoíntima num modelo de hiperplasia vascular em ratinho. No entanto, o tratamen- to sistémico com dexametasona está associado a efeitos sistémicos nocivos. A liber- tação local de dexametasona conduz ao desaparecimento destes efeitos sistémicos nocivos mas está associada a atrofia da túnica média, perda de células do músculo liso e da quantidade de colagénio, aumento do número de células apoptóticas e do número de fracturas na lâmina elástica interna. Estes resultados indicam uma perda generalizada da integridade vascular, especialmente a concentrações elevadas de dexametasona. Os resultados deste estudo indicam que apesar da libertação local de dexametasona ter a capacidade de inibir a formação de neoíntima, a capacidade tóxico-terapêutica na qual ocorre um equilíbrio entre o máximo efeito anti- proliferativo e o mínimo efeito na vasculatura é relativamente pequena, uma vez que efeitos patobiológicos nocivos ocorrem em doses relativamente baixas, mas eficazes, de dexametasona no colar.
A formação de neoíntima após a lesão do vaso sanguíneo é normalmente estudada em animais normo-colesterolémicos. No entanto, doentes submetidos a ICP têm, frequentemente, uma história clínica prolongada de hipercolesterolemia e lesões arterioscleróticas nas artérias coronárias. Desta forma, os SLCF poderão não só afectar a formação da reestenose intra-stent mas também a formação e/ou pro- gressão das lesões arterioscleróticas pré-existentes nas artérias coronárias, bem como o seu grau de estabilização. O capítulo 6 descreve as respostas histopatológicas de artérias arterioscleróticas de ratinhos aos fármacos sirolimus e paclitaxel. Aqui é demonstrado que a libertação local de sirolimus e paclitaxel inibe, igualmente, a progressão da formação de neoíntima induzida pelo colar exterior na artéria femoral do ratinho em lesões arterioscleróticas pré-existentes após a colo- cação de um segundo colar com libertação controlada de fármacos. Efeitos nocivos na vasculatura foram encontrados a concentrações elevadas de paclitaxel mas não de sirolimus. Este estudo revela, também, que a expressão de diversos genes infla- matórios, composição vascular e, especialmente, apoptose apresentam uma diferente expressão em resposta aos dois fármacos. Em conclusão, estes estudos indicam que apesar da eficácia anti-reestenose dos dois fármacos ser semelhante, os efeitos nocivos na vasculatura são divergentes entre sirolimus e paclitaxel. Esta resposta divergente entre sirolimus e paclitaxel poderá explicar algumas das questões persistentes associadas ao uso dos SLCF. No entanto, um maior número de
219
estudos sobre o efeito destes fármacos em mecanismos críticos na formação de neoíntima são necessários. Para futuros desenvolvimentos na era dos SLCF são indispensáveis mais estudos pré-clínicos, em combinação com estudos clínicos, para ultrapassar os restantes problemas associados a esta nova tecnologia.
Na busca de novas estratégias farmacológicas para prevenir e/ou inibir a hiperpla- sia da neoíntima após lesão vascular foi usado o projecto GENes DEterminantes da Reestenose (GENDER). Este projecto incluiu 3104 doentes consecutivos após ICP e foi concebido para investigar um largo espectro de genes e seus polimorfismos, de forma a obter uma visão global dos processos possivelmente envolvidos no mecanismo da reestenose. Como descrito no capítulo 7, o objectivo deste estudo associativo foi o de avaliar uma grande população de doentes nos quais uma variedade de determinantes genéticos inflamatórios pudessem fazer prever o risco de reestenose clínica após ICP. Este objectivo foi endereçado através de duas etapas distintas. Inicialmente foi estudada a associação entre 48 polimorfismos em 34 genes possivelmente envolvidos no processo inflamatório. Subsequentemente alguns destes genes inflamatórios, obtidos na primeira etapa, foram estudados no modelo de formação de neoíntima induzida pelo colar na artéria femoral do ratinho.
Este estudo demonstra que variantes genéticas, em factores inflamatórios, possuem um papel importante no mecanismo da reestenose. Os resultados deste estudo demonstam que polimorfismos em quatro genes inflamatórios estão associados com a pré-disposição para a reestenose após ICP: receptor beta 2 adrenérgico, CD14, GM-CSF e eotaxina. Estes genes foram posteriormente validados, ao nível do mRNA, para comprovar o seu envolvimento no processo da reestenose no modelo de formação de neoíntima em ratinho. Estes resultados poderão contribuir para um maior conhecimento sobre o processo da reestenose e, deste modo, permitir o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos. O presente capítulo reforça o poder da investigação translacional baseada em análises combinadas entre estudos popula- cionais e intervencões específicas em modelos animais.
A citocina pró-inflamatória factor de necrose tumoral alfa (TNFα) é um importante regulador das respostas inflamatórias e, desta forma, poderá exercer uma influência crítica no desenvolvimento e extensão da reestenose. O capítulo 8 descreve a genotipagem sistemática da população do projecto GENDER em seis polimorfismos do gene TNFα. O papel da citocina TNFα na reestenose foi avaliado em detalhe em ratinhos transgénicos ApoE*3-Leiden, ratinhos deficientes em TNFα e por liber- tação local de um fármaco inibidor da biosíntese de TNFα (talidomida). O haplótipo
-238G-1031T do gene TNFα aumenta o risco da reestenose clínica e angiográfica. Os resultados pré-clínicos demonstraram que os níveis de expressão de mRNA do gene TNFα estavam significativamente aumentados, ao longo do tempo, após a indução da lesão vascular. Ratinhos deficientes em TNFα ou tratados localmente com talido- mida (por via de um colar com libertação controlada de talidomida) demonstraram uma forte inibição na formação de neoíntima. Estes resultados, clínicos e pré-clíni- cos, enfatizam um papel importante para a citocina pró-inflamatória TNFα no desenvolvimento da reestenose e que a modulação farmacológica dos níveis de TNFα poderá ser uma possível estratégia anti-reestenose.
A hormona 17-β-estradiol (E2) é também reconhecida por possuir propriedades anti-reestenose. O receptor alfa de estrogénio (ERα) tem sido reconhecido pela sua capacidade de mediar os efeitos anti-reestenose do E2. No entanto, a função do receptor beta de estrogénio (ERβ) ainda não está inteiramente elucidada. No capí- tulo 9, as respectivas funções dos receptores vasculares ERα e ERβ nas pro- priedades anti-reestenose do E2 foram investigadas no modelo do colar com liber- tação controlada de agonistas específicos do ERα e do ERβ. Aqui foi demonstrado que em adição ao ERα, a activação específica do ERβ resulta numa inibição da for- mação de neoíntima em ratinhos. Estes resultados revelam um papel protector, até agora desconhecido, para o ERβ na reestenose.
A modulação fenotípica das células do músculo liso do estadio quiescente (diferen- ciado) para o estadio proliferativo desempenha um papel relevante na reestenose. O receptor nuclear órfão Nur77 foi descrito, no passado, como parte integrante destas alterações fenotípicas. Recentemente foi também demonstrado que o fármaco 6- mercaptopurina (6-MP) tem a capacidade de aumentar a transactivação do receptor Nur77. No capítulo 10 foi investigada a actividade do fármaco 6-MP na inibição da formação de neoíntima através da activação do receptor nuclear órfão Nur77. Este estudo demonstrou claramente que a activação do receptor Nur77 pelo fármaco 6- MP inibe a proliferação das células do músculo liso, in vitro. Aqui foi também demonstrado que a activação do receptor Nur77 através do modelo do colar com libertação controlada de 6-MP inibe a formação de neoíntima, in vivo. Desta forma conclui-se que a activação do receptor nuclear Nur77 por acção do fármaco 6-MP, ou através de outros activadores/agonistas, poderá ser uma possível estratégia para tratar reestenose intra-stent.
221
Por último, o capítulo 11 descreve uma possível nova aplicação para o modelo do colar com libertação controlada de fármacos. Aqui é descrita uma nova metodologia para a modificação condicional de genes numa região pré-definida e localizada do vaso sanguíneo. O modelo do colar com libertação controlada de fármacos foi uti- lizado como forma de induzir a recombinação localizada, mediada pela enzima Cre sob o controle de um promotor específico para células do músculo liso (promotor SM22), na estipe SM-CreERT2(ki)/rosa26 em ratinhos sem afectar células adicionais (não-alvo) do músculo liso. Desta forma esta tecnologia permite a limitação física da área de recombinação desejada que, posteriormente, poderá sofrer recombinação mediada pela enzima Cre.
Conclusões
Reestenose é a principal limitação da intervenção coronária percutânea (ICP).
Recentemente, a introdução dos stents com libertação controlada de fármacos (SLCF) em cardiologia de intervenção levou à diminuição da taxa da reestenose após angioplastia. No entanto, ainda existem questões de eficácia e segurança rela- cionadas com o uso dos fármacos que revestem estes stents.
A presente tese teve por objectivo o desenvolvimento de um sistema de libertação local de fármacos em combinação com o modelo de formação de neoíntima induzi- da pela colocação de um colar exterior na artéria femoral do ratinho. Esta metodolo- gia pretende mimetizar o modo de acção dos SLCF e, desta forma, tentar responder às questões recorrentes associadas a esta nova tecnologia. No seu conjunto, os estu- dos descritos nesta tese estão relacionados com a eficácia e segurança de fármacos anti-reestenose. Estes estudos permitiram uma compreensão detalhada do modo de acção destes fármacos anti-reestenose na inibição da hiperplasia da neoíntima, bem como o estudo de efeitos potencialmente nocivos na biologia vascular e também em lesões arterioscleroticas pré-existentes. É de especial relevo a descoberta de novas estratégias farmacológicas anti-reestenose para serem utilizadas em combinação com a tecnologia dos SLCF. A descoberta destes novos fármacos anti-reestenose poderá ter uma aplicação em estudos pré-clínicos em modelos animais da reestenose mais evoluídos (por exemplo, em artérias coronárias de suínos) bem como uma importância imediata na área de cardiologia de intervenção.
