Valideren van automatische diskdiffusie methode voor Gram-positieve kokken

Valideren van automatische

diskdiffusie methode voor

Gram-positieve kokken

Door middel van WASP/WASPlab in combinatie met

Adagio software

Suzanne van Geloven

06-01-2017

Valideren van automatische

diskdiffusie methode voor

Gram-positieve kokken

Student: Suzanne van Geloven Studentnummer: 2063332

Opleiding: Biologie en Medisch Laboratorium onderzoek

Faculteit: Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Onderwijsinstelling: Avans Hogeschool

Afstudeerbegeleider: Nicole van den Braak Stage bedrijf: Stichting PAMM

Afdeling: Bacteriologie

Bedrijfsbegeleiders: Jitske Stalpers en Niek Arents Plaats en datum: Breda, 6 januari 2017

Versie: 1

Voorwoord

Bij Stichting PAMM (laboratorium voor Pathologie en Medische Microbiologie) te Veldhoven heb ik de kans gekregen om mijn opleiding af te ronden met een afstudeerstage. Tijdens mijn afstudeerstage ben ik bij PAMM begeleid door Jitske Stalpers en Niek Arents. Via Avans Hogeschool ben ik gedurende deze periode begeleid door Nicole van den Braak. Deze drie personen wil ik bedanken voor de begeleiding en goede ondersteuning. Het was een leuke en leerzame afstudeerstage!

Samenvatting

Bij Stichting PAMM (laboratorium voor Pathologie en Medische Microbiologie) op de afdeling Bacteriologie komen dagelijks patiënten materialen binnen. Op het laboratorium worden vervolgens bacteriën uit de patiënten materialen geïsoleerd. Indien nodig kan een gevoeligheidsbepaling worden ingezet om te bepalen welke antibiotica geschikt zijn voor de behandeling van de pathogeen.

Gevoeligheidsbepalingen die bij de PAMM worden ingezet zijn Vitek®2, diskdiffusie die met de hand wordt ingezet en meervaksplaten volgens European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) richtlijnen. Deze drie methodes vormen de gouden standaard in dit onderzoek. Echter zijn de reagens kaarten van Vitek®2 prijzig en de diskdiffusie die met de hand wordt ingezet is niet consequent doordat de diameters anders kunnen worden afgelezen per labanalist. Vandaar dat in dit onderzoek een nieuwe goedkopere methode wordt gevalideerd. Deze methode kan de gevoeligheidsbepalingen automatiseren, namelijk de Walk Away Specimen Processor (WASP) in combinatie met Adagio software volgens EUCAST richtlijnen. Tevens vermindert het automatiseren de tijd voor het aflezen van de diameters, waardoor ook kosten worden bespaard.

WASP/Adagio is gebaseerd op automatische diskdiffusie methode welke door WASP/WASPlab kan worden ingezet. Na incubatie maakt WASPlab een foto van de MH agar waarbij Adagio software de remmingzones bepaald. De diameters van de remmingzones worden met EUCAST breekpunten of in sommige gevallen CLSI breekpunten omgezet naar gevoeligheidsinterpretaties.

Voor de validatie van WASP/Adagio worden Gram-positieve kokken (stafylokokken en enterokokken) getest die voornamelijk zijn geïsoleerd uit urinekweken ingestuurd door huisartsen. Het verschilt per bacteriegroep welke antibiotica zijn getest voor WASP/Adagio op een Mueller-Hinton (MH) agar. Er zijn in totaal 300 stammen getest, waarvan 150 stafylokokken en 150 enterokokken.

De gevoeligheidsbepalingen werden vergeleken tussen de gouden standaard en WASP/Adagio. Het gemiddelde overeenkomstpercentage bij stafylokokken was hier 96,6%. Bij enterokokken was het gemiddelde overeenkomstpercentage 88%. Indien nodig konden de remmingzones, bepaald door Adagio, handmatig worden aangepast in Total Laboratory Automation (TLA). Wanneer dit werd gedaan en vergeleken met de gouden standaard was het overeenkomstpercentage voor de stafylokokken hetzelfde gebleven. Bij de enterokokken werd het overeenkomstpercentage 95,5%. Daarnaast waren de verkregen gevoeligheidsinterpretaties vergeleken tussen WASP/Adagio en handmatige aflezing van de remmingzones van de MH agar ingezet door WASP/WASPlab. Het gemiddelde overeenkomstpercentage voor stafylokokken was hier 99,1% en bij enterokokken 88%. Indien hierbij de gevoeligheidsinterpretaties werden vergeleken na het handmatig aanpassen van de remmingzones in TLA was het gemiddelde overeenkomstpercentage voor stafylokokken 99,6%. Bij de enterokokken werd het gemiddelde overeenkomstpercentage 97,2%. Stafylokokken hadden een hoog gemiddeld overeenkomstpercentage tussen de vergeleken methodes. Daarnaast was er een minimaal verschil tussen de gemiddelde overeenkomstpercentages met of zonder handmatige aanpassing van de remmingzones in TLA. Daarnaast moet bij stafylokokken een 8-disk dispenser van WASP worden gebruikt voor het betrouwbaar detecteren van clindamycine inductie dat wordt veroorzaakt door erythromycine. Tevens zou in de toekomst een PCR techniek kunnen worden opgezet voor stafylokokken die zijn getest met WASP/Adagio en eventueel in het bezit kunnen zijn van het macroliden, lincosamiden en streptogramines B (MLSB)fenotype. Bij enterokokken moesten vaak de

remmingzones van nitrofurantoïne in TLA handmatig worden aangepast. Vandaar dat wordt aangeraden om nitrofurantoïne niet in de dagelijkse diagnostiek van PAMM te testen met

WASP/Adagio. Daarnaast moet bij enterokokken de breekpunten van fosfomycine trometamol alleen worden toegepast bij Enterococus faecalis en niet bij Enterococcus faecium.

Abstract

On a daily base the department Bacteriology of PAMM (Laboratory of Pathology and Medical Microbiology) receives samples of patients. At the lab, bacteria are isolated from the samples and if necessary a antimicrobial susceptibility test (AST) can be performed. A AST can determine which antibiotics are proper to treat the pathogen. In the routine of PAMM the following methods are used for AST namely Vitek®2, manual disk diffusion and agar dilution which are performed according to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) guidelines. However, the tests for Vitek®2 are quite expensive. Beside, the manual disk diffusion method is not consistent, because each analyst at the lab can read the diameter of the zone of inhibition differently. Thence a newer and cheaper method will be validated which will automate AST known as Walk Away Specimen Processor (WASP) combined with Adagio software according to EUCAST guidelines. In addition, automating the method reduces the time for reading of the diameters, which also saves costs. WASP/Adagio is based on automated disk diffusion which is performed by WASP/WASPlab. After incubation, WASPlab takes a picture which is used by Adagio software to determine the zones of inhibition. The diameters of the zones of inhibition are converted to susceptibility interpretations according to EUCAST breakpoints or in some cases Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) breakpoints.

For the validation of WASP/Adagio, Gram-positive bacteria (staphylococci and enterococci) are tested which are mainly isolated from urine cultures sent by general practitioners. Theantibiotics which are tested in this research on a Mueller-Hinton agar differs between staphylococci and enterococci. A total of 300 bacterial strains were tested, subdivided in 150 staphylococci and 150 enterococci. After performing automated disk diffusion, the susceptibility interpretations were compared between the routine methods and WASP/Adagio.

Herewith the average similarity rate of staphylococci was 96,6%. Enterococci had a average similarity rate of 88%. If necessary the zones of inhibition determined by Adagio software could be manually adjusted in Total Laboratory Automation (TLA). When this was done and compared to the routine methods the average similarity rate remained the same for staphylococci. The average similarity rate for enterococci altered to 95,5%.

Beside the determination of the zones of inhibition by Adagio software, the diameters were also determined manually of the WASP/Adagio plates. When this was done and compared with WASP/Adagio the average similarity rate for staphylococci was 99,1% and 88% for enterococci. Beside, the interpretations of susceptibility are compared between WASP/Adagio, after the manual adjustment of the zones of inhibition in TLA, and the manual reading of WASP/Adagio plates. Hereby the average similarity rate for staphylococci was 99,6% and 97,2% for enterococci.

Staphylococci had high average similarity rates between the compared methods. Besides, there was a small difference in similarity rates with or without manual adjustments of the zones of inhibition in TLA. In addition, staphylococci need the WASP 8-disk dispenser for reliable detection of clindamycin induction caused by erythromycin.

In the future it could be an option to set up a PCR technique for staphylococci which are tested with WASP/Adagio and could be in the possession of the macrolides, lincosamides and streptogramins B (MLSB) phenotype. During this research the zones of inhibition of nitrofurantoin for enterococci were

WASP/Adagio. Beside, the breakpoints of fosfomycin trometamol for enterococci should be only used for Enterococcus faecalis.

Inhoudsopgave

2.2.1 Vancomycine resistente enterokokken...10

2.3 Antibiotica...10

2.3.1 Remming van de celwandsynthese...11

2.3.2 Remming van de nucleïnezuursynthese...12

2.3.3 Remming van de foliumzuursynthese...13

2.3.4 Remming van de eiwitsynthese...13

2.4 Resistentie...14 2.4.1 Natuurlijke resistentie...14 2.4.2 Verworven resistentie...15 2.5 EUCAST...15 2.6 CLSI...16 2.7 Diskdiffusie...16 2.8 Meervaksplaten...17 2.9 Epsilometer test...17 2.10 Vitek®2...17

2.11 Walk Away Specimen Processor Laboratory...18

2.12 Adagio...19

3 Materiaal en methoden...20

4 Resultaten...23

4.1 Vergelijking van de gouden standaard met WASP/Adagio...23

4.1.1 Vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties tussen Vitek®2 en Adagio bij stafylokokken...23

4.1.2 Vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties tussen meervaksplaten of met de hand ingezette diskdiffusie en Adagio bij enterokokken...26

4.2.1 Vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties tussen Adagio en de handmatige aflezing bij de

door WASP geënte plaat voor stafylokokken...28

4.2.2 Vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties tussen Adagio en de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat voor enterokokken...28

5 Discussie...30

6 Conclusie...33

7 Aanbevelingen...33

8 Bibliografie...34

Bijlage I: EUCAST breekpunten van de geteste antibiotica...40

Bijlage II: CLSI breekpunten van de geteste antibiotica...41

Bijlage III: Vergelijking van Vitek®2 en WASP/Adagio bij stafylokokken...42

Bijlage IV: Vergelijking van meervaksplaten of met de hand ingezette diskdiffusie en WASP/Adagio bij enterokokken...44

Bijlage V: Vergelijking van WASP/Adagio en de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat bij stafylokokken...47

Bijlage VI: Vergelijking van WASP/Adagio en de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat bij enterokokken...49

Bijlage VII: Overige grafieken stafylokokken...51

1 Inleiding

Bij Stichting PAMM (laboratorium voor Pathologie en Medische Microbiologie) komen dagelijks patiënten materialen binnen. Uit deze kweken worden bacteriën geïsoleerd en indien nodig wordt een gevoeligheidsbepaling ingezet. De gevoeligheidsbepaling bepaald welke antibiotica geschikt zijn voor de behandeling van de bacteriële infectie bij de patiënt.

Bij de bacteriën wordt onderscheid gemaakt tussen Gram-positieve- en Gram-negatieve bacteriën, vanwege het verschil in celwand/ celmembraan structuur. Hierdoor is ook een verschil in het behandelen van bacteriële infecties, aangezien iedere antibioticagroep een andere

werkingsmechanisme heeft. Door de andere werkingsmechanismen verschilt het per bacteriegroep welke antibiotica effectief zijn [ CITATION Mad \l 1043 ]. Momenteel worden in de dagelijkse

diagnostiek onderzoeken bij PAMM de gevoeligheidsbepalingen ingezet met Vitek®2, diskdiffusie die met de hand wordt ingezet en/of meervaksplaten volgens European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Deze drie methoden vormen de gouden standaard in dit onderzoek. Echter zijn de reagens kaarten voor Vitek®2 prijzig. Daarnaast kan het verschillen hoe de diameter van een remmingzone wordt afgelezen per labanalist indien een diskdiffusie met de hand is ingezet. Vandaar dat PAMM op zoek is naar een goedkopere methode die gevoeligheidsbepalingen kan automatiseren. In dit onderzoek wordt de Walk Away Specimen Processor (WASP) in combinatie met Adagio software gevalideerd volgens EUCAST richtlijnen. De WASP kan automatisch diskdiffusie inzetten en met behulp van Adagio software worden de remmingzones automatisch afgelezen. Daarnaast is diskdiffusie een stuk goedkoper vergeleken met Vitek®2 reagens kaarten. Tevens zou de invoering van WASP/Adagio in de dagelijkse diagnostiek van PAMM veel tijd besparen voor de analisten met het aflezen van de remmingzones, waardoor kosten worden bespaard.

In een voorafgaand onderzoek bij PAMM is WASP in combinatie met Adagio software gevalideerd met Gram-negatieve bacteriën. Vanwege goed resultaat wordt in dit onderzoek de validatie van

WASP/Adagio uitgebreid met Gram-positieve bacteriën.

Het doel van dit onderzoek is om de gevoeligheidsbepalingen van Gram-positieve bacteriën, voornamelijk geïsoleerd uit urinekweken ingestuurd door huisartsen, te testen met WASP/Adagio volgens EUCAST richtlijnen. Daarbij is ook de verwachting dat deze nieuwe methode nauwelijks afwijkt van de gouden standaard en in de toekomst in de dagelijkse diagnostiek van PAMM kan worden toegepast. Om de automatische diskdiffusie methode te valideren, worden 300 stammen uit de dagelijkse diagnostiek verzameld en onderzocht zodat een betrouwbaar resultaat kan ontstaan. De 300 stammen zijn onderverdeeld in twee bacteriegroepen, namelijk stafylokokken en enterokokken. Voor deze twee groepen is gekozen, omdat deze bacteriën goed groeien op een Mueller-Hinton (MH) agar die wordt ingezet met diskdiffusie [ CITATION Ven \l 1043 ]. Van beide bacteriegroepen worden 150 stammen getest. Bij stafylokokken worden vijf verschillende antibiotica getest en bij

enterokokken zes verschillende antibiotica. De verkregen gevoeligheidinterpretaties bij WASP/Adagio worden vergeleken met de resultaten bij de gouden standaard. De gouden standaard verschilt per bacteriegroep. Bij stafylokokken wordt momenteel Vitek®2 toegepast in de dagelijkse diagnostiek en bij enterokokken de meervaksplaten en/of diskdiffusie die met de hand wordt ingezet. Naast deze vergelijking worden ook de resultaten van WASP/Adagio vergeleken met de handmatige aflezing van de remmingzones van de MH agar die zijn ingezet door WASP/WASPlab.

In hoofdstuk twee wordt de theoretische achtergrond van dit onderzoek beschreven en in hoofdstuk drie de uitvoering van het onderzoek. In hoofdstuk vier volgen de resultaten die tijdens de uitvoering

zijn verkregen. In hoofdstuk vijf, zes en zeven volgen de discussie, conclusie en aanbevelingen van dit onderzoek. De literatuurlijst is verwerkt in hoofdstuk acht. Tot slot volgen de bijlagen.

2 Theoretische achtergrond

Hier wordt beschreven welke twee bacteriegroepen worden getest voor dit onderzoek. Vervolgens worden verschillende antibiotica beschreven die van toepassing zijn in dit onderzoek met daarbij de werkingsmechanismen en resistentiemechanismen van antibiotica en bacteriën. Daarna volgen verschillende methodes om de gevoeligheid van bacteriën voor antibiotica te kunnen bepalen die worden uitgevoerd volgens EUCAST richtlijnen.

2.1 Stafylokokken

Stafylokokken behoren tot Gram-positieve bacteriën en zijn onder te verdelen in coagulase-negatieve stafylokokken (CNS) en coagulase-positieve stafylokokken. De twee groepen worden van elkaar onderscheiden door aan- of afwezigheid van het enzym coagulase [ CITATION Ken12 \l 1043 ] [ CITATION Mic10 \l 1043 ]. Stafylokokken behoren tot de normale huidflora van de mens en slijmvliezen. Hierdoor worden stafylokokken vaak geassocieerd met opportunistische infecties[ CITATION Bha16 \l 1043 ][ CITATION Cui15 \l 1043 ].

CNS zijn onder andere Staphylococcus capitis (S. capitis), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis),

Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), Staphylococcus lugdunensis (S. lugdunensis) en Staphylococcus hominis (S. hominis) [ CITATION Cui13 \l 1043 ] [ CITATION McD10 \l 1043 ] [ CITATION

Jia12 \l 1043 ][ CITATION Raz05 \l 1043 ] [ CITATION Böc09 \l 1043 ].

Staphylococcus aureus (S. aureus) is een coagulase-positieve stafylokok en is de meest pathogene

soort bij mensen, waardoor het in staat is om verschillende infecties te veroorzaken.

2.1.1 Methicilline-resistente S. aureus

Methicilline-gevoelige S. aureus (MSSA) verandert naar methicilline-resistente S. aureus (MRSA) door horizontale gen overdracht van de Staphylococcal Cassette Chromosoom mec (SCCmec). SCCmec valt onder ‘mobile genetic elements’ (MGE) welke kleine, losse DNA sequenties zijn die op willekeurige plekken kunnen repliceren en invoegen in chromosomen. In dit geval wordt SCCmec ingevoegd in de staphylococcal chromosoom met behulp van het cassette chromosoom recombinase complex (ccr complex)[ CITATION Zon10 \l 1043 ][ CITATION Ito13 \l 1043 ].

SCCmec bevat onder andere het mecA gen welke codeert voor een penicillinebindend eiwit, PBP2A, welke een lage affiniteit heeft voor beta-lactam antibiotica. Door de lage affiniteit van PBP2A ontstaat er resistentie voor methicilline en bijna alle β-lactam antibiotica [ CITATION Sho13 \l 1043 ][ CITATION Wie02 \l 1043 ].

Om erachter te komen of er sprake is van een MRSA kan een cefoxitin (screen) worden uitgevoerd. Deze screening kan worden uitgevoerd met diskdiffusie (zie paragraaf 2.7) of Vitek®2 (zie paragraaf 2.10). Indien S. aureus resistent is geïnterpreteerd voor cefoxitin beschikt de stam over het mecA gen, waardoor er sprake is van een MRSA [ CITATION Dom \l 1043 ].

2.2 Enterokokken

Enterokokken zijn Gram-positieve bacteriën, waarvan de soorten Enterococcus faecalis (E. faecalis) en

Enterococcus faecium (E. faecium) de grote meerderheid vormen als pathogene bacteriën.

Enterokokken komen van nature voor in het spijsverteringskanaal, maar kunnen onder andere urineweginfecties en bacteriemie veroorzaken, daardoor zijn enterokokken opportunistische pathogene bacteriën.

lage affiniteit hebben voor de penicillines. Indien de E. faecium stam resistent is voor ampicilline wordt meestal vancomycine gebruikt voor de behandeling van de bacteriële infectie. Echter doordat vancomycine regelmatig wordt gebruikt, zijn er tegenwoordig ook enterokokken stammen die resistent zijn voor vancomycine [ CITATION Mad \l 1043 ] [ CITATION Cet00 \l 1043 ].

2.2.1 Vancomycine resistente enterokokken

Bij vancomycine resistente enterokokken (VRE) zijn verschillende typen gekarakteriseerd waaronder vanA en vanB die meestal voorkomen bij E. faecalis en E. faecium. De werkingsmechanismen van verworven glycopeptiden resistentie bij VanA en VanB worden gevonden als een cluster genen, vanA en vanB, gelokaliseerd op een transposon [ CITATION Eli01 \l 1043 ][ CITATION Cet00 \l 1043 ]. Een transposon is een klein segment mobiel DNA dat in staat is om op een willekeurige locatie in te voegen in dezelfde of andere chromosoom [ CITATION Rez03 \l 1043 ]. vanA en vanB genen coderen voor een aangepaste biosynthetische pathway voor de productie van celwand precursors die slecht met vancomycine binden. Bij VanA enterokokken vormen het VanR eiwit (response regulator) en het VanS eiwit (histidine kinase sensor) een regulatiesysteem. De aanwezigheid van onder andere vancomycine veroorzaakt de autofosforylatie van het VanS eiwit, vervolgens gebeurt dit ook met VanR. Daarna bindt het gefosforyleerde VanR eiwit aan de promoter regio van vanHAX, waardoor de expressie wordt verhoogd van vanR en vanS. Door de binding van VanR aan vanHAX vindt er

transcriptie plaats van deze drie genen. Het VanH eiwit zet pyruvaat om naar D-lactaat (D-lac) welke wordt gecombineerd met D-alanine (D-ala) door VanA ligase om zo D-ala-D-lac te creëren.

Vancomycine heeft een lage bindingsaffiniteit met lac. Het VanX eiwit hydrolyseert ala-ala (het normaal gesproken geproduceerde product van ala-ala:ala-ala ligase), waardoor het aantal D-ala-D-ala afneemt die anders de vancomycine-gevoelige peptidoglycaan precursor produceert. De vanB cluster functioneert hetzelfde als de vanA cluster, maar verschilt in de regulatie van de cluster. Bij VanB enterokokken reguleert namelijk alleen vancomycine de inductie van de productie van D-ala-D-lac en de afname van D-ala-D-ala [ CITATION Eli01 \l 1043 ][ CITATION Cet00 \l 1043 ].

2.3 Antibiotica

Antibiotica hebben als functie micro-organismen te remmen in de groei of te doden. Antibiotica kunnen in drie verschillende vormen voorkomen. Dit zijn van nature voorkomende-,

semisynthetische- en synthetische antibiotica. Van nature voorkomende antibiotica worden geproduceerd door micro-organismen zelf ter bescherming tegen andere micro-organismen. Semisynthetische antibiotica zijn van nature voorkomende antibiotica, maar dan kunstmatig

aangepast zodat de effectiviteit wordt verbeterd. Daarnaast kunnen nieuwe synthetische antibiotica worden vervaardigd.

De antibiotica kunnen een breedspectrum of een smalspectrum hebben [ CITATION Mad \l 1043 ]. Breedspectrum antibiotica hebben een werking tegen Gram-negatieve- en Gram-positieve bacteriën. Smalspectrum antibiotica zijn effectief tegen alleen Gram-negatieve- of Gram-positieve bacteriën [ CITATION Har13 \l 1043 ].

In dit onderzoek worden stafylokokken en enterokokken getest voor de validatie van de nieuwe methode. Doordat voornamelijk urinekweken worden meegenomen, is het grootste aantal van de antibiotica in dit onderzoek hierop afgestemd.

Bij een blaasontsteking komt het antibioticum nitrofurantoïne als eerste keus in aanmerking voor de behandeling. Daarnaast kan het antibioticum fosfomycine worden gebruikt voor de behandeling.

Wanneer er sprake is van een urineweginfectie met tekenen van weefselinvasie is de antibioticagroep chinolonen, waaronder ciprofloxacine en norfloxacine, de eerste keus. Daarnaast kan het

antibioticum co-trimoxazole worden gebruikt voor de behandeling [ CITATION Hoo \l 1043 ] [ CITATION Pin \l 1043 ].

Tevens zijn andere patiënten materialen meegenomen in dit onderzoek, vandaar dat hiervoor ook een aantal antibiotica zijn getest. Daarnaast dienen sommige antibiotica voor het aantonen van MRSA- of VRE stammen.

Het antibioticum cefoxitin wordt getest om methicilline resistentie te kunnen aantonen bij stafylokokken stammen [ CITATION Bre \l 1043 ] [ CITATION Euc16 \l 1043 ].

Daarnaast wordt het antibioticum clindamycine getest voor stafylokokken gerelateerde infecties [ CITATION Ray \l 1043 ]. Het is van belang om naast de gevoeligheid van clindamycine ook die van erythromycine te testen. Wanneer een stafylokok stam gevoelig is gemeten voor clindamycine, maar resistent voor erythromycine kan er namelijk sprake zijn van een macroliden, lincosamiden en streptogramines B (MLSB) fenotype. Indien dit het geval is, moet er extra worden opgelet bij de

behandeling van de patiënt met clindamycine. Doordat dit fenotype verantwoordelijk kan zijn voor het falen van de clindamycine behandeling bij de patiënt [ CITATION Sib \l 1043 ] (zie paragraaf 2.3.4 Remming van de eiwitsynthese).

Bij enterokokken kan een VRE stam worden aangetoond door resistent te zijn voor ampicilline en vancomyine [ CITATION Bre1 \l 1043 ]. Het antibioticum tetracycline kan eventueel nog als optie dienen voor de behandeling van VRE stammen [ CITATION Eli \l 1043 ].

Antibiotica kunnen bacteriën op een aantal punten aangrijpen zoals ribosomen, celwand, cytoplasma membraan, lipide biosynthese enzymen, en DNA replicatie- en transcriptie elementen (zie figuur 1) [ CITATION Bai16 \l 1043 ]. Op basis van de moleculaire structuur, werkingsmechanismen en het spectrum van antimicrobiële activiteit worden antibiotica geclassificeerd [ CITATION Mad \l 1043 ]. Hieronder worden de targets van antibiotica beschreven die van toepassing zijn in dit onderzoek.

2.3.1 Remming van de celwandsynthese

De celwand is een essentiële polysaccharide structuur die de meeste bacteriële cellen omringd. De celwand van een bacteriecel beschermt het cytoplasmatisch membraan voor de osmotische druk. De celwand bestaat uit de polymeer peptidoglycaan, welke bestaat uit glycaankettingen met daaraan peptiden. De peptiden worden gebruikt voor de hechting aan de grenzende glycanen om een matrix structuur te kunnen vormen met behulp van het enzym transpeptidase [ CITATION Cho15 \l 1043 ]. Het enzym transpeptidase bindt aan D-ala-D-ala dat resulteert in de reactie waarbij

N-acetylmuraminezuur en N-acetylglucosamine worden gelinked (cross-linking) [ CITATION Chu00 \l 1043 ][ CITATION Amo16 \l 1043 ]. De transpeptidase enzymen kunnen ook binden aan beta-lactam antibiotica en worden daarom ook wel PBE genoemd. Wanneer een PBE bindt met beta-lactam antibiotica kan transpeptidase de cross-linking reactie niet meer katalyseren. De celwandsynthese gaat door zonder het plaatsvinden van cross-linking, waardoor de celwand niet stevig is. Daarbij stimuleert het antibioticum-PBE complex het vrijkomen van autolysines die de bestaande celwand afbreken dat resulteert in een verzwakte celwand. Uiteindelijk zal door de osmotische druk verschillen tussen de binnen- en buitenkant van de cel lysis worden veroorzaakt.

De beta-lactam groep antibiotica remmen de celwandsynthese, die een karakteristieke structurele verbinding delen namelijk de beta-lactam ring. Tot de beta-lactam groep behoren onder andere de medische belangrijke antibioticagroepen penicillines en cephalosporins.

Ampicilline behoort tot de penicillines, is een breedspectrum antibioticum en heeft een bactericide effect[ CITATION Amo16 \l 1043 ] [ CITATION FuQ16 \l 1043 ]. Door het unieke mechanisme van de celwandsynthese bij bacteriën zijn de beta-lactam antibiotica zeer selectief en hierdoor niet toxisch voor de gastheercellen.

Een andere antibioticagroep de glycopeptiden, waaronder vancomycine, binden in tegenstelling tot beta-lactam antibiotica niet aan PBE’s, maar remmen wel de celwandsynthese. Dit komt door de directe binding van vancomycine aan het D-ala-D-ala peptide uiteinde bij de peptidoglycaan precursors dat resulteert in het effectief blokkeren van de transpeptidatie.

Vancomycine behoort tot de smalspectrum antibiotica en heeft een bactericide effect [ CITATION Mad \l 1043 ].

Het antibioticum fosfomycine komt overeen met fosfoenolpyruvaat en remt het enzym enolpyruvaat transferase door er aan te binden. Door deze binding wordt de vorming van N-acetylmuraminezuur, een essentieel element voor de peptidoglycaan celwand, voorkomen. Het verlengen van de

polypeptideketen van de celwand wordt geremd en heeft als gevolg een bactericide effect [ CITATION Gri01 \l 1043 ].

In dit onderzoek wordt fosfomycine trometamol onderzocht, omdat alleen het antibioticum fosfomycine slecht bindt met eiwitten. Vandaar dat fosfomycine, tijdens een behandeling, in combinatie met trometamol wordt toegediend. Trometamol is namelijk een oplosbaar zout, waardoor de effectiviteit van fosfomycine toeneemt in het lichaam doordat het antibioticum beter wordt opgenomen [ CITATION Mic11 \l 1043 ].

2.3.2 Remming van de nucleïnezuursynthese

De nucleïnezuursynthese bij Gram-positieve bacteriën wordt gekatalyseerd door het enzym topoisomerase IV. Topoisomerase IV is een tetrameer bestaande uit twee subeenheden van C en twee subeenheden van E. Normaliter bindt topoisomerase IV aan DNA cross-overs en is het enzym verantwoordelijk voor het verlichten van de spanning in de DNA structuur. Deze spanning is ontstaan

door het verplaatsen van transcriptie- en replicatie complexen langs het DNA. De C subeenheden zijn verantwoordelijk voor het knippen van DNA, waardoor de E subeenheden negatieve supercoiling tot stand kunnen brengen. Vervolgens worden door de C subeenheden het DNA opnieuw afgedicht. Antibiotica kunnen met grote affiniteit binden aan de C subeenheden. Hierdoor wordt het knippen en opnieuw afdichten van het DNA beperkt, waardoor DNA replicatie niet meer kan plaatsvinden en gedeeltes DNA strengen overblijven. Het beschadigde DNA leidt vervolgens tot de vorming van exonucleases die het DNA afbreken en bijdragen aan de bactericide werking van antibiotica. De chinolonen, waaronder ciprofloxacine en norfloxacine, zijn een antibioticagroep die het proces van topoisomerase IV kunnen remmen [ CITATION Zho15 \l 1043 ][ CITATION Cip16 \l 1043 ] [ CITATION Haw031 \l 1043 ].

2.3.3 Remming van de foliumzuursynthese

Foliumzuur is een essentiële voedingsstof voor bacteriën. De synthese van foliumzuur in bacteriën vereist onder andere een chemische reactie tussen

6-hydroxymethyl-7,8–dihydropterin-pyrophosphate (DHPP) en p-aminobenzoic acid (PABA) welke wordt gekatalyseerd door het enzym dihydropteroate synthase (DHPS). Deze chemische reactie wordt in gang gezet door de binding van PABA met DHPS. Vervolgens wordt een andere chemische reactie in gang gezet waarbij een dihydrofoliumzuur omgezet wordt naar tetrahydrofoliumzuur gekatalyseerd door het enzym dihydrofoliumzuur reductase[ CITATION Col13 \l 1043 ]. De combinatie van de antibiotica

sulfamethoxazole en trimethoprim kan de foliumzuur synthese pathway blokkeren. Sulfamethoxazole treedt in werking door te binden aan de actieve site van DHPS, waardoor de functie van het enzym wordt geremd en de binding met PABA wordt geblokkeerd [ CITATION Yun12 \l 1043 ][ CITATION Ear12 \l 1043 ]. Trimethoprim remt het opvolgende proces waarbij trimethoprim een binding aangaat met het enzym dihydrofoliumzuur reductase en deze chemische reactie blokkeert [ CITATION Col13 \l 1043 ]. Door de combinatie van deze twee antibiotica genaamd co-trimoxazole vindt de

foliumzuursynthese pathway niet meer plaats [ CITATION Eps97 \l 1043 ] [ CITATION Eps97 \l 1043 ] [ CITATION Mad \l 1043 ].

2.3.4 Remming van de eiwitsynthese

In alle organismen vindt de eiwitsynthese in de ribosomen als volgt plaats. De informatie van het DNA wordt gekopieerd naar een tussenvorm genaamd messenger RNA (mRNA) en door middel van translatie wordt het mRNA omgezet in een eiwit [ CITATION Bro \l 1043 ].

Bij de translatie herkent de anticodon van transfer RNA (tRNA) een overeenkomende codon van mRNA, waardoor een binding hiertussen ontstaat. Door de binding vindt de translatie plaats van de codon die resulteert in een aminozuur. De aminozuur wordt daarna door tRNA getransporteerd naar het uiteinde van de groeiende aminozuurketen. Het translatie proces in de ribosoom gaat door totdat bij alle codons van het mRNA translatie heeft plaatsgevonden en een eiwit is ontstaan opgebouwd uit aminozuren [ CITATION tra \l 1043 ].

De bacteriële ribosoom bestaat uit twee subeenheden namelijk 30S en 50S [ CITATION Wim \l 1043 ]. Bij het translatie proces voorziet de 30S subeenheid een bindingsplaats voor mRNA en is

verantwoordelijk voor de controle van de vorming van basenparen tussen de codon van mRNA en de anticodon van tRNA. De 50S subeenheid bevat het enzym peptidyl-transferase die de vorming van peptidenbindingen tussen de aminozuren katalyseert [ CITATION Bro \l 1043 ].

De antibioticagroep tetracyclines, waaronder het antibioticum tetracycline, kunnen binden aan de 30S subeenheid van de bacteriële ribosoom en voorkomen de binding tussen de codon van mRNA met de anticodon van tRNA. Hierdoor kan geen eiwit worden gevormd [ CITATION Tet16 \l 1043 ].

De antibioticagroepen macroliden (erythromycine), lincosamiden (clindamycine) en streptogramines B hebben een andere chemische structuur, maar delen wel hetzelfde werkingmechanismen. Het verschil in de chemische structuur is de aan- of afwezigheid van een lactone ring [ CITATION Lec \l 1043 ]. Als target hebben de antibioticagroepen de 50S subeenheid van de bacteriële ribosoom, waardoor de vorming van peptidenbindingen tussen aminozuren worden geremd. Door de remming kunnen geen nieuwe eiwitcomplexen worden gevormd [ CITATION Cli16 \l 1043 ][ CITATION Mad \l 1043 ].

Door behandeling van bacteriële infecties met erythromycine ontstond resistentie voor dit

antibioticum bij stafylokokken. Indien de pathogeen een MLSB fenotype vertoont, kan erythromycine

resistentie leiden tot kruisresistentie voor de andere antibioticagroepen [ CITATION Lec \l 1043 ].

De antibioticagroep nitrofuranen, waaronder nitrofurantoïne, wordt gekarakteriseerd door een nitrogroep die gekoppeld is aan een furaan ring. De nitrogroep is inactief en moet geactiveerd worden door microbiële nitroreductases wanneer het is opgenomen in de microbiële cel [ CITATION Hof \l 1043 ].

Het precieze werkingsmechanisme van nitrofurantoïne is niet bekend, maar wel in grote lijnen. Voor zover bekend remt nitrofurantoïne een aantal bacteriële enzymen die deelnemen aan de Krebs cyclus op drie verschillende punten. De Krebs cyclus is verantwoordelijk voor de bacteriële celademhaling en indien dit wordt verstoord ontstaat een bactericide effect [ CITATION Mun14 \l 1043 ].

2.4 Resistentie

Door het veel voorkomende gebruik van antibiotica komt antibiotica resistentie steeds meer voor. Wanneer eenmaal een bacterie resistent is voor één of meerdere antibiotica worden deze stammen steeds moeilijker te behandelen en vormen daardoor een gevaar voor de samenleving [ CITATION Bai16 \l 1043 ].

2.4.1 Natuurlijke resistentie

Van natuurlijke oorsprong kunnen sommige micro-organismen resistent zijn voor bepaalde antibiotica. Dit wordt hieronder beschreven (zie figuur 2).

 Het organisme kan de structuur, welke het antibioticum remt, niet hebben. Sommige bacteriën hebben bijvoorbeeld geen celwand en zijn daardoor al resistent voor penicillines.  Het organisme kan ondoordringbaar zijn voor het antibioticum.

 Het organisme kan in staat zijn om het antibioticum te veranderen zodat het inactief wordt. Bijvoorbeeld bacteriën die het enzym beta-lactamase hebben welke de beta-lactam ring splijt van de meeste penicillines en hierdoor inactief wordt.

 Het organisme kan de target van het antibioticum aanpassen. Dit kan onder andere door mutaties in het DNA van de bacterie.

 Bacteriën kunnen in sommige gevallen de benodigde substantie opnemen uit de omgeving in plaats van gebruik te maken van een biochemische pathway. Zo kan een bacterie resistent worden indien de antibiotica alleen aangrijpen op deze biochemische pathway.

 Daarnaast kan het organisme in staat zijn om het antibioticum dat de cel is binnen gedrongen naar buiten te pompen door middel van actief transport oftewel efflux [ CITATION Mad \l 1043 ].

Figuur 2. Natuurlijke resistentiemechanismen van bacteriën om de werking van antibiotica te kunnen ontwijken [ CITATION Cli \l 1043 ].

2.4.2 Verworven resistentie

Zoals eerder is beschreven, kunnen antibiotica worden geproduceerd door micro-organismen. Wanneer dit het geval is, moet het antibioticum producerende micro-organisme genen bezitten die coderen voor antibiotica resistentie. Zo kan het antibioticum worden geneutraliseerd of vernietigd, waardoor het niet schadelijk is voor de antibiotica producerende micro-organismen.

Verworven resistentie kan tot stand komen door horizontale gen overdracht tussen

micro-organismen. De drie verschillende mechanismen die hiertoe behoren zijn transformatie, transductie en conjugatie. Transformatie vindt plaats door het opnemen van DNA, zonder geassocieerde eiwitten, uit de omgeving door cellen. Transductie houdt in dat het DNA van de bacterie wordt overgebracht tussen cellen door gebruik te maken van bacteriofagen als vectors. Bij conjugatie vindt via cel contact de overdracht van enkelstrengs DNA plaats [ CITATION Bla15 \l 1043 ].

Doordat de resistentie van bacteriën continue kan veranderen, worden klinisch geïsoleerde bacteriën vaak getest voor antibiotica gevoeligheid. Dit wordt getest met een Minimal Inhibition Concentration (MIC) methode of een agar diffusie methode [ CITATION Mad \l 1043 ]. De MIC waarde is de minimale concentratie van een antibioticum die nodig is om volledig de groei te remmen van een bacterie [ CITATION Lan \l 1043 ]. Om gevoeligheidsbepalingen bij pathogene bacteriën conform met andere Europese landen te bepalen, wordt bij PAMM gewerkt volgens EUCAST richtlijnen (zie paragraaf 2.5).

2.5 EUCAST

EUCAST staat voor European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing met als doel dezelfde antibiotica breekpunten te laten handhaven door Europese landen. De breekpunten zijn MIC

waarden en diameters van de remmingzones per antibioticum [ CITATION Kah06 \l 1043 ]. De breekpunten van EUCAST dienen alleen gebruikt te worden indien volgens voorschriften van EUCAST wordt gewerkt. In dit voorschrift staat het volgende beschreven: voor een gevoeligheidsbepaling wordt een MH agar of een Mueller-Hinton Fastidious (MH-F) agar gebruikt [ CITATION Mat \l 1043 ]. MH agar en MH-F agar worden aanbevolen bij het bepalen van antibiotica gevoeligheid vanwege verschillende redenen. De plaat demonstreert namelijk goede batch-to-batch reproduceerbaarheid voor gevoeligheidstesten. Daarnaast heeft MH(-F) agar een lage concentratie aan sulfonamide, trimethoprim en tetracycline remmers, waardoor de werking van deze antibiotica niet worden belemmerd. Tevens ondersteunt de plaat de groei van niet-kieskeurige bacteriële pathogenen [ CITATION Mur03 \l 1043 ]. Daarnaast is aan MH(-F) agar rundvlees hart en caseïne zuur hydrolysaat toegevoegd die zorgen voor essentiële voedingstoffen voor bacteriegroei. Tevens worden toxische substanties geabsorbeerd door zetmeel dat aanwezig is in de agar [ CITATION Nat00 \l 1043 ]. Op MH agar groeien alle niet-kieskeurige organismen en op MH-F agar groeien kieskeurige micro-organismen door de toevoeging van paardenbloed. Afhankelijk van het micro-organisme, kieskeurig of niet-kieskeurig, wordt de bijbehorende plaat geselecteerd. Hierop wordt een bacteriesuspensie van een 0.5 McFarland geënt. Wanneer de antibiotica worden aangebracht op de geënte MH(-F) agar wordt de plaat vervolgens geïncubeerd bij 35°C voor 16-20 uur. Deze regel geldt als standaard, behalve als het anders staat beschreven in EUCAST. Na incubatie wordt de MH agar aan de achterkant afgelezen op ongeveer 30 cm afstand van het oog. Het is hierbij van belang dat het aflezen wordt uitgevoerd met reflecterend licht tegen een donkere achtergrond. De MH-F agar moet worden afgelezen aan de voorkant van de plaat zonder het deksel en ook met reflecterend licht. Tussen alle stappen, die hierboven zijn beschreven, mogen maximaal 15 minuten verstrijken anders worden de resultaten onbetrouwbaar [ CITATION Mat \l 1043 ].

De EUCAST richtlijnen worden toegepast bij de gevoeligheidsmethodes die in de volgende paragrafen zijn beschreven (zie paragraaf 2.7 t/m 2.12).

Naast EUCAST richtlijnen zijn er ook Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) richtlijnen (zie paragraaf 2.6).

2.6 CLSI

CLSI is ook een organisatie die voor gevoeligheidsbepalingen standaard richtlijnen heeft ontwikkeld [ CITATION Esp \l 1043 ] [ CITATION Per \l 1043 ]. Voorheen werd er bij Stichting PAMM gewerkt volgens CLSI richtlijnen. Pas later werd door Europa EUCAST richtlijnen gestandaardiseerd, waardoor bij Stichting PAMM de overgang van CLSI naar EUCAST plaats heeft gevonden. Zo is er een betere samenhang in Europa tussen de breekpunten van antibiotica en de behandeling van de patiënten met een bacteriële infectie [ CITATION Mar \l 1043 ] [ CITATION Ven \l 1043 ] [ CITATION Mac05 \l 1043 ]. Wanneer voor de geteste antibiotica in dit onderzoek geen breekpunten bekend zijn bij EUCAST, worden de breekpunten gebruikt van CLSI.

2.7 Diskdiffusie

De diskdiffusie gevoeligheidsmethode (zie figuur 3) wordt uitgevoerd volgens EUCAST richtlijnen. Na het enten van de bacteriesuspensie op MH(-F) agar worden antibiotica disks met een vaste

antibioticum in de agar, waardoor een concentratie gradiënt ontstaat. Afhankelijk van de gevoeligheid van de geïsoleerde pathogeen ontstaan er remmingzones rondom de disks. Na incubatie kunnen de diameters worden afgelezen van de remmingzones. De diameters kunnen door middel van

gestandaardiseerde breekpunten worden omgezet in een gevoeligheidsinterpretatie welke gevoelig, intermediair of resistent zijn [ CITATION Rel09 \l 1043 ].

Figuur 3. Gevoeligheidsbepalingen berust op agar diffusie methode. Links; een MH agar waarop zes antibiotica disks zijn aangebracht met zichtbare remmingzones. Midden; een MH-F agar waarop negen antibiotica disks zijn aangebracht met ook zichtbare remmingzones. Rechts; E-test met druppelvormige remmingzone[ CITATION Mat \l 1043 ] [ CITATION htt \l 1043 ].

2.8 Meervaksplaten

Het principe van meervaksplaten is gebaseerd op de agar-dilutie methode. Een meervaksplaat is opgedeeld in meerdere vakken, waarvan één vak een groeicontrole bevat. De overige vakken bevatten een oplopende concentratie reeks van een antibioticum opgelost in agar. Er zijn verschillende meervaksplaten van onder andere amoxicilline en vancomycine, waarvan bij amoxicilline de volgende concentratie reeks wordt aangehouden; 0-4-8. Het vak waar het micro-organisme niet meer groeit, wordt beschouwd als MIC [ CITATION San16 \l 1043 ][ CITATION Wie08 \l 1043 ].

2.9 Epsilometer test

De Epsilometer test (E-test) wordt ingezet volgens EUCAST richtlijnen. De E-test is een rechthoekig plastic teststrip, waarvan de onderkant is verzadigd met een gedroogde en geïmmobiliseerde antibioticum. De teststrip bevat een oplopende en exponentiële concentratie gradiënt van het antibioticum. Daarnaast is aan de bovenkant van de strip de concentratie schaal gemarkeerd. Na incubatie is een druppelvormige remmingzone zichtbaar langs de teststrip die uitkomt in de MIC van het antibioticum (zie figuur 3). Dit in tegenstelling tot de diskdiffusie methode waarbij alleen kan worden bepaald of de bacterie gevoelig, intermediair of resistent is [ CITATION Rel09 \l 1043 ] [ CITATION Nac92 \l 1043 ][ CITATION McG09 \l 1043 ].

2.10 Vitek®2

Vitek®2 maakt gebruik van reagens kaarten die verschillende concentraties antibiotica en test media bevatten in een 64-well formaat (figuur 4). Het geautomatiseerde systeem bepaalt de groei van snel groeiende bacteriën bij verschillende antibiotica tijdens een verkorte incubatie periode. De Vitek®2 is ingesteld volgens EUCAST richtlijnen en geeft MIC waarden af voor verschillende antibiotica of

combinaties ervan. Daarnaast beschikt Vitek®2 over een Advanced Expert System (AES) die een fenotype interpreteert van de geïsoleerde bacterie en dit fenotype vergelijkt met alle patronen in AES. Het patroon dat het beste overeenkomt wordt uiteindelijk geïdentificeerd. Indien de gemeten MIC waarden niet allemaal overeen komen met het geïdentificeerde fenotype kan Vitek®2 de gevoeligheidsinterpretaties aanpassen. Hierdoor komt het uiteindelijk wel overeen met het

geïdentificeerde fenotype. Wanneer dit het geval is, geeft Vitek®2 hierover een melding [ CITATION Rel09 \l 1043 ][ CITATION Liv02 \l 1043 ].

Figuur 4. Vitek®2 kaart in een 64-well formaat waarin verschillende concentraties antibiotica en test media aanwezig zijn [ CITATION bio \l 1043 ].

2.11 Walk Away Specimen Processor Laboratory

WASP/WASPlab is een apparaat dat kan worden aangestuurd door een touch-screen computer (zie figuur 5). De WASP bestaat uit een carrousel voor de plaatsing van verschillende voedingsbodems, een grijper voor de buizen met bacteriesuspensies, een vortex apparaat, een apparaat die de dop van de buis kan draaien en verschillende grootte öses (1 µl, 10 µl en 30 µl) [ CITATION Rin15 \l 1043 ]. Voor de automatische diskdiffusie methode wordt de 30 µl öse gebruikt die meerdere strepen van de bacteriesuspensie aanbrengt op de MH agar. Vervolgens wordt door de spatel aan de andere kant van de 30 µl öse de bacteriesuspensie over de gehele plaat verspreid [ CITATION Bou09 \l 1043 ].

Daarnaast bevat WASP disk dispensers (zie figuur 5) voor het stempelen van antibioticadisks op de plaat. Met behulp van transportsystemen kunnen platen worden verplaatst naar en van de incubators van WASPlab. Dit zijn geautomatiseerde incubators met digitale lezingsystemen om foto’s te kunnen maken op vaste tijdstippen. Vervolgens kunnen de foto’s van de platen worden afgelezen in Total Laboratory Automation (TLA) op de computer [ CITATION Rin15 \l 1043 ].

Na beoordeling van de foto’s door de analisten kan worden bepaald of een plaat met wel of geen bacteriegroei verder moet worden uitgewerkt. Indien verder onderzoek gewenst is van de bacteriën kan de plaat uit de WASPlab incubator worden geladen en komen vervolgens via de lopende band terecht in een canister. De overige, niet gewenste, platen worden afgevoerd naar de afvalcontainer [ CITATION Bre16 \l 1043 ].

Figuur 5. Links; WASP inclusief transportsystemen en incubators (WASPlab). Rechts; een WASP disk dispenser [ CITATION Dws \l 1043 ].

2.12 Adagio

Adagio is een systeem die de diameter kan bepalen van remmingzones rondom een antibioticum disk bij een MH agar (zie figuur 6). Deze remmingzones worden met behulp van de gemaakte foto’s door WASPlab bepaald.

Adagio bepaald de remmingzones door vanuit de antibioticumdisk naar het midden van de plaat toe te meten. Dit gebeurt met een hoek van ongeveer 120 graden (zie figuur 6). Adagio is zo ingesteld, omdat aan de rand van de plaat de belichting weerkaatst, waardoor hier de groei niet goed kan worden gedetecteerd.

De diameters van de remmingzones die door het systeem zijn bepaald, kunnen eventueel naderhand nog handmatig worden aangepast in TLA.

Wanneer een micro-organisme in het systeem wordt ingevoerd en hiervan de breekpunten bekend zijn, kan Adagio de remmingzones weergeven in verschillende kleuren. Dit zijn groen (gevoelig), oranje (intermediair) of rood (resistent) welke afhankelijk zijn van de gevoeligheid voor de bacterie. Daarnaast kan Adagio zelf potentiële fouten- en vaak voorkomende antibiotica

resistentiemechanismen detecteren [ CITATION ADA16 \l 1043 ][ CITATION Ide16 \l 1043 ] [ CITATION Cop \l 1043 ].

Figuur 6. Rechts: een foto genomen door WASPlab bij stafylokokken van een MH agar met antibioticadisks, waarvan de remmingzones zijn bepaald door Adagio. Links: Ingezoomd op de rechtse foto. Hierop is een voorbeeld aangegeven vanuit welke hoek Adagio de remmingzone bepaald bij één antibioticumdisk.

3 Materiaal en methoden

In dit onderzoek zijn uit de dagelijkse diagnostiek van PAMM Gram-positieve kokken verzameld afkomstig uit voornamelijk urineonderzoeken van verschillende patiënten ingestuurd door

huisartsen. Naast deze urineonderzoeken zijn ook andere laboratorium stammen meegenomen om het gewenste aantal stammen te verkrijgen. Het totaal van 300 stammen werd bepaald om deze nieuwe methode betrouwbaar te kunnen valideren. De 300 stammen waren gelijkmatig opgedeeld in twee hoofdgroepen namelijk stafylokokken en enterokokken. De stafylokokken en enterokokken werden vervolgens opgedeeld in verschillende soorten. Deze verdeling werd gebaseerd op de voorkomende hoeveelheden in de dagelijkse diagnostiek onderzoeken van Stichting PAMM (zie tabellen 1 en 2).

Tabel 1. Aantal geteste stafylokokken in dit onderzoek voor WASP/Adagio

Stafylokokken Aantal stammen

Staphylococcus aureus 100 Staphylococcus saprofyticus 10 Staphylococcus epidermidis 10 Staphylococcus lugdunensis 10 Staphylococcus capitis 10 Staphylococcus hominis 10 Totaal 150

Tabel 2. Aantal geteste enterokokken in dit onderzoek voor WASP/Adagio

Enterokokken Aantal stammen

Enterococcus faecalis 100

Enterococcus faecium 50

Van deze 300 stafylokokken en enterokokken stammen waren in de dagelijkse diagnostiek van PAMM de gevoeligheden van de antibiotica getest met de gouden standaard voor dit onderzoek. De gouden standaard verschilt voor de stafylokokken en enterokokken. Bij de stafylokokken is namelijk Vitek®2 de gouden standaard. Voor de enterokokken verschilt de gouden standaard per antibioticum. Voor de laatstgenoemde bacteriegroep worden de meervaksplaten en diskdiffusie die met de hand wordt ingezet uitgevoerd in de dagelijkse diagnostiek.

In dit onderzoek worden de resultaten van de hierboven beschreven gouden standaard vergeleken met de resultaten van de nieuwe methode WASP (Copan) in combinatie met Adagio software (Biorad). Om de gevoeligheid van de stammen met WASP/Adagio voor antibiotica te bepalen, werden een aantal morfologisch dezelfde kolonies geselecteerd van een bloedplaat. Per bloedplaat was een reine stam na ±18 uur incubatie (±35°C) gegroeid. De kolonies werden met een steriele öse

gehomogeniseerd in 0.85% fysiologisch zout oplossing (NaCl in water) tot een dichtheid van een 0.5±0.05 McFarland. De dichtheid van de bacteriesuspensies werden gemeten met DensiCHEK plus (Biomérieux). Vervolgens werd een Copan 12 buis gevuld met 2 ml 0.85% fysiologisch zout oplossing. Hier werd 1 ml 0.5±0.05 McFarland bacteriesuspensie aan toegevoegd en vervolgens gemengd. Dit werd uitgevoerd, omdat de WASP drie keer zoveel ent op de MH agar in verhouding tot de gouden standaard. Door 2 ml 0.85% fysiologisch zoutoplossing te mengen met 1 ml 0.5±0.05 McFarland bacteriesuspensie wordt de hoeveelheid bacterie die wordt geënt op de plaat gelijk gehouden tussen de twee methodes. Hierdoor kunnen de resultaten van de methodes met elkaar worden vergeleken. Per buis met bacteriesuspensie werd één MH agar gelijkmatig geënt. Vervolgens werd afhankelijk van de bacteriegroep de antibiotica disks (Oxoid) (zie tabellen 3 en 4) met behulp van een disk dispenser gestempeld op de MH agar. Daarna controleerde de camera van WASP of alle disks op de juiste plek lagen. Tevens werden de afkortingen van de antibiotica die op de disks zijn weergegeven met de camera gecontroleerd.

Tabel 3. De geteste antibiotica voor stafylokokken

Antibiotica Positie bij 8-disk dispenser WASP

Cefoxitin (FOX 30 µg) 1

Clindamycine (DA 2 µg) 2

Erythromycine (E 15 µg) 3

Ciprofloxacine (CIP 5 µg) 5

Co-trimoxazole (SXT 25 µg) 7

Tabel 4. De geteste antibiotica voor enterokokken

Antibiotica Positie bij 6-disk dispenser WASP

Ampicilline (AMP 2 µg) 1

Nitrofurantoïne (F 100 µg) 2

Norfloxacine (NOR 10 µg) 3

Tetracycline (TE 30 µg) 4

Fosfomycine trometamol (FOT 200 µg) 5

Vancomycine (VA 5 µg) 6

Vervolgens werden de MH agar platen via het transportsysteem van WASPlab naar de aerobe

incubator (±35°C) getransporteerd. Hier werd na 18 uur incubatie een foto gemaakt van de plaat door WASPlab en met behulp van Adagio software de remmingzones rondom de antibiotica disks bepaald.

Vervolgens werden de foto’s waarop remmingzones zichtbaar waren afgelezen in TLA op de

computer. Indien nodig konden de remmingzones die door Adagio software waren bepaald hier nog handmatig in TLA worden aangepast. De diameters van de remmingzones bepaald door Adagio software werden in gevoeligheidsinterpretaties omgezet door middel van EUCAST of CLSI breekpunten (zie bijlage I: tabellen 5 en 6 en bijlage II: tabel 7). Vervolgens werden de platen uit WASPlab geladen om per plaat de remmingzones handmatig met een liniaal af te lezen. De diameters van de remmingzones bepaald door Adagio software en de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat werden vergeleken. Hierbij werd een afwijking van maximaal twee mm getolereerd. Bij enterokokken werden de platen na de 18-uurs beoordeling terug geladen in de aerobe incubator (±35°C) van WASPlab, zodat nog een 24-uurs foto kon worden genomen. Dit vanwege het

antibioticum vancomycine. Nadat de 24-uurs foto was gemaakt volgde hetzelfde protocol als na de 18-uurs foto.

In de dagelijkse diagnostiek onderzoeken bij enterokokken werden niet alle antibiotica getest die in dit onderzoek zijn meegenomen. Hiervoor werden de gevoeligheden bepaald door met de hand ingezette diskdiffusie. Hetzelfde gold wanneer in de dagelijkse diagnostiek alleen MIC’s bekend waren voor de antibiotica. Voor de diskdiffusie die met de hand werd ingezet, werd een bacteriesuspensie gemaakt van een 0.5±0.05 McFarland in 0.85% fysiologisch zout oplossing. Vervolgens werd met een steriele wattenstaaf de bacteriesuspensie in drie verschillende richtingen over de gehele MH agar plaat geënt. Hierna werd met een disk dispenser de nog niet geteste antibiotica handmatig op de plaat gestempeld. Vervolgens werd na ±18 uur incubatie (±35°C) de remmingzones handmatig afgelezen met een liniaal.

Daarnaast werd een E-test ingezet bij stafylokokken indien een major- of very major afwijking was geconstateerd tussen Vitek®2 en WASP/Adagio. De E-test werd hetzelfde ingezet als met de hand ingezette diskdiffusie, maar in plaats van antibiotica disks werd een E-test teststrip op de MH agar aangebracht.

4 Resultaten

De resultaten die zijn verkregen bij de validatie van WASP in combinatie met Adagio software volgens EUCAST richtlijnen worden beschreven in dit hoofdstuk. Eerst wordt in paragraaf 4.1 de vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties beschreven tussen de gouden standaard, welke afhankelijk is van de bacteriegroep, en WASP/Adagio. Vervolgens wordt in paragraaf 4.2 de vergelijking van

gevoeligheidsinterpretaties tussen Adagio software en de diameters die met de hand zijn afgelezen bij de door WASP geënte plaat beschreven.

4.1 Vergelijking van de gouden standaard met WASP/Adagio

In deze paragraaf worden de gevoeligheidsinterpretaties vergeleken tussen de gouden standaard, afhankelijk van de bacteriegroep, met WASP/Adagio. Wanneer afwijkingen tussen

gevoeligheidsinterpretaties worden geconstateerd, wordt onderscheid gemaakt tussen een minor afwijking (zie tabel 8), een major afwijking en een very major afwijking. Een major afwijking geeft aan dat de stam bij de gouden standaard gevoelig is gemeten, maar bij Adagio resistent. Dit houdt in dat de nieuwe methode een antibioticum achterhoudt voor de behandeling van de bacteriële infectie bij de patiënt. Terwijl het antibioticum wel gevoelig is, kan hierdoor het gebruik van breedspectrum antibiotica worden gestimuleerd waardoor onnodig resistente fysiologische flora kan ontstaan [ CITATION Gui09 \l 1043 ].

Bij een very major afwijking is de stam bij de gouden standaard resistent gemeten, maar bij Adagio gevoelig. Dit houdt in dat resistentie van het antibioticum niet wordt gedetecteerd door de nieuwe methode. Dit komt neer op de behandeling van een patiënt met een antibioticum die niet effectief is en leidt tot het falen van de behandeling. Vandaar dat het van uiterste belang is om very major afwijkingen te voorkomen [ CITATION Gui09 \l 1043 ].

Daarnaast wordt het overeenkomstpercentage tussen de vergeleken methodes per antibioticum weergegeven.

Tabel 8. Indien onderstaande afwijkingen worden geconstateerd bij de gevoeligheidinterpretaties tussen de vergeleken methodes is er sprake van een minor afwijking.

Gouden standaard Adagio

Intermediair Resistent

Resistent Intermediair

Intermediair Gevoelig

Gevoelig Intermediair

4.1.1 Vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties tussen Vitek®2 en Adagio bij stafylokokken

Voor de stafylokokken is de gouden standaard, Vitek®2, vergeleken met WASP/Adagio. Voor de validatie van WASP/Adagio zijn onder andere 150 stafylokokken getest bij vijf verschillende antibiotica. Van alle geteste antibiotica voor de stafylokokken konden in plaats van 150 stammen, maar 149 stammen worden meegenomen voor de vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties. Eén S.

hominis stam groeide namelijk niet op MH agar, waardoor Adagio foutieve remmingzones had

bepaald.

De overeenkomstpercentages van alle geteste antibiotica bij 149 stafylokokken stammen (zie grafiek 1) zijn gemiddeld 96,6%.

De eventuele gevoeligheidsinterpretatie afwijkingen tussen Vitek®2 en WASP/Adagio zullen in deze paragraaf per antibioticum worden beschreven.

Object 3

Grafiek 1. De overeenkomstpercentages van de antibiotica die zijn getest voor WASP/Adagio vergeleken met Vitek®2 bij stafylokokken. n= het aantal geteste stammen voor stafylokokken.

Co-trimoxazole

De diameter van het antibioticum co-trimoxazole bepaald door Adagio software is per stafylokok stam omgezet in een gevoeligheidsinterpretatie met behulp van EUCAST breekpunten. Bij het antibioticum co-trimoxazole komen 137 stammen met gevoeligheidsinterpretaties overeen tussen Vitek®2 en Adagio. Twaalf stammen van de 149 komen niet overeen (zie grafiek 2), waarvan bij zeven stammen sprake is van een very major afwijking tussen de twee methodes. Bij vijf stammen is er sprake van een minor afwijking tussen de gevoeligheidsinterpretaties. Bij één stam waarbij sprake is van een very major afwijking werd een macrokolonie niet gedetecteerd door Adagio in de

remmingzone.Het overeenkomstpercentage bij co-trimoxazole is afgerond 92%.

Object 5

Grafiek 2. Het aantal minor-, major- en very major afwijkingen bij het antibioticum co-trimoxazole voor de stafylokokken. n= het aantal geteste stammen voor stafylokokken.

Cefoxitin

Bij het antibioticum cefoxitin komen 146 stammen met gevoeligheidsinterpretaties overeen tussen Vitek®2 en Adagio. Drie stammen van de 149 komen niet overeen (zie bijlage III: grafiek 3), waarvan

twee stammen dichtbij (±1 mm) het EUCAST breekpunt gevoelig/resistent zijn gemeten door Adagio software. De resultaten weergeven één major afwijking en twee very major afwijkingen tussen de gevoeligheidsinterpretaties van Vitek®2 en Adagio bij het antibioticum cefoxitin. Het

overeenkomstpercentage van gevoeligheidsinterpretaties bij cefoxitin is afgerond 98%.

Erythromycine

Bij erythromycine komen 145 stammen met gevoeligheidsinterpretaties overeen tussen de twee vergeleken methodes. Vier stammen komen niet overeen (zie bijlage III: grafiek 4), waarvan bij Vitek®2 alles resistent is gemeten en bij Adagio gevoelig. Bij deze vier stammen is sprake van een very major afwijking. Het overeenkomstpercentage bij erythromycine tussen de twee vergeleken

methodes is afgerond 97%.

Clindamycine

Bij clindamycine komen 148 stammen met gevoeligheidsinterpretaties overeen van de in totaal 149 stammen. Eén stam komt niet overeen (zie bijlage III: grafiek 5), omdat die bij Vitek®2 resistent is gemeten, maar bij Adagio gevoelig. Vandaar dat er hier sprake is van een very major afwijking. Het overeenkomstpercentage bij het antibioticum clindamycine tussen de twee vergeleken methodes is afgerond 99%.

Om de inductie van clindamycine door erythromycine te kunnen waarnemen bij diskdiffusie, moeten de disks van erythromycine en clindamycine langs elkaar op de plaat worden gestempeld. Copan heeft twee disk dispensers, een 6-disk dispenser en een 8-disk dispenser, beschikbaar voor WASP. Beide disk dispensers zijn getest bij vijf stafylokokken, waarvan de clindamycine inductie positief is gemeten door Vitek®2. De diameters bepaald door Adagio zijn vervolgens vergeleken tussen de 6-disk dispenser en 8-6-disk dispenser (zie tabel 9). Het verschil in diameters tussen de twee 6-disk dispensers is ±5 mm.

Tabel 9. De vergelijking van diameters bepaald door Adagio bij het antibioticum clindamycine tussen de 6-disk dispenser en 8-6-disk dispenser van WASP

Diameter clindamycine 6-disk dispenser Diameter clindamycine 8-disk dispenser

25 mm 19,07 mm 24 mm 19,04 mm 25 mm 19,35 mm 22,2 mm 17,41 mm 22,1 mm 17,2 mm Ciprofloxacine

Bij ciprofloxacine komen 146 stammen met gevoeligheidsinterpretaties overeen tussen de twee vergeleken methodes. Drie stammen komen niet overeen (zie bijlage III: grafiek 6), waarvan twee stammen bij Vitek®2 resistent zijn gemeten en bij Adagio gevoelig. De derde stam is door Vitek®2 gevoelig gemeten en bij Adagio resistent. Echter ligt hier de meetwaarde van Adagio dichtbij de EUCAST breekpunt gevoelig/resistent. De resultaten van het antibioticum ciprofloxacine geven één minor afwijking en twee very major afwijkingen weer tussen de gevoeligheidsinterpretaties van Vitek®2 en Adagio. Het overeenkomstpercentage is hier afgerond 98%.

De hierboven beschreven resultaten zijn onder andere de gevoeligheidsinterpretaties gerelateerd aan de bepaalde remmingzones van Adagio. Deze remmingzones konden indien nodig handmatig in TLA worden aangepast. Wanneer de gevoeligheidsinterpretaties van Vitek®2 werden vergeleken met Adagio, na het handmatig aanpassen van de remmingzones in TLA, was het gemiddelde

overeenkomstpercentage hetzelfde gebleven als voor de aanpassingen van de remmingzones bij stafylokokken (zie grafiek 1).

Bij twaalf stammen waar sprake is van een major- of very major afwijking is een extra E-test ingezet (zie bijlage VII: grafiek 19). De gevoeligheidsinterpretaties van de E-test zijn vergeleken met Vitek®2 en WASP/Adagio. Alle twaalf de stammen komen overeen tussen WASP/Adagio en de E-testen.

4.1.2 Vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties tussen meervaksplaten of met de hand ingezette diskdiffusie en Adagio bij enterokokken

Voor enterokokken is de gouden standaard, meervaksplaten of met de hand ingezette diskdiffusie, vergeleken met WASP/Adagio. Voor de validatie van WASP/Adagio zijn onder andere 150

enterokokken getest bij zes verschillende antibiotica. Van alle geteste antibiotica bij enterokokken (zie grafiek 7) is het overeenkomstpercentage gemiddeld 88%.

De eventuele gevoeligheidsinterpretatie afwijkingen tussen meervaksplaten of met de hand ingezette diskdiffusie en WASP/Adagio zullen in deze paragraafper antibioticum worden beschreven.

Object 7

Grafiek 7. De overeenkomstpercentages van antibiotica die zijn getest voor WASP/Adagio vergeleken met meervaksplaten of met de hand ingezette diskdiffusie bij enterokokken. n= het aantal geteste stammen voor enterokokken.

Fosfomycine trometamol

Bij fosfomycine trometamol komen de gevoeligheidsinterpretaties van 132 stammen van de in totaal 150 overeen tussen de vergeleken methodes. Achttien stammen komen niet overeen (zie bijlage IV: grafiek 8), waarvan bij zestien stammen sprake is van een minor afwijking. Bij de andere twee stammen is sprake van een major afwijking. Het overeenkomstpercentage bij fosfomycine trometamol is 88%.

Voor fosfomycine trometamol zijn de bacteriesoorten E. faecalis en E. faecium getest. Van de in totaal achttien afwijkingen bij fosfomycine trometamol zijn er zeventien afwijkingen geconstateerd bij E.

faecium stammen. Wanneer alleen E. faecalis wordt getest voor fosfomycine trometamol (zie bijlage

VIII: grafiek 20) is het overeenkomstpercentage 99%.

Vancomycine

Bij vancomycine komen 134 stammen met gevoeligheidsinterpretaties overeen tussen de twee vergeleken methodes. Zestien stammen komen niet overeen (zie bijlage IV: grafiek 9), waarvan bij veertien stammen sprake is van een major afwijking en bij twee stammen een very major afwijking.

Van de zestien stammen die niet overeenkomen, zijn bij twaalf stammen de diameters binnen een range van ±1 mm verschillend van het EUCAST breekpunt gevoelig/resistent. Het

overeenkomstpercentage bij vancomycine is afgerond 89%.

Tetracycline

Bij tetracycline komen de gevoeligheidsinterpretaties van 136 stammen van de in totaal 150 overeen tussen de vergeleken methodes. Veertien stammen komen niet overeen (zie bijlage IV: grafiek 10), waarvan bij één stam sprake is van een minor afwijking. Bij de andere dertien stammen is sprake van een major afwijking. Het overeenkomstpercentage bij tetracycline is afgerond 91%.

Norfloxacine

Bij norfloxacine komen de gevoeligheidsinterpretaties van 146 stammen van de in totaal 150 overeen tussen de methodes. Vier stammen komen niet overeen (zie bijlage IV: grafiek 11), waarvan bij drie stammen een major afwijking is geconstateerd en bij één stam een very major afwijking. Het overeenkomstpercentage bij het antibioticum norfloxacine is afgerond 97%.

Nitrofurantoïne

Bij nitrofurantoïne komen 98 stammen met de gevoeligheidsinterpretaties overeen tussen de vergeleken methodes. 52 stammen komen niet overeen (zie bijlage IV: grafiek 12), waarvan bij 49 stammen sprake is van een major afwijking tussen met de hand ingezette diskdiffusie en

WASP/Adagio. Bij drie stammen is er sprake van een very major afwijking tussen de vergeleken methodes. Het overeenkomstpercentage bij nitrofurantoïne is afgerond 65%.

Vanwege het lage overeenkomstpercentage bij nitrofurantoïne werden bij een aantal enterokokken de diameters van nitrofurantoïne, bepaald door Adagio, vergeleken tussen de 18-uurs foto en 24-uurs foto. Hiervoor werden alleen enterokokken vergeleken die door Adagio bij de 18-uurs foto resistent (6,4 mm, ter grootte van de disk) werden gemeten. Daarnaast werden deze stammen gevoelig geïnterpreteerd bij de gouden standaard en bij de met de hand afgelezen platen die door WASP waren geënt. In totaal werden vijftien enterokokken vergeleken (zie bijlage VIII: grafiek 21), waarvan één stam na 24 uur gevoelig werd gemeten door Adagio en de rest nog steeds resistent (6,4 mm). Daarnaast zijn de resultaten bij nitrofurantoïne van meer dan 10.000 urinekweken van patiënten onder de 65 jaar ingestuurd door huisartsen verwerkt in een grafiek. Deze urinekweken zijn tussen 2012-2015 ontvangen door PAMM (zie bijlage VIII: grafiek 22) [ CITATION Fon \l 1043 ]. Uit de grafiek kan worden opgemaakt dat meer dan 90% van de E. faecalis stammen gevoelig zijn bepaald voor nitrofurantoïne.

Ampicilline

Bij ampicilline komen de gevoeligheidsinterpretaties van 145 stammen van de in totaal 150 overeen tussen de gouden standaard en WASP/Adagio. Vijf stammen komen niet overeen (zie bijlage IV: grafiek 13), waarvan bij vier stammen sprake is van een major afwijking. Bij de andere stam is een minor afwijking geconstateerd. Het overeenkomstpercentage bij ampicilline is afgerond 97%.

De hierboven beschreven resultaten zijn onder andere de gevoeligheidsinterpretaties gerelateerd aan de bepaalde remmingzones van Adagio. Deze remmingzones konden indien nodig handmatig in TLA worden aangepast. Wanneer de gevoeligheidsinterpretaties van de meervaksplaten of met de hand ingezette diskdiffusie, werden vergeleken met WASP/Adagio, na het handmatig aanpassen van de remmingzones in TLA, was het overeenkomstpercentage gemiddeld 95,5% (zie bijlage VI: grafiek 14).

4.2 Vergelijking van Adagio met de handmatige aflezing bij de door WASP

geënte platen

In paragraaf 4.1 was de gouden standaard voor stafylokokken en enterokokken met WASP/Adagio vergeleken. In deze paragraaf wordt Adagio met de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat voor beide bacteriegroepen vergeleken. De laatstgenoemde heeft betrekking tot de platen die door WASP zijn geënt en vervolgens na incubatie uit WASPlab zijn geladen om zo handmatig met liniaal de remmingzones af te kunnen lezen.

Indien de gevoeligheidsinterpretaties afwijken, wordt geconstateerd of het een minor-, major- of very major afwijking betreft. Daarnaast wordt het overeenkomstpercentage weergegeven per

antibioticum. Tevens wordt, indien de gevoeligheidsinterpretaties van elkaar afwijken, geconstateerd per stam of de vergeleken diameters binnen de getolereerde ±2 mm afwijking liggen.

4.2.1 Vergelijking van gevoeligheidsinterpretaties tussen Adagio en de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat voor stafylokokken

Voor de vergelijking tussen Adagio en de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat bij stafylokokken zijn in totaal 149 stammen getest (zie bijlage V: grafiek 15). Het

overeenkomstpercentage tussen deze twee aflezingen bij stafylokokken is gemiddeld 99,1%. Bij de antibiotica ciprofloxacine en clindamycine zijn de overeenkomstpercentages tussen de twee vergeleken aflezingen 100%. Bij deze twee antibiotica is daarom geen sprake van minor-, major- en very major afwijkingen tussen de gevoeligheidsinterpretaties. De resterende antibiotica voor stafylokokken worden in deze paragraaf apart beschreven.

Co-trimoxazole

Bij co-trimoxazole komen 145 stammen van de 149 overeen met de gevoeligheidsinterpretaties. Vier stammen komen niet overeen, waarvan één stam ±2 mm afwijkt tussen de vergeleken diameters. Bij twee van de vier stammen is er sprake van een minor afwijking. Bij de derde stam is een major afwijking geconstateerd en bij de vierde stam een very major afwijking. Het overeenkomstpercentage van co-trimoxazole tussen de twee vergeleken aflezingen is afgerond 97%.

Cefoxitin

Bij cefoxitin komen 147 stammen van de 149 overeen qua gevoeligheidsinterpretaties. Twee stammen komen niet overeen, waarvan de vergeleken diameters ±2 mm afwijken en net boven en onder het EUCAST breekpunt gevoelig/resistent zijn gemeten. Bij één stam is sprake van een major afwijking en bij de andere stam van een very major afwijking. Het overeenkomstpercentage tussen de twee vergeleken aflezingen voor cefoxitin is afgerond 99%.

Erythromycine

Bij erythromycine komen van de in totaal 149 stammen er 148 overeen met de

gevoeligheidsinterpretaties tussen de twee vergeleken aflezingen. Eén stam komt niet overeen en deze valt buiten de ±2 mm marge wanneer de diameters worden vergeleken tussen de twee aflezingen. Bij deze stam is sprake van een minor afwijking. Het overeenkomstpercentage van erythromycine is hier afgerond 99%.

De hierboven beschreven resultaten zijn onder andere de gevoeligheidsinterpretaties gerelateerd aan de bepaalde remmingzones van Adagio. Deze remmingzones konden indien nodig handmatig in TLA worden aangepast. Wanneer de gevoeligheidsinterpretaties van Adagio, na het handmatig aanpassen van de remmingzones in TLA, werden vergeleken met de handmatige aflezing bij de door WASP geënte plaat was het overeenkomstpercentagegemiddeld 99,6% (zie bijlage V: grafiek 16).