CRISPR/Cas9 and targeted cancer therapy
Liu, Bin
DOI:
10.33612/diss.99103461
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Liu, B. (2019). CRISPR/Cas9 and targeted cancer therapy. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.99103461
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
236 237
Chapter 8 Summary and Future Perspectives
238 239 Accumulation of genetic mutations causes normal types of cells to transform to cancerous types. Cancer driver mutations, such as in EGFR, TP53, KRAS, BRAF, BRCA1/2, and MET, play a significant role in tumor development. These essential mutant genes have become therapeutic targets for a number of first-line targeted drugs in cancer treatment. However, drug resistance and limited extending of survival time are the bottlenecks of targeted drug treatment. Therefore, the development of new approaches and finding new targets are required.
One of the representative successful targeted drugs is the EGFR-TKI (tyrosine kinase inhibitor) in lung cancer treatment1. Four EGFR-TKIs (erlotinib, gefitinib, afatinib and osimertinib) are available for the treatment of patients with EGFR positive mutations. Although tumor cells with mutant EGFR are extremely sensitive to EGFR-TKIs, acquired resistance is inevitable2. Therefore, there is an imperative to understand resistant mechanisms and find new therapies.
CRISPR/Cas9 is a powerful tool for elucidation of resistant mechanisms, identification of new targets, as well as a potential cancer therapy3. In this thesis, we aimed to explore the potential of CRISPR/Cas9 for discovering therapeutic targets as well as for cancer therapy. To this end, we first reviewed the applications of CRISPR/Cas9 in the identification of new cancer targets, drug resistance and cancer therapy. Later, we used CRISPR/Cas9 to knockout EGFR from different cancer cells, investigated the alterations of other Her family receptors, downstream signaling and the interactions of other receptors, including CXCR7, vEGFR and PDGFR. Despite the rapid development of CRISPR/Cas9 technique, the gene editing potential of CRISPR/Cas9 is not yet sufficient enough for cancer therapy. Therefore, we sought to improve the CRISPR/Cas9 gene editing efficiency by altering the chromatin state through modulation of the HDAC and HAT activity.
In Chapter 2, we comprehensively reviewed and summarized the applications of CRISPR/Cas9 for uncovering new cancer targets and therapy. We provide an overview of studies in which CRISPR/Cas9 has been utilized for the identification of potential therapeutic targets in some of the most frequent solid tumors, including lung, breast, brain, liver, and colorectal cancer. We discuss potential candidates for therapy that are either highly expressed or activated in different
238 239 Accumulation of genetic mutations causes normal types of cells to transform to cancerous types. Cancer driver mutations, such as in EGFR, TP53, KRAS, BRAF, BRCA1/2, and MET, play a significant role in tumor development. These essential mutant genes have become therapeutic targets for a number of first-line targeted drugs in cancer treatment. However, drug resistance and limited extending of survival time are the bottlenecks of targeted drug treatment. Therefore, the development of new approaches and finding new targets are required.
One of the representative successful targeted drugs is the EGFR-TKI (tyrosine kinase inhibitor) in lung cancer treatment1. Four EGFR-TKIs (erlotinib, gefitinib, afatinib and osimertinib) are available for the treatment of patients with EGFR positive mutations. Although tumor cells with mutant EGFR are extremely sensitive to EGFR-TKIs, acquired resistance is inevitable2. Therefore, there is an imperative to understand resistant mechanisms and find new therapies.
CRISPR/Cas9 is a powerful tool for elucidation of resistant mechanisms, identification of new targets, as well as a potential cancer therapy3. In this thesis, we aimed to explore the potential of CRISPR/Cas9 for discovering therapeutic targets as well as for cancer therapy. To this end, we first reviewed the applications of CRISPR/Cas9 in the identification of new cancer targets, drug resistance and cancer therapy. Later, we used CRISPR/Cas9 to knockout EGFR from different cancer cells, investigated the alterations of other Her family receptors, downstream signaling and the interactions of other receptors, including CXCR7, vEGFR and PDGFR. Despite the rapid development of CRISPR/Cas9 technique, the gene editing potential of CRISPR/Cas9 is not yet sufficient enough for cancer therapy. Therefore, we sought to improve the CRISPR/Cas9 gene editing efficiency by altering the chromatin state through modulation of the HDAC and HAT activity.
In Chapter 2, we comprehensively reviewed and summarized the applications of CRISPR/Cas9 for uncovering new cancer targets and therapy. We provide an overview of studies in which CRISPR/Cas9 has been utilized for the identification of potential therapeutic targets in some of the most frequent solid tumors, including lung, breast, brain, liver, and colorectal cancer. We discuss potential candidates for therapy that are either highly expressed or activated in different
240
cancers, because they are more convenient to inhibit or disrupt. We show that several new potential therapeutic targets, such as CD38, CXCR2, MASTL, and RBX2, as well as several noncoding (nc) RNAs have been identified using CRISPR/Cas9 technology4.
In Chapter 3, we summarized the importance of CRISPR/Cas9 system in understanding drug resistance mechanisms and identification of resistance-related genes such as PBRM1, SLFN11 and ATPE1 in different cancers. We also provided an overview of genes, including RSF1, CDK5, and SGOL1, whose disruption can synergize and/or re-sensitize the currently available drugs such as paclitaxel and sorafenib3.
Tyrosine kinase inhibitors (TKIs), such as erlotinib, gefitinib, and afatinib, are the commonly used targeted agents for NSCLC patients with certain EGFR mutations5. However, inevitably, almost all treated patients treated with TKIs develop resistance within 9-13 months after treatment initiation5,6. Mechanisms of EGFR-TKI resistance in NSCLC are complicated. In order to deepen our understanding of EGFR targeting resistance, in Chapter 4, we focus on characterizing of EGFR ablation in NSCLC cells using CRISPR/Cas9 and further investigating other HER family receptors behaviors upon EGFR loss or resistance. We observed distinct and surprising behaviors when cells loss of mutant EGFR compared to the loss of wild type EGFR, including cell proliferation, migration and downstream signaling pathways. Our findings demonstrate that HER2 and HER3 overexpression and transcriptional activation of cyclin D1 is a mechanism of TKI acquired resistance in NSCLC.
KRAS-driven non-small cell lung cancer (NSCLC) patients have no effective targeted treatment1. In Chapter 5, we investigated EGFR knockout as a therapeutic option in EGFR wild type and
KRAS mutated lung cancer cells7. To the best of our knowledge, this is the first study showing that wildtype EGFR plays a significant role in the growth of KRAS-dependent tumor cells. We identified the overexpression of CXCR7 as a bypass mechanism in EGFR-/- cells by promoting MAPK signaling. Both EGFR and CXCR7 inhibition showed synergetic suppression of tumor cell growth. Furthermore, we revealed that CXCR7 was increased in EGFRwt, but decreased in
EGFRmut cell lines after treatment with gefitinib. We also show that CXCR7 expression is higher
241 in adenocarcinoma (ADC) than squamous cell lung carcinoma (SQCC) in NSCLC patients and the healthy lung tissue. Therefore, dual inhibition of EGFR and CXCR7 might be a potential treatment strategy for patients with NSCLC.
Since EGFR plays a significant role in various cancers, we focus on EGFR targeting and expand our study from lung cancer to renal cancer8,9. In Chapter 6, we examined whether EGFR knockout in combination with different small molecular inhibitors or therapeutic proteins (TRAIL) can be used as a therapeutic approach for RCC. We showed that disruption of overexpressed EGFR dramatically inhibits the proliferation of RCC and arrests cells at G2/M checkpoint. Furthermore, we found that inhibition of PDGFR and VEGFR by sunitinib can attenuate the expression of pERK1/2 and pAKT induced by EGFR loss. Thus, ablation of overexpressed EGFR by CRISPR/Cas9 or in combination with sunitinib may be an option for renal cell carcinoma treatment.
Despite the rapid development of CRISPR/Cas9-mediated gene editing technology, the gene editing potential of CRISPR/Cas9 is hampered by low efficiency, especially for cancer gene therapy10,11. In Chapter 7, we comprehensively investigated the impact of HDACs and HATs on CRISPR/Cas9 mediated gene editing. We found that Entinostat (HDAC1/2/3 inhibitor) and Panobinostat (pan-HDAC inhibitor) enhanced Cas9 gene editing activity while other inhibitors (HDAC4/5/6/7/8/9) did not. We also found that RGFP966 (HDAC3 inhibitor) decreased CRISPR/Cas9 gene editing activity, which can be used for downregulation CRISPR/Cas9 gene editing activity. Importantly, Entinostat and Panobinostat dramatically increase gene knock-in rates. We confirmed these findings by knockdown of HDAC1, HDAC2 and HDAC3. We further identified that HDAC inhibition (Entinostat and Panobinostat) facilitated Cas9 access to target DNA and increased cutting frequencies. Our study revealed an essential role of HDACs in CRISPR/Cas9 mediated gene editing. We demonstrate that it is feasible to modulate CRISPR/Cas9 gene editing efficiency by regulating HDAC activity. This method might also be widely used in regulating other nucleases (ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 and dCas9)-mediated genome and epigenome editing.
240
cancers, because they are more convenient to inhibit or disrupt. We show that several new potential therapeutic targets, such as CD38, CXCR2, MASTL, and RBX2, as well as several noncoding (nc) RNAs have been identified using CRISPR/Cas9 technology4.
In Chapter 3, we summarized the importance of CRISPR/Cas9 system in understanding drug resistance mechanisms and identification of resistance-related genes such as PBRM1, SLFN11 and ATPE1 in different cancers. We also provided an overview of genes, including RSF1, CDK5, and SGOL1, whose disruption can synergize and/or re-sensitize the currently available drugs such as paclitaxel and sorafenib3.
Tyrosine kinase inhibitors (TKIs), such as erlotinib, gefitinib, and afatinib, are the commonly used targeted agents for NSCLC patients with certain EGFR mutations5. However, inevitably, almost all treated patients treated with TKIs develop resistance within 9-13 months after treatment initiation5,6. Mechanisms of EGFR-TKI resistance in NSCLC are complicated. In order to deepen our understanding of EGFR targeting resistance, in Chapter 4, we focus on characterizing of EGFR ablation in NSCLC cells using CRISPR/Cas9 and further investigating other HER family receptors behaviors upon EGFR loss or resistance. We observed distinct and surprising behaviors when cells loss of mutant EGFR compared to the loss of wild type EGFR, including cell proliferation, migration and downstream signaling pathways. Our findings demonstrate that HER2 and HER3 overexpression and transcriptional activation of cyclin D1 is a mechanism of TKI acquired resistance in NSCLC.
KRAS-driven non-small cell lung cancer (NSCLC) patients have no effective targeted treatment1. In Chapter 5, we investigated EGFR knockout as a therapeutic option in EGFR wild type and
KRAS mutated lung cancer cells7. To the best of our knowledge, this is the first study showing that wildtype EGFR plays a significant role in the growth of KRAS-dependent tumor cells. We identified the overexpression of CXCR7 as a bypass mechanism in EGFR-/- cells by promoting MAPK signaling. Both EGFR and CXCR7 inhibition showed synergetic suppression of tumor cell growth. Furthermore, we revealed that CXCR7 was increased in EGFRwt, but decreased in
EGFRmut cell lines after treatment with gefitinib. We also show that CXCR7 expression is higher
241 in adenocarcinoma (ADC) than squamous cell lung carcinoma (SQCC) in NSCLC patients and the healthy lung tissue. Therefore, dual inhibition of EGFR and CXCR7 might be a potential treatment strategy for patients with NSCLC.
Since EGFR plays a significant role in various cancers, we focus on EGFR targeting and expand our study from lung cancer to renal cancer8,9. In Chapter 6, we examined whether EGFR knockout in combination with different small molecular inhibitors or therapeutic proteins (TRAIL) can be used as a therapeutic approach for RCC. We showed that disruption of overexpressed EGFR dramatically inhibits the proliferation of RCC and arrests cells at G2/M checkpoint. Furthermore, we found that inhibition of PDGFR and VEGFR by sunitinib can attenuate the expression of pERK1/2 and pAKT induced by EGFR loss. Thus, ablation of overexpressed EGFR by CRISPR/Cas9 or in combination with sunitinib may be an option for renal cell carcinoma treatment.
Despite the rapid development of CRISPR/Cas9-mediated gene editing technology, the gene editing potential of CRISPR/Cas9 is hampered by low efficiency, especially for cancer gene therapy10,11. In Chapter 7, we comprehensively investigated the impact of HDACs and HATs on CRISPR/Cas9 mediated gene editing. We found that Entinostat (HDAC1/2/3 inhibitor) and Panobinostat (pan-HDAC inhibitor) enhanced Cas9 gene editing activity while other inhibitors (HDAC4/5/6/7/8/9) did not. We also found that RGFP966 (HDAC3 inhibitor) decreased CRISPR/Cas9 gene editing activity, which can be used for downregulation CRISPR/Cas9 gene editing activity. Importantly, Entinostat and Panobinostat dramatically increase gene knock-in rates. We confirmed these findings by knockdown of HDAC1, HDAC2 and HDAC3. We further identified that HDAC inhibition (Entinostat and Panobinostat) facilitated Cas9 access to target DNA and increased cutting frequencies. Our study revealed an essential role of HDACs in CRISPR/Cas9 mediated gene editing. We demonstrate that it is feasible to modulate CRISPR/Cas9 gene editing efficiency by regulating HDAC activity. This method might also be widely used in regulating other nucleases (ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 and dCas9)-mediated genome and epigenome editing.
242
Future perspectives
We aimed to use CRISPR/Cas9 for cancer research and enhancing CRISPR/Cas9 for cancer therapy in this thesis. We concentrate on EGFR targeting by CRISPR/Cas9 and compared to EGFR-TKIs treatment. We uncovered three compensating or alternative mechanisms in EGFR targeting: HER2/3 overexpression and transcriptional activation of cyclin D1 (Chapter 4), CXCR7 overexpression (Chapter 5), vEGFR and PDGFR activating (Chapter 6).
Although EGFR ablation by CRISPR/Cas9 can mimic EGFR–TKIs treatment in some aspects, disruption of EGFR by CRISPR/Cas9 is different from TKI treatment. Since EGFR-TKI may only inhibit the tyrosine kinase activity of EGFR, other functions of EGFR may remain active or being more active12. However, EGFR knocked out by CRISPR/Cas9 will remove all of EGFR functions and may lead to activation of alternative pathways7,13. Future studies need to elucidate the differences and correlations between knockout and inhibition. To this end, investigation of transcriptome and proteome levels alteration upon loss of EGFR may give more insights. Specifically, in Chapter 5, our data showed that EGF can still stimulate pAkt in EGFR-/- cells. This observation indicates that EGF-induced phosphorylation of Akt may be independent of EGFR, which has not been reported previously to our knowledge. One hypothesis is that EGF stimulates pAkt via CXCR7, because previous studies have shown that CXCR7 associated pathways can induce Akt phosphorylation14,15and we observed CXCR7 overexpression in A549
EGFR-/- cells7. In addition, one recent study reported that Akt activation is related to EGFR drug resistance in lung cancer16. Of note, a study reported that MIF O-GlcNAcylated MIF binds to EGFR17. Other studies show that MIF is a ligand of CXCR715,18. Collectively, it is rational to speculate whether EGF or DDT (MIF2) is a ligand of CXCR7. Given the importance of these interactions, future studies are needed to explore the crosstalk between EGFR, CXCR7 and their ligands (EGF, DDT, MIF and others) (Figure 1)
243 Figure 1 A potential crosstalk model between EGFR, CXCR7 and their ligands
We have set up a platform for screening the small molecular compounds for enhancing or inhibiting CRISPR/Cas9 activity (Chapter 7). Using this platform, we provide a practical option for improving gene editing efficiency through chromatin de-condensation using HDAC inhibition. Furthermore, our study facilitates a deeper understanding of gene editing process by altering the accessibility of the DNA through histone acetylation and histone deacetylation. This platform can be widely used for screening enhancers and inhibitors of nucleases mediated-gene editing for future studies (Figure 2).
242
Future perspectives
We aimed to use CRISPR/Cas9 for cancer research and enhancing CRISPR/Cas9 for cancer therapy in this thesis. We concentrate on EGFR targeting by CRISPR/Cas9 and compared to EGFR-TKIs treatment. We uncovered three compensating or alternative mechanisms in EGFR targeting: HER2/3 overexpression and transcriptional activation of cyclin D1 (Chapter 4), CXCR7 overexpression (Chapter 5), vEGFR and PDGFR activating (Chapter 6).
Although EGFR ablation by CRISPR/Cas9 can mimic EGFR–TKIs treatment in some aspects, disruption of EGFR by CRISPR/Cas9 is different from TKI treatment. Since EGFR-TKI may only inhibit the tyrosine kinase activity of EGFR, other functions of EGFR may remain active or being more active12. However, EGFR knocked out by CRISPR/Cas9 will remove all of EGFR functions
and may lead to activation of alternative pathways7,13. Future studies need to elucidate the
differences and correlations between knockout and inhibition. To this end, investigation of transcriptome and proteome levels alteration upon loss of EGFR may give more insights. Specifically, in Chapter 5, our data showed that EGF can still stimulate pAkt in EGFR-/- cells. This observation indicates that EGF-induced phosphorylation of Akt may be independent of EGFR, which has not been reported previously to our knowledge. One hypothesis is that EGF stimulates pAkt via CXCR7, because previous studies have shown that CXCR7 associated pathways can induce Akt phosphorylation14,15and we observed CXCR7 overexpression in A549
EGFR-/- cells7. In addition, one recent study reported that Akt activation is related to EGFR drug
resistance in lung cancer16. Of note, a study reported that MIF O-GlcNAcylated MIF binds to
EGFR17. Other studies show that MIF is a ligand of CXCR715,18. Collectively, it is rational to speculate whether EGF or DDT (MIF2) is a ligand of CXCR7. Given the importance of these interactions, future studies are needed to explore the crosstalk between EGFR, CXCR7 and their ligands (EGF, DDT, MIF and others) (Figure 1)
243
Figure 1 A potential crosstalk model between EGFR, CXCR7 and their ligands
We have set up a platform for screening the small molecular compounds for enhancing or inhibiting CRISPR/Cas9 activity (Chapter 7). Using this platform, we provide a practical option for improving gene editing efficiency through chromatin de-condensation using HDAC inhibition. Furthermore, our study facilitates a deeper understanding of gene editing process by altering the accessibility of the DNA through histone acetylation and histone deacetylation. This platform can be widely used for screening enhancers and inhibitors of nucleases mediated-gene editing for future studies (Figure 2).
244
Figure 2 A brief work flow of a High-throughput screening for regulation of CRISPR/Cas9
mediated genome editing
245
References
1. Camidge, D. R., Pao, W. & Sequist, L. V. Acquired resistance to TKIs in solid tumours: learning from lung cancer. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11, 473 (2014).
2. van der Wekken, A. J. et al. Resistance mechanisms after tyrosine kinase inhibitors afatinib and crizotinib in non-small cell lung cancer, a review of the literature. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 100, 107–116 (2016).
3. Saber, A., Liu, B., Ebrahimi, P. & Haisma, H. J. CRISPR/Cas9 for overcoming drug resistance in solid tumors. Daru (2019). doi:10.1007/s40199-019-00240-z
4. Liu, B., Saber, A. & Haisma, H. J. CRISPR/Cas9: a powerful tool for identification of new targets for cancer treatment. Drug Discov. Today (2019). doi:10.1016/j.drudis.2019.02.011 5. Morgillo, F., Della Corte, C. M., Fasano, M. & Ciardiello, F. Mechanisms of resistance to EGFR-targeted drugs: lung cancer. ESMO open 1, e000060 (2016).
6. Mao, C. et al. KRAS mutations and resistance to EGFR-TKIs treatment in patients with non-small cell lung cancer: A meta-analysis of 22 studies. Lung Cancer 69, 272–278 (2010). 7. Liu, B. et al. CX Chemokine Receptor 7 Contributes to Survival of KRAS-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer upon Loss of Epidermal Growth Factor Receptor. Cancers 11, (2019).
8. Bremer, E. et al. Potent systemic anticancer activity of adenovirally expressed EGFR-selective TRAIL fusion protein. Mol. Ther. 16, 1919–26 (2008).
9. Zhang, Z. et al. Targeted Inactivation of EGF Receptor Inhibits Renal Collecting Duct Development and Function. 573–578 (2010). doi:10.1681/ASN.2009070719
10. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 339–44 (2016).
244
Figure 2 A brief work flow of a High-throughput screening for regulation of CRISPR/Cas9
mediated genome editing
245
References
1. Camidge, D. R., Pao, W. & Sequist, L. V. Acquired resistance to TKIs in solid tumours: learning from lung cancer. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11, 473 (2014).
2. van der Wekken, A. J. et al. Resistance mechanisms after tyrosine kinase inhibitors afatinib and crizotinib in non-small cell lung cancer, a review of the literature. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 100, 107–116 (2016).
3. Saber, A., Liu, B., Ebrahimi, P. & Haisma, H. J. CRISPR/Cas9 for overcoming drug resistance in solid tumors. Daru (2019). doi:10.1007/s40199-019-00240-z
4. Liu, B., Saber, A. & Haisma, H. J. CRISPR/Cas9: a powerful tool for identification of new targets for cancer treatment. Drug Discov. Today (2019). doi:10.1016/j.drudis.2019.02.011 5. Morgillo, F., Della Corte, C. M., Fasano, M. & Ciardiello, F. Mechanisms of resistance to EGFR-targeted drugs: lung cancer. ESMO open 1, e000060 (2016).
6. Mao, C. et al. KRAS mutations and resistance to EGFR-TKIs treatment in patients with non-small cell lung cancer: A meta-analysis of 22 studies. Lung Cancer 69, 272–278 (2010). 7. Liu, B. et al. CX Chemokine Receptor 7 Contributes to Survival of KRAS-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer upon Loss of Epidermal Growth Factor Receptor. Cancers 11, (2019).
8. Bremer, E. et al. Potent systemic anticancer activity of adenovirally expressed EGFR-selective TRAIL fusion protein. Mol. Ther. 16, 1919–26 (2008).
9. Zhang, Z. et al. Targeted Inactivation of EGF Receptor Inhibits Renal Collecting Duct Development and Function. 573–578 (2010). doi:10.1681/ASN.2009070719
10. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat. Biotechnol. 34, 339–44 (2016).
246
11. Dang, Y. et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biol. 16, 280 (2015).
12. Liu, Q. et al. EGFR-TKIs resistance via EGFR-independent signaling pathways. Mol. Cancer 17, 53 (2018).
13. Mou, H. et al. Genetic disruption of oncogenic Kras sensitizes lung cancer cells to Fas receptor-mediated apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3648–3653 (2017).
14. Kumar, R. et al. CXCR7 mediated Giα independent activation of ERK and Akt promotes cell survival and chemotaxis in T cells. Cell. Immunol. 272, 230–241 (2012).
15. Chatterjee, M. et al. Macrophage migration inhibitory factor limits activation-induced apoptosis of platelets via CXCR7-dependent Akt signaling. Circ. Res. 115, 939–949 (2014). 16. Jacobsen, K. et al. Convergent Akt activation drives acquired EGFR inhibitor resistance in lung cancer. Nat. Commun. 8, 410 (2017).
17. Zheng, Y. et al. Secreted and O-GlcNAcylated MIF binds to the human EGF receptor and inhibits its activation. Nat. Cell Biol. 17, 1348–1355 (2015).
18. Alampour-Rajabi, S. et al. MIF interacts with CXCR7 to promote receptor internalization, ERK1/2 and ZAP-70 signaling, and lymphocyte chemotaxis. FASEB J. 29, 4497–511 (2015).
246
11. Dang, Y. et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biol. 16, 280 (2015).
12. Liu, Q. et al. EGFR-TKIs resistance via EGFR-independent signaling pathways. Mol. Cancer 17, 53 (2018).
13. Mou, H. et al. Genetic disruption of oncogenic Kras sensitizes lung cancer cells to Fas receptor-mediated apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3648–3653 (2017).
14. Kumar, R. et al. CXCR7 mediated Giα independent activation of ERK and Akt promotes cell survival and chemotaxis in T cells. Cell. Immunol. 272, 230–241 (2012).
15. Chatterjee, M. et al. Macrophage migration inhibitory factor limits activation-induced apoptosis of platelets via CXCR7-dependent Akt signaling. Circ. Res. 115, 939–949 (2014). 16. Jacobsen, K. et al. Convergent Akt activation drives acquired EGFR inhibitor resistance in lung cancer. Nat. Commun. 8, 410 (2017).
17. Zheng, Y. et al. Secreted and O-GlcNAcylated MIF binds to the human EGF receptor and inhibits its activation. Nat. Cell Biol. 17, 1348–1355 (2015).
18. Alampour-Rajabi, S. et al. MIF interacts with CXCR7 to promote receptor internalization, ERK1/2 and ZAP-70 signaling, and lymphocyte chemotaxis. FASEB J. 29, 4497–511 (2015).
248 249 Nederlandse Samenvatting
Opeenstapeling van genetische mutaties zorgen ervoor dat normale cellen zich transformeren naar kanker cellen. Kanker gerelateerde mutaties, zoals in EGFR, TP53, KRAS, BRAF, BRCA1/ 2 en
MET, spelen een belangrijke rol bij tumorontwikkeling. Deze essentiële gemuteerde genen zijn
therapeutische doelen geworden voor een aantal eerstelijns gerichte geneesmiddelen bij de behandeling van kanker. Echter, geneesmiddelenresistentie en beperkte verlenging van de overleving zijn de knelpunten van gerichte medicamenteuze behandeling. Daarom zijn de ontwikkeling van nieuwe behandelingen en het vinden van nieuwe aangrijpingspunten vereist. Een van de belangrijkste succesvolle gerichte medicijnen is de EGFR-TKI (tyrosine kinase remmer) bij de behandeling van longkanker. Vier EGFR-TKIs (erlotinib, gefitinib, afatinib en osimertinib) zijn beschikbaar voor de behandeling van patiënten met EGFR-positieve mutaties. Hoewel tumorcellen met een gemuteerde EGFR extreem gevoelig zijn voor EGFR-TKIs, is verworven resistentie onvermijdelijk. Daarom is het noodzakelijk om de resistentiemechanismen te begrijpen en om nieuwe therapieën te vinden.
CRISPR/Cas9 is een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van resistentiemechanismen, identificatie van nieuwe aangrijpingspunten en is zelf een potentiële therapie tegen kanker. In dit proefschrift onderzochten we de toepassing van CRISPR/Cas9 bij de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen, waaronder nieuwe therapieën bij de behandeling van kanker. We hebben eerst de toepassingen van CRISPR/Cas9 beoordeeld bij de identificatie van nieuwe aangrijpingspunten, resistentiemechanismen en kankertherapie. Later gebruikten we CRISPR/Cas9 om het EGFR gen uit te schakelen in verschillende kankercellijnen. Ook onderzochten we de veranderingen in andere receptoren van de Her-familie, signaaltransductie en de interactie met andere receptoren zoals CXCR7, vEGFR en PDGFR. Ondanks de snelle ontwikkeling van de CRISPR/Cas9 techniek is zijn mogelijkheid om veranderingen in genen aan te brengen nog niet efficiënt genoeg voor kanker therapie. Daarom zochten we een manier om de efficiëntie van CRISPR/Cas9 te veranderen. We deden dit door de staat van het chromatine
248 249 Nederlandse Samenvatting
Opeenstapeling van genetische mutaties zorgen ervoor dat normale cellen zich transformeren naar kanker cellen. Kanker gerelateerde mutaties, zoals in EGFR, TP53, KRAS, BRAF, BRCA1/ 2 en
MET, spelen een belangrijke rol bij tumorontwikkeling. Deze essentiële gemuteerde genen zijn
therapeutische doelen geworden voor een aantal eerstelijns gerichte geneesmiddelen bij de behandeling van kanker. Echter, geneesmiddelenresistentie en beperkte verlenging van de overleving zijn de knelpunten van gerichte medicamenteuze behandeling. Daarom zijn de ontwikkeling van nieuwe behandelingen en het vinden van nieuwe aangrijpingspunten vereist. Een van de belangrijkste succesvolle gerichte medicijnen is de EGFR-TKI (tyrosine kinase remmer) bij de behandeling van longkanker. Vier EGFR-TKIs (erlotinib, gefitinib, afatinib en osimertinib) zijn beschikbaar voor de behandeling van patiënten met EGFR-positieve mutaties. Hoewel tumorcellen met een gemuteerde EGFR extreem gevoelig zijn voor EGFR-TKIs, is verworven resistentie onvermijdelijk. Daarom is het noodzakelijk om de resistentiemechanismen te begrijpen en om nieuwe therapieën te vinden.
CRISPR/Cas9 is een krachtig hulpmiddel voor het ophelderen van resistentiemechanismen, identificatie van nieuwe aangrijpingspunten en is zelf een potentiële therapie tegen kanker. In dit proefschrift onderzochten we de toepassing van CRISPR/Cas9 bij de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen, waaronder nieuwe therapieën bij de behandeling van kanker. We hebben eerst de toepassingen van CRISPR/Cas9 beoordeeld bij de identificatie van nieuwe aangrijpingspunten, resistentiemechanismen en kankertherapie. Later gebruikten we CRISPR/Cas9 om het EGFR gen uit te schakelen in verschillende kankercellijnen. Ook onderzochten we de veranderingen in andere receptoren van de Her-familie, signaaltransductie en de interactie met andere receptoren zoals CXCR7, vEGFR en PDGFR. Ondanks de snelle ontwikkeling van de CRISPR/Cas9 techniek is zijn mogelijkheid om veranderingen in genen aan te brengen nog niet efficiënt genoeg voor kanker therapie. Daarom zochten we een manier om de efficiëntie van CRISPR/Cas9 te veranderen. We deden dit door de staat van het chromatine
250
te variëren via aanpassingen in de activiteit van bepaalde enzymen, de zogenaamde HATs en HDACs
In hoofdstuk 2 worden de toepassingen van CRISPR/Cas9 bij de ontdekking van nieuwe aangrijpingspunten voor de behandeling van kanker uitvoerig besproken. We geven een overzicht van studies waarbij CRISPR/Cas9 ingezet werd voor de identificatie van potentieel nieuwe therapeutische doelen in enkele van de meest voorkomende solide tumoren zoals long-, borst-, hersen-, lever- en colorectaal kanker. We bespreken potentiele kandidaten voor therapie. Omdat deze kandidaten hoog tot expressie komen of zeer actief zijn in diverse kankersoorten, zijn ze het meest eenvoudig te remmen. We laten zien dat diverse therapeutische targets, zoals
CD38, CXCR2, MASTL en RBX2 als ook een aantal non-coding (nc) RNAs zijn geïdentificeerd met
behulp van de CRISPR/Cas9 technologie4.
In hoofdstuk 3 wordt de relevantie van het CRISPR/Cas9 systeem met betrekking tot het begrijpen van geneesmiddelresistentie en de identificatie van resistentie-gerelateerde genen zoals PBRM1, SLFN11 en ATPE1 in diverse soorten kanker samengevat. Ook geven we een overzicht van onder andere de genen RSF1, CDK5 en SGOL1, waarbij de verstoring hiervan tumoren opnieuw gevoelig kan maken voor onder andere de al beschikbare geneesmiddelen paclitaxel en sorafenib3.
Tyrosine kinase remmers (TKIs) zoals erlotinib, gefitinib en afatinib zijn de meest gebruikte en gerichte middelen bij patiënten met NSCLC met bepaalde mutaties in EGFR5. Het is echter onvermijdelijk dat bijna alle patiënten die met TKIs behandeld worden resistentie ontwikkelen binnen 9-13 maanden na de start van de behandeling5,6. De mechanismen achter EGFR-TKI resistentie in NSCLC zijn zeer complex. Om meer te weten te komen over EGFR gerichte resistentie focussen we ons in hoofdstuk 4 op het karakteriseren van NSCLC cellen waarbij EGFR is uitgeschakeld met behulp van CRISPR/Cas9. Ook onderzoeken we het gedrag van andere receptoren die behoren bij de Her-familie na EGFR uitschakeling of resistentie. We hebben duidelijk en verrassend gedrag waargenomen bij cellen waarbij het gemuteerde EGFR uitgeschakeld werd ten op zichte van cellen waarbij wild type EGFR werd uitgeschakeld. We
251 zagen een verschil in o.a. cel proliferatie, cel migratie en in downstream signaalroutes. Onze bevindingen laten zien dat HER2 en HER3 overexpressie en de transcriptionele activiteit van cyclin D1 een mechanisme is van TKI verworven resistentie in NSCLC.
Voor patiënten met NSCLC met KRAS-gerelateerde niet-kleincellige longkanker bestaat nog geen effectief gerichte behandeling1. In hoofdstuk 5 hebben we een EGFR knock-out onderzocht als mogelijke therapie. We deden dit in zowel een wild type als in KRAS-gemuteerde longkanker cellen7. Voor zover wij weten is dit de eerste studie waarin aangetoond werd dat wild type EGFR een belangrijke rol speelt in de groei van KRAS-afhankelijke tumor cellen. We lieten zien dat de overexpressie van CXCR7 een bypass mechanisme is in EGFR-/- cellen door het stimuleren van de MAPK signalering. Zowel EGFR als CXCR7 remming lieten een synergetische onderdrukking van de tumorgroei zien. Verder hebben we aangetoond dat de hoeveelheid CXCR7 was toegenomen in EGFRwt, maar juist was afgenomen in EGFRmut cellijnen na behandeling met gefitinib. We lieten ook zien dat de expressie van CXCR7 hoger is in NSCLC patiënten met adenocarcinoma (ADC) vergeleken met plaveiselcelcarcinoom (SQCC) en gezond longweefsel. Daarom kan een dubbele remming van zowel EGFR als CXCR7 een mogelijke behandelingsstrategie zijn voor patiënten met NSCLC.
Omdat EGFR een significante rol speelt in verschillende typen tumoren, focussen we ons op de targeting van EGFR maar breiden we ons studie uit van longkanker naar niercelkanker8,9 (RCC). In hoofdstuk 6 onderzoeken we of een EGFR knock-out in combinatie met diverse kleine moleculaire remmers of therapeutische eiwitten (TRAIL) gebruikt kunnen worden als een therapeutische benadering voor RCC. We lieten zien dat een verstoring van tot overexpressie gebrachte EGFR de proliferatie van cellen dramatisch remt en ze laat stilstaan op het G2/M checkpoint tijdens de celdeling. Verder vonden we dat de remming van de PDGFR en VEGFR door sunitinib de expressie van pERK1/2 en pAKT, geïnduceerd door het verlies van EGFR, kan afzwakken. Oftewel, ablatie van een tot over expressie gebrachte EGFR door CRISPR/Cas9 al dan niet gecombineerd met sunitinib kan een optie zijn voor de behandeling van niercelkanker.
250
te variëren via aanpassingen in de activiteit van bepaalde enzymen, de zogenaamde HATs en HDACs
In hoofdstuk 2 worden de toepassingen van CRISPR/Cas9 bij de ontdekking van nieuwe aangrijpingspunten voor de behandeling van kanker uitvoerig besproken. We geven een overzicht van studies waarbij CRISPR/Cas9 ingezet werd voor de identificatie van potentieel nieuwe therapeutische doelen in enkele van de meest voorkomende solide tumoren zoals long-, borst-, hersen-, lever- en colorectaal kanker. We bespreken potentiele kandidaten voor therapie. Omdat deze kandidaten hoog tot expressie komen of zeer actief zijn in diverse kankersoorten, zijn ze het meest eenvoudig te remmen. We laten zien dat diverse therapeutische targets, zoals
CD38, CXCR2, MASTL en RBX2 als ook een aantal non-coding (nc) RNAs zijn geïdentificeerd met
behulp van de CRISPR/Cas9 technologie4.
In hoofdstuk 3 wordt de relevantie van het CRISPR/Cas9 systeem met betrekking tot het begrijpen van geneesmiddelresistentie en de identificatie van resistentie-gerelateerde genen zoals PBRM1, SLFN11 en ATPE1 in diverse soorten kanker samengevat. Ook geven we een overzicht van onder andere de genen RSF1, CDK5 en SGOL1, waarbij de verstoring hiervan tumoren opnieuw gevoelig kan maken voor onder andere de al beschikbare geneesmiddelen paclitaxel en sorafenib3.
Tyrosine kinase remmers (TKIs) zoals erlotinib, gefitinib en afatinib zijn de meest gebruikte en gerichte middelen bij patiënten met NSCLC met bepaalde mutaties in EGFR5. Het is echter onvermijdelijk dat bijna alle patiënten die met TKIs behandeld worden resistentie ontwikkelen binnen 9-13 maanden na de start van de behandeling5,6. De mechanismen achter EGFR-TKI resistentie in NSCLC zijn zeer complex. Om meer te weten te komen over EGFR gerichte resistentie focussen we ons in hoofdstuk 4 op het karakteriseren van NSCLC cellen waarbij EGFR is uitgeschakeld met behulp van CRISPR/Cas9. Ook onderzoeken we het gedrag van andere receptoren die behoren bij de Her-familie na EGFR uitschakeling of resistentie. We hebben duidelijk en verrassend gedrag waargenomen bij cellen waarbij het gemuteerde EGFR uitgeschakeld werd ten op zichte van cellen waarbij wild type EGFR werd uitgeschakeld. We
251 zagen een verschil in o.a. cel proliferatie, cel migratie en in downstream signaalroutes. Onze bevindingen laten zien dat HER2 en HER3 overexpressie en de transcriptionele activiteit van cyclin D1 een mechanisme is van TKI verworven resistentie in NSCLC.
Voor patiënten met NSCLC met KRAS-gerelateerde niet-kleincellige longkanker bestaat nog geen effectief gerichte behandeling1. In hoofdstuk 5 hebben we een EGFR knock-out onderzocht als mogelijke therapie. We deden dit in zowel een wild type als in KRAS-gemuteerde longkanker cellen7. Voor zover wij weten is dit de eerste studie waarin aangetoond werd dat wild type EGFR een belangrijke rol speelt in de groei van KRAS-afhankelijke tumor cellen. We lieten zien dat de overexpressie van CXCR7 een bypass mechanisme is in EGFR-/- cellen door het stimuleren van de MAPK signalering. Zowel EGFR als CXCR7 remming lieten een synergetische onderdrukking van de tumorgroei zien. Verder hebben we aangetoond dat de hoeveelheid CXCR7 was toegenomen in EGFRwt, maar juist was afgenomen in EGFRmut cellijnen na behandeling met gefitinib. We lieten ook zien dat de expressie van CXCR7 hoger is in NSCLC patiënten met adenocarcinoma (ADC) vergeleken met plaveiselcelcarcinoom (SQCC) en gezond longweefsel. Daarom kan een dubbele remming van zowel EGFR als CXCR7 een mogelijke behandelingsstrategie zijn voor patiënten met NSCLC.
Omdat EGFR een significante rol speelt in verschillende typen tumoren, focussen we ons op de targeting van EGFR maar breiden we ons studie uit van longkanker naar niercelkanker8,9 (RCC). In hoofdstuk 6 onderzoeken we of een EGFR knock-out in combinatie met diverse kleine moleculaire remmers of therapeutische eiwitten (TRAIL) gebruikt kunnen worden als een therapeutische benadering voor RCC. We lieten zien dat een verstoring van tot overexpressie gebrachte EGFR de proliferatie van cellen dramatisch remt en ze laat stilstaan op het G2/M checkpoint tijdens de celdeling. Verder vonden we dat de remming van de PDGFR en VEGFR door sunitinib de expressie van pERK1/2 en pAKT, geïnduceerd door het verlies van EGFR, kan afzwakken. Oftewel, ablatie van een tot over expressie gebrachte EGFR door CRISPR/Cas9 al dan niet gecombineerd met sunitinib kan een optie zijn voor de behandeling van niercelkanker.
252
Ondanks de snelle ontwikkeling van de CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-editing technologie wordt zijn potentieel verminderd door een lage efficiëntie, in het bijzonder bij kanker gentherapie10,11. In hoofdstuk 7 hebben we de invloed van HDACs en HATs op CRISPR/Cas9
gemedieerde gen-editing uitgebreid onderzocht. We vonden dat Entinostat (een HDAC1/2/3 remmer) en Panobinostat (pan-HDAC remmer) de activiteit van CRISPR-Cas9 gen-editing verhoogden terwijl andere remmers (van HDAC4/5/6/7/8/9) dat niet deden. Ook vonden we dat RGFP966 (specifieke HDAC3 remmer) de gen-editing activiteit van CRISPR/Cas9 verminderde, welke daarom gebruikt zou kunnen worden voor de downregulatie van CRISPR/Cas9. Belangrijk is dat Entinostat en Panobinostat de knock-in frequentie verhoogden. Dit werd bevestigd door de knock-out van HDAC1, HDAC2 en HDAC3. Daarnaast ontdekten we dat de remming van HDACs (door Entinostat en Panobinostat) de toegang van Cas9 tot het target DNA faciliteert en daar het aantal breuken in het DNA verhoogt. Onze studie laat de essentiële rol van HDACs in CRISPR/Cas9 gemedieerde gen-editing zien. We tonen aan dat het haalbaar is om de efficiëntie van CRISPR/Cas9 te moduleren door middel van het veranderen van de HDAC activiteit. Deze methode zou ook op grote schaal toegepast kunnen worden voor het reguleren van andere nuclease (ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 en dCas9) gemedieerde genoom en epigenoom bewerkingen.
Toekomstperspectieven
In dit proefschrift wilden we de CRISPR/Cas9 technologie gebruiken voor onderzoek naar kanker en wilden we de activiteit van CRISPR/Cas9 verbeteren voor kankertherapie. We focusten ons op de EGFR targeting door CRISPR/Cas9 en vergeleken dit met behandeling met EGFR-TKi. We ontdekten drie compenserende of alternatieve mechanismen in EGFR targeting: HER2/3 overexpressie en verhoogde transcriptionele activiteit van Cyclin D1 (Hoofdstuk 4), CXCR7 overexpressie (Hoofdstuk 5) en vEGFR en PDGFR activatie (Hoofdstuk 6).
Hoewel de ablatie van EGFR door CRISPR/Cas9 de behandeling met EGFR-TKIs in sommige aspecten kan nabootsen verschillen deze twee van elkaar. Aangezien EGFR-TKIs alleen de tyrosine kinase activiteit van EGFR remmen, blijven de overige functies van EGFR actief of
253
worden zelfs actiever12. Hoewel een knock-out van EGFR door CRISPR/Cas9 alle functies van
EGFR verwijderd, kan het leiden tot de activering van alternatieve routes7,13. Toekomstige
studies zijn nodig om het verschil en de correlatie tussen knock-out en remming op te helderen. Nieuw onderzoek naar verandering van transcriptoom- en proteoomniveaus na verlies van EGFR moet hierin meer inzicht geven.
In hoofdstuk 5 toonde onze data specifiek aan dat EGF nog steeds pAkt kan stimuleren in EGFR
-/- cellen. Deze waarneming geeft aan dat EGF-geinduceerde fosforylatie van Akt mogelijk
afhankelijk is van EGFR, hetgeen zover ons bekend nog niet eerder is gerapporteerd. Een hypothese is dat EGF pAKT stimuleert via CXCR7, aangezien andere studies hebben laten zien dat CXCR7 geassocieerde routes pAKT fosforylatie kunnen induceren14,15en omdat wij hebben waargenomen dat CXCR7 tot overexpressie wordt gebracht in EGFR-/-A549 cellen7. Bovendien
heeft een recente studie aangetoond dat de activatie van Akt gerelateerd is aan de EGFR gemedieerde geneesmiddelenresistentie bij longkanker16. Opgemerkt moet worden dat een studie rapporteerde dat MIF O-GlcNAcylated MIF aan EGFR bindt17. Andere onderzoeken tonen
aan dat MIF een ligand is van CXCR715,18. Alles bij elkaar is het redelijk te speculeren dat EGF of
DDT (MIF2) een ligand is voor CXCR7. Gezien het belang van deze interacties is er meer onderzoek nodig om de “cross-talk” tussen EGFR, CXCR7 en zijn liganden (EGF, DDT , MIF en anderen) te onderzoeken (Figuur 1).
252
Ondanks de snelle ontwikkeling van de CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-editing technologie wordt zijn potentieel verminderd door een lage efficiëntie, in het bijzonder bij kanker gentherapie10,11. In hoofdstuk 7 hebben we de invloed van HDACs en HATs op CRISPR/Cas9
gemedieerde gen-editing uitgebreid onderzocht. We vonden dat Entinostat (een HDAC1/2/3 remmer) en Panobinostat (pan-HDAC remmer) de activiteit van CRISPR-Cas9 gen-editing verhoogden terwijl andere remmers (van HDAC4/5/6/7/8/9) dat niet deden. Ook vonden we dat RGFP966 (specifieke HDAC3 remmer) de gen-editing activiteit van CRISPR/Cas9 verminderde, welke daarom gebruikt zou kunnen worden voor de downregulatie van CRISPR/Cas9. Belangrijk is dat Entinostat en Panobinostat de knock-in frequentie verhoogden. Dit werd bevestigd door de knock-out van HDAC1, HDAC2 en HDAC3. Daarnaast ontdekten we dat de remming van HDACs (door Entinostat en Panobinostat) de toegang van Cas9 tot het target DNA faciliteert en daar het aantal breuken in het DNA verhoogt. Onze studie laat de essentiële rol van HDACs in CRISPR/Cas9 gemedieerde gen-editing zien. We tonen aan dat het haalbaar is om de efficiëntie van CRISPR/Cas9 te moduleren door middel van het veranderen van de HDAC activiteit. Deze methode zou ook op grote schaal toegepast kunnen worden voor het reguleren van andere nuclease (ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9 en dCas9) gemedieerde genoom en epigenoom bewerkingen.
Toekomstperspectieven
In dit proefschrift wilden we de CRISPR/Cas9 technologie gebruiken voor onderzoek naar kanker en wilden we de activiteit van CRISPR/Cas9 verbeteren voor kankertherapie. We focusten ons op de EGFR targeting door CRISPR/Cas9 en vergeleken dit met behandeling met EGFR-TKi. We ontdekten drie compenserende of alternatieve mechanismen in EGFR targeting: HER2/3 overexpressie en verhoogde transcriptionele activiteit van Cyclin D1 (Hoofdstuk 4), CXCR7 overexpressie (Hoofdstuk 5) en vEGFR en PDGFR activatie (Hoofdstuk 6).
Hoewel de ablatie van EGFR door CRISPR/Cas9 de behandeling met EGFR-TKIs in sommige aspecten kan nabootsen verschillen deze twee van elkaar. Aangezien EGFR-TKIs alleen de tyrosine kinase activiteit van EGFR remmen, blijven de overige functies van EGFR actief of
253
worden zelfs actiever12. Hoewel een knock-out van EGFR door CRISPR/Cas9 alle functies van
EGFR verwijderd, kan het leiden tot de activering van alternatieve routes7,13. Toekomstige
studies zijn nodig om het verschil en de correlatie tussen knock-out en remming op te helderen. Nieuw onderzoek naar verandering van transcriptoom- en proteoomniveaus na verlies van EGFR moet hierin meer inzicht geven.
In hoofdstuk 5 toonde onze data specifiek aan dat EGF nog steeds pAkt kan stimuleren in EGFR
-/- cellen. Deze waarneming geeft aan dat EGF-geinduceerde fosforylatie van Akt mogelijk
afhankelijk is van EGFR, hetgeen zover ons bekend nog niet eerder is gerapporteerd. Een hypothese is dat EGF pAKT stimuleert via CXCR7, aangezien andere studies hebben laten zien dat CXCR7 geassocieerde routes pAKT fosforylatie kunnen induceren14,15en omdat wij hebben waargenomen dat CXCR7 tot overexpressie wordt gebracht in EGFR-/-A549 cellen7. Bovendien
heeft een recente studie aangetoond dat de activatie van Akt gerelateerd is aan de EGFR gemedieerde geneesmiddelenresistentie bij longkanker16. Opgemerkt moet worden dat een studie rapporteerde dat MIF O-GlcNAcylated MIF aan EGFR bindt17. Andere onderzoeken tonen
aan dat MIF een ligand is van CXCR715,18. Alles bij elkaar is het redelijk te speculeren dat EGF of
DDT (MIF2) een ligand is voor CXCR7. Gezien het belang van deze interacties is er meer onderzoek nodig om de “cross-talk” tussen EGFR, CXCR7 en zijn liganden (EGF, DDT , MIF en anderen) te onderzoeken (Figuur 1).
254
Figuur 1 Een mogelijk “cross-talk” model tussen EGFR, CXCR7 en zijn liganden
We hebben een platform opgezet voor de screening van kleine moleculaire verbindingen die de activiteit van CRISPR/Cas9 verhogen of verlagen (Hoofdstuk 7). Met behulp van dit platform bieden we een praktische oplossing voor het verhogen van de gen-editing efficiëntie via de de-condensatie van het chromatine door middel van HDAC remming. Bovendien geeft onze studie een beter begrip van het proces van gen-editing door de toegankelijkheid van het DNA met behulp van histon acetylatie en histon deacetylatie te veranderen. Dit platform kan voor vervolg studies op grote schaal worden gebruikt voor de screening van versterkers en remmers van nuclease gemedieerde gen-editing (Figuur 2).
Figuur 2 Een kort overzicht van de workflow van een “high-troughput” screening voor de
regulatie van CRISPR/Cas9 gemedieerde genoom editing.
This Dutch summary was kindly provided by Petra. E. Ettema and Martijn Zwinderman.
254
Figuur 1 Een mogelijk “cross-talk” model tussen EGFR, CXCR7 en zijn liganden
We hebben een platform opgezet voor de screening van kleine moleculaire verbindingen die de activiteit van CRISPR/Cas9 verhogen of verlagen (Hoofdstuk 7). Met behulp van dit platform bieden we een praktische oplossing voor het verhogen van de gen-editing efficiëntie via de de-condensatie van het chromatine door middel van HDAC remming. Bovendien geeft onze studie een beter begrip van het proces van gen-editing door de toegankelijkheid van het DNA met behulp van histon acetylatie en histon deacetylatie te veranderen. Dit platform kan voor vervolg studies op grote schaal worden gebruikt voor de screening van versterkers en remmers van nuclease gemedieerde gen-editing (Figuur 2).
Figuur 2 Een kort overzicht van de workflow van een “high-troughput” screening voor de
regulatie van CRISPR/Cas9 gemedieerde genoom editing.
This Dutch summary was kindly provided by Petra. E. Ettema and Martijn Zwinderman.
256 257
