Synthetic modifications of the antibiotic peptide gramicidin S : conformational and biological aspects
Knijnenburg, A.D.
Citation
Knijnenburg, A. D. (2011, September 29). Synthetic modifications of the antibiotic peptide gramicidin S : conformational and biological aspects.
Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/17882
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/17882
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting
Dit proefschrift beschrijft modificaties van het klinisch relevante antibiotisch peptide gramicidin S (GS). GS is een natuurlijk voorkomend cyclisch peptide (Val- Orn-Leu-D-Phe-Pro)2 dat wordt geïsoleerd uit de bacterie Aneurinibacillus Migulans, vroeger bekend als Bacillus Brevis. Belangrijk voor de antibiotische werking is de secundaire structuur van GS: een antiparallele β-sheet (Val-Orn- Leu) die is verbonden door twee type II’ β-turns (D-Phe-Pro). Door deze secundaire structuur en de volgorde van de aminozuren heeft GS een amfipatisch karakter: de kationische aminozuren (Orn) zijn gepositioneerd aan één kant van het molecuul en de apolaire aminozuren (Val en Leu) aan de andere kant. Het exacte werkingsmechanisme van GS is niet bekend, maar het begint bij de elektrostatische aantrekking tussen de kationische aminozuren van GS met het negatief geladen celmembraan. Het is zo goed als zeker dat GS de integriteit van de lipide dubbellaag aantast, maar recentelijk zijn er ook eiwitten gevonden in het membraan van Gram-negatieve bacteriën die GS kunnen binden. Daarbij is van belang dat voor GS en overeenkomstige amfipatische peptiden geen efficiënte resistentie mechanismen zijn gerapporteerd. Het gebruik van GS is gelimiteerd, omdat dit antibioticum ook menselijke celmembranen aantast, waardoor dit antibioticum alleen gebruikt kan worden voor uitwendige infecties. Indien GS derivaten kunnen worden ontwikkeld die minder toxisch zijn, zou dit antibioticum breder toegepast kunnen worden. De modificaties van GS beschreven in dit proefschrift hebben als doel de conformatie en/of de amfipaticiteit te beïnvloeden door middel van het inbouwen van suiker aminozuren en niet-natuurlijke aminozuren.
Hoofdstuk 1 is een inleiding over de ontwikkeling van antibiotica door de jaren heen, de ontdekking van GS en de biologische werking van dit antibioticum.
Er worden modificaties van GS behandeld die betrekking hebben op de ring- grootte en amfipaticiteit van dit molecuul. Ook het gebruik van dipeptide isosteren in GS, bouwstenen die twee aminozuren in GS kunnen vervangen, wordt toegelicht.
Hoofdstuk 2 beschrijft de toepassing van suiker aminozuren als dipeptide isosteren voor de vervanging van één van de β-turns van GS. Suiker aminozuren zijn suiker-ringen met een amine (of gemaskeerd amine) en een carboxyl functie.
In deze studie is de ring-grootte van het suiker aminozuur gevarieerd door middel van het gebruik van: een oxetaan-, furanose- en een pyranose-ring. Daardoor ontstaan GS derivaten die met een verschillende spanwijdte de β-turn
| Samenvatting | overbruggen. De invloed van deze modificaties op de structuur is bestudeerd met Röntgen diffractie, NMR technieken, CD en moleculaire modellering. De resultaten van conformationele analyse van de GS derivaten in water en methanol laten zien dat de derivaten een grotere flexibiliteit vertonen dan GS. Verder blijkt dat de spanwijdte van het suiker aminozuur met een pyranose ring, het beste overeenkomt met de natuurlijke D-Phe-Pro β-turn. Ook heeft dit derivaat de beste biologische eigenschappen: het is in dezelfde mate effectief in het doden van bacteriën, maar heeft in tegenstelling tot GS veel minder activiteit tegen menselijke bloedcellen (hemolyse).
Hoofdstuk 3 beschrijft het gebruik van furanose suiker aminozuren als dipeptide isosteren voor de β-turn in verlengde GS derivaten. Deze verlengde GS derivaten, met veertien aminozuren in plaats van tien, hebben een andere amfipaticiteit omdat ze vier kationische aminozuren hebben en zes apolaire aminozuren in de β-sheet. Eén β-turn is vervangen door furanose suiker aminozuren met een verschillend substitutie patroon op de alcohol functies.
Daardoor ontstaan er derivaten met een variërend hydrofoob karakter. CD- en NMR-analyse laten zien dat het furanose suiker aminozuur goed in staat is om de β-turn na te bootsen in deze verlengde GS derivaten. De variërende hydrofobiciteit van de verkregen derivaten zorgt voor een verschil in biologische activiteit. Het meest hydrofobe derivaat met twee benzyl groepen op het suiker aminozuur is ook het meest hemolytisch. Daarentegen is het meest hydrofiele derivaat, met alleen alcohol functies, het minst hemolytisch actief. De resultaten van de biologische testen laten zien dat de verlengde GS derivaten met een suiker aminozuur een beter biologisch profiel hebben (goede antimicrobiële activiteit en lagere hemolyse) dan het niet-gemodificeerde peptide bestaande uit veertien aminozuren. Ook hebben deze derivaten een betere activiteit tegen Gram- negatieve bacteriën.
Hoofdstuk 4 doet verslag van verder onderzoek naar verlengde GS derivaten met furanose suiker aminozuren in de β-turn. In deze studie is de amfipaticiteit veranderd door de introductie van een D-ornithine in de β-sheet. Uit structuur analyse door middel van Röntgen diffractie, NMR en CD blijkt dat de derivaten met een D-ornithine een goede β-sheet/β-turn vormen. Dit betekent dat door de introductie van een D-ornithine de amfipaticiteit en algehele hydrofobiciteit is veranderd: de kationische lading van de D-ornithine is nu gesitueerd op de apolaire kant van het molecuul. In deze serie verlengde GS derivaten blijkt dat de hydrofobiciteit van cruciaal belang is voor een optimale biologische werking: te hydrofoob leidt tot hoge hemolytische activiteit, terwijl de derivaten met een suiker aminozuur en D-ornithine, die minder hydrofoob zijn, een gunstige biologische activiteit hebben. De laatste derivaten zijn minder hemolytisch vergeleken met GS en nog steeds actief tegen bacteriën. Echter, het derivaat
zonder benzyl groep op het suiker aminozuur is zeer hydrofiel en niet meer biologisch actief.
Veranderingen in de hydrofobiciteit door middel van het inbouwen van suiker aminozuren met verschillende ring-grootte of hydrofobe substitutenten kunnen een gunstige uitwerking hebben op het biologisch profiel (Hoofdstuk 2 en 3). Ook is het veranderen van de amfipaticiteit via het inbouwen van een D-aminozuur een benadering om een beter biologisch profiel te realiseren (Hoofdstuk 4). In de studie van Hoofdstuk 5 zijn deze twee strategieën gecombineerd. De synthese is beschreven van een serie van verlengde GS derivaten met een oxetaan-, furanose-, of pyranose-ring suiker aminozuur als substitutie van een β-turn en een D- ornithine substitutie in de β-sheet. De oxetaan-, furanose- en pyranose-suiker aminozuren zijn bovendien variërend gefunctionaliseerd op de alcohol groepen, hetgeen leidt tot een serie met variabele hydrofobiciteit. Uit NMR analyse blijkt dat de derivaten goed in staat zijn om een β-sheet/β-turn te vormen. De derivaten die een suiker aminozuur en een D-ornithine ingebouwd hebben zijn zeer hydrofiel, waardoor ze slecht in staat zijn om bacteriën te doden. Tevens zijn deze moleculen niet hemolytisch actief. De peptiden die alleen een suiker aminozuur substitutie hebben, zijn meer hydrofoob en zeer actief in het doden van bacteriën;
met name zijn ze actiever tegen Gram-negatieve bacteriën dan GS. Ze zijn significant minder toxisch dan het niet-gemodificeerde 14-meer, maar nog steeds meer toxisch dan GS.
Het omdraaien van het aantal apolaire en kationische aminozuren kan gunstig zijn voor de biologische activiteit. Decapeptiden met vier kationische ladingen (ornithines) en twee niet-natuurlijke aminozuren met een adamantaan zijketen (adamantaan-alanine en adamantaan-glycine) zijn significant minder toxisch.
Deze derivaten zijn zeer actief tegen Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën.
In Hoofdstuk 6 wordt uitgelegd hoe de oxetaan-, furanose- en pyranose suiker aminozuren zijn ingebouwd in één turn van deze derivaten, waardoor een kleine serie peptiden ontstaat met verschillende hydrofobiciteit. Uit CD en NMR-analyse blijkt dat de derivaten met een pyranose suiker aminozuur het beste in staat zijn om een β-sheet/β-turn te vormen. Alle verbindingen zijn zeer actief tegen Gram- positieve en Gram-negatieve bacteriën en zijn beduidend minder toxisch dan GS.
Hoofdstuk 7 behandelt verlengde GS derivaten bestaande uit veertien aminozuren die verschillen van amfipaticiteit en hydrofobiciteit. Er zijn GS derivaten met zes kationische ladingen en vier apolaire groepen in de β-sheet gesynthetiseerd. Door de introductie van het niet-natuurlijke aminozuur met een adamantaan zijketen op verschillende posities ontstaat een serie van GS derivaten met verschillende hydrofobiciteit. Er is een optimum vastgesteld in de combinatie van een goede antimicrobiële activiteit en een lage hemolytische activiteit. De meest hydrofobe derivaten zijn hemolytisch en niet goed in staat om bacterie membranen te lyseren en de meest hydrofiele derivaten zijn nauwelijks meer
| Samenvatting | actief in het lyseren van bacterie en menselijke membranen. In het midden van het spectrum zijn de moleculen zeer actief tegen bacteriën en minder hemolytisch.
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift heeft de conformationele eigenschappen alsmede de biologische eigenschappen van gemodificeerde GS derivaten bestudeerd. Er zijn verschillende derivaten gevonden die minder toxisch zijn. Door het veelvuldig en vaak onzorgvuldig gebruik van antibiotica in de wereld bestaan er steeds meer pathogene bacteriën waar geen werkend antibioticum tegen bestaat. Dit onderzoek heeft bijgedragen aan de ontwikkeling van antibiotica die meer dan de bestaande antibiotica in staat zijn om de resistentie mechanismes van bacteriën te omzeilen.
