Afstudeerverslag
S
YSTEMATISCHE
T
OXICOLOGISCHE
I
DENTIFICATIE
P
ROCEDURE
D
RUGS
o
f
A
BUSE (
STIP DOA
)
Drugs screening in urine met behulp van
STIP DOA
Studente: Lucia Baljeu - Neuman Afstudeerplaats: Erasmus MC te Rotterdam
Klinisch Farmacologisch en Toxicologisch Laboratorium van de Apotheek
Bedrijfbegeleiding: Ing. A.C. van Buuren Ing. B.C.H. van der Nagel Onderwijsinstelling: Avans Hogeschool te Breda
Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Opleiding Chemie – deeltijd
Opleidingsbegeleiding: Mevr. M.M. Duijvesteijn – Reddering Dr. R.J.F.M. van Arendonk
Lucia Baljeu-Neuman 2 Samenvatting
Drugs screening wordt nu op het Klinisch Farmacologisch en Toxicologisch Laboratorium van de Apotheek bij Erasmus MC te Rotterdam uitgevoerd met behulp van een
autoanalyser. De voordelen daarvan zijn dat het snel is en er geen monstervoorbewerking nodig is. Een nadeel is dat er kans is op vals positieve resultaten. Hoe meer
verwantschap er in de moleculaire structuur bestaat tussen de te bepalen stof en een andere stof, hoe groter de kans op respons. Bijvoorbeeld de aanwezigheid van codeïne in urine kan leiden tot een positief resultaat op opiaten. Gezien het feit dat een vals positief resultaat gevolgschade kan hebben voor de geteste persoon dient het laboratorium een positief screening resultaat te kunnen bevestigen met behulp van een andere
analysetechniek zoals High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Dit onderzoek heeft als doel de HPLC methode Systematische Toxicologische Identificatie Procedure van drugsmisbruik (STIP DOA) uit te voeren, te optimaliseren en te valideren. Deze methode is ontwikkeld door Ziekenhuisapotheek Noordoost Brabant (ZANOB) te Den Bosch. STIP DOA bestaat uit: Monstervoorbewerking met behulp van solid-phase extractie, chromatografische scheiding met behulp van HPLC methode, Diode Array detectie (DAD), identificatie middels S.T.I.P. Beta software en interpretatie van de resultaten.
De identificatie en de (semi)kwantificatie van STIP DOA is gebaseerd op de match van de retentietijd (Rt) en de match van het UV-spectrum. Daarom is als eerste de optimalisatie van de detectie uitgevoerd.
Daarna zijn er monsters zoals patiënten-, ringonderzoek- en controlemonsters
geanalyseerd op amfetamineachtige stoffen, benzoylecgonine en opiaten met behulp van de AxSYM autoanalyser en met behulp van de STIP DOA methode. Daarnaast zijn er ook sommige monsters geanalyseerd die stoffen bevatten die alleen maar met STIP DOA aantoonbaar zijn.
De codeïnemonsters zijn positief op opiaten gevonden met de autoanalyser als resultaat van de kruisreactiviteit, terwijl met de STIP DOA de drug herkend is als codeïne.
STIP DOA is getest op lineariteit, juistheid, herhaalbaarheid en recovery.
De lineariteit is getest op morfine en benzoylecgonine en voldoet voor deze twee stoffen aan de eisen binnen het lab.
De juistheid van de methode is bepaald voor amfetamine, morfine en benzoylecgonine met behulp van de controlestandaarden van de firma Abbott. In de bijsluiter zijn de spreidingsintervallen gegeven. De methode is nauwkeurig als de gemeten concentraties binnen de spreidingsintervallen liggen.
Voor amfetamine is de STIP DOA methode bij 0,50, 1,50 en 4,00 mg/L onjuist bevonden. Alle gemeten concentraties zijn lager dan de onderste waarde van het spreidingsinterval.
Voor morfine is de methode niet nauwkeurig bij 0,25 mg/L. Tegelijkertijd elueert er met morfine een urinepiek. Het resultaat daarvan is een verhoging van de gemeten
concentratie. Deze is hoger dan de bovenste waarde van het spreidingsinterval. Voor de concentratie van 0,50 en 0,80 mg/L is de methode juist.
STIP DOA is nauwkeurig bevonden voor benzoylecgonine bij concentraties van 0,50 en 3,00 mg/L. De controle met de concentratie van 1,50 mg/L is met -0,73% net onder de onderste waarde van het spreidingsinterval, wat de methode onjuist maakt voor deze concentratie.
Lucia Baljeu-Neuman 3 De herhaalbaarheid en recovery van STIP DOA zijn alleen getest op morfine.
In verband met de voornoemde matrixstoring is deze methode herhaalbaar bevonden voor morfine met concentraties vanaf 0,45 mg/L.
De recovery is gemiddeld 87,5 % bevonden.
De conclusie is dat de STIP DOA methode gebruikt kan worden ter bevestiging voor de resultaten van de AxSYM autoanalyser. Daarnaast is de STIP DOA methode geschikt voor intoxicaties van stoffen die niet aantoonbaar zijn met de autoanalyser zoals cathinone, fenyl-propanolamine en efedrine.
Lucia Baljeu-Neuman 4 Summary
The drug screening is now performed at the Clinical Pharmacological and Toxicological Laboratory at Erasmus MC Rotterdam using an autoanalyser. The benefits are that it is fast and requires no sample preparation. A disadvantage is that there is a risk of false positive results. The more the molecular structure between the analyte and another substance have in common, the more it will lead to a response. For example the presence of codeine in urine could lead to a positive result on opiates. Given that a false positive result may cause damage to the person being tested, a confirmation is required. The laboratory has to verify the positive result using another analytical techniques such as High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
This study aims to implement, optimize and validate the HPLC method Systematic Toxicological Identification Procedure of Drug of Abuse (STIP DOA). This method was developed by the Hospital pharmacy Noordoost Brabant (ZANOB) in Den Bosch.
STIP DOA consists of: sample preparation using solid-phase extraction, chromatographic separation using HPLC, Diode Array detection (DAD), identification with STIP Beta software and interpretation of the results.
Identification and (semi)quantification of STIP DOA is based on the match of the retention time (Rt) and the match the UV- spectrum. Therefore, the optimization of the detection is performed first.
Then there are monsters like patient samples, ring tests and control samples analyzed for amphetamine-like compounds, opiates and benzoylecgonine using the AxSYM auto analyzer and the STIP DOA method. In addition of that, some samples were analyzed which contained substances that only were detected with the STIP DOA.
The samples which contained codeine were found positive for opiates using the auto analyser, on the other hand the STIP DOA method recognized the drug as codeine.
The STIP DOA method is tested for linearity, accuracy, repeatability and recovery.
The linearity was tested on morphine and benzoylecgonine, and STIP DOA meets the lab's requirements for these two substances.
The accuracy of the method was tested on amphetamine, morphine and benzoylecgonine using the standard controls from the firm Abbott. The information leaflet gives the
concentration ranges. The method is accurate if the measured concentrations lie within the range intervals.
STIP DOA is found inaccurate for amphetamine at 0,50, 1,50 and 4,00 mg / L. All the measured concentrations are lower than the lower value of the range interval.
For morphine the method is not accurate at 0,25 mg / L. Morphine elutes with an urine peak simultaneously. The result of this is an increase in the measured concentration. This is higher than the upper limit of the range interval. At the concentration of 0,50 and 0,80 mg / L the method is accurate.
STIP DOA is found accurate for benzoylecgonine at concentrations of 0,50 and 3,00 mg / L. The standard control at 1,50 mg/L is with -0,73% slightly underneath the lower value of the range interval, which makes the method inaccurate for this
Lucia Baljeu-Neuman 5 The repeatability and recovery of STIP DOA are tested on morphine only.
In connection with the matrix interference which was mentioned before, this method is found repeatable on morphine for concentrations starting at 0,45 mg / L.
The average of the recovery was found on 87,5 %.
The conclusion is that STIP DOA method can be successfully used to confirm the results of the autoanalyser. In addition to that, it is possible using the STIP DOA method to identify substances which the autoanalyser cannot recognize such as phenyl -propanolamine, ephedrine of cathinone.
Lucia Baljeu-Neuman 6 Inhoudsopgave Samenvatting 2 Summary 4 Hoofdstuk 1: Inleiding 7 1.1 Doel onderzoek 8 1.2 Doelstelling 8 1.3 Hypothese 9
Hoofdstuk 2: Theoretische achtergrond 10
2.1 Referentie methode 10 2.1.1 Autoanalyser AxSYM 10 2.1.2 FPIA techniek 11 2.1.3 Kruisreactiviteit en meetbereik 12 2.2 STIP DOA 13 2.2.1 Inleiding 13
2.2.2 Beschrijving STIP DOA methode 13
2.3 Methode validatie 17
Hoofdstuk 3: Materiaal en methoden 18
3.1 Apparatuur en materialen 18 3.2 Software 18 3.3 Reagentia 19 3.4 Stockoplossingen 19 3.5 Werkwijze 20 3.5.1 Bereiding eluens 20 3.5.2 Voorbewerking monster 20 3.5.3 HPLC instellingen 21 3.5.4 Identificatie 21 3.5.5 Interpretatie 22 3.6 Flowschema 23 Hoofdstuk 4: Resultaten 24 4.1 Optimalisering detectie 24
4.2 Nawerken van de STIP DOA methode 25
4.3 Cross-validatie (schaduwdraaien) 27 4.3.1 Patiënten monsters 27 4.3.2 Ringonderzoekmonsters 28 4.3.3 Kruisreactiviteit 29 4.4 Methode validatie 30 4.4.1 Selectiviteit 30 4.4.2 Lineariteit 31 4.4.3 Juistheid 34 4.4.4 Herhaalbaarheid 36 4.4.5 Recovery 36 Hoofdstuk 5: Discussie 38 Hoofdstuk 6: Conclusie 39 Hoofdstuk 7: Aanbevelingen 40 Literatuurlijst 41
Lijst met afkortingen 42
Bijlage 1. De STIP DOA methode, ZANOB 43
Bijlage 2. Controlestandaard ZANOB, UV-spectra en structuren 45
Bijlage 3. STIP Beta bibliotheek 48
Bijlage 4. Blanco urine chromatogrammen 49
Bijlage 5. Morfine - Excel optie regressie 51
Lucia Baljeu-Neuman 7 Hoofdstuk 1: Inleiding
Het uitvoeren van de toxicologische analyses in patiëntenmateriaal (bloed, plasma, urine) is één van de werkzaamheden van het Klinisch Farmacologisch en Toxicologisch
Laboratorium van de Apotheek van het Erasmus Medisch Centrum (EMC) te Rotterdam. Er worden hier verschillende analysemethodes gebruikt om de stoffen te identificeren en kwantificeren.
Bij drugsmisbruik wordt een drugs screening uitgevoerd als vervolg op een routinematige controle, voor verschillende studies, ringonderzoeken of in spoedsituaties wanneer er bijvoorbeeld patiënten met vermeend drugsgebruik op Spoed Eisende Hulp (SEH) zijn. De analyse wordt op urine uitgevoerd, omdat urine namelijk op een makkelijke en een niet – invasieve wijze kan worden afgenomen. Bovendien zijn de drugs in urine een langere tijd aantoonbaar dan in bloed (zie tabel 1).
Het testen op het gebruik van drugs kan verschillende redenen hebben, bijvoorbeeld: - bij het verlenen van medische (spoed)hulp aan een patiënt,
- het voorkomen van onveilige situaties bij derden,
- te hanteren als criterium ten behoeve van acceptatie tot een maatschappelijke voorziening,
- het in stand houden van orde, discipline en veiligheid binnen (straf)inrichtingen, - het preventief voorzijn van oneerlijk spelgedrag als bij bijvoorbeeld
sportevenementen,
- ten behoeve van het accumuleren van bewijslast bij criminele zaken en - ten behoeve van het uitvoeren van analyses en/of experimenten met een
wetenschappelijke grondslag. [1]
Drugs screening wordt nu uitgevoerd met behulp van de autoanalyser AxSYM van de firma Abbott. De voordelen hiervan zijn dat het snel is en er geen voorbewerking van het monster nodig is. Een nadeel is dat er soms vals positieve resultaten uit kunnen komen. Hoe meer verwantschap er in de moleculaire structuur bestaat tussen de te bepalen stof en een andere stof, hoe groter de kans op respons. Bijvoorbeeld de aanwezigheid van codeïne in urine kan leiden tot een positief resultaat op opiaten.
Gezien het feit dat een vals positief resultaat gevolgschade kan hebben voor de geteste persoon, bijvoorbeeld rijden onder invloed van drugs of drugsgebruik tijdens de
zwangerschap of een wedstrijdsport, dient het laboratorium een positief screening resultaat te kunnen bevestigen met behulp van een andere analysetechniek, zoals bijvoorbeeld High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Een van de HPLC analysen die in de Nederlandse ziekenhuizen gebruikt wordt voor drugs bepalingen in urine is Systematische Toxicologische Identificatie Procedure Drugs Of Abuse (STIP DOA). Deze methode is ontwikkeld door Ziekenhuisapotheek Noordoost Brabant (ZANOB) (zie bijlage 1). STIP DOA is uitgevoerd, geoptimaliseerd en
(gedeeltelijk) gevalideerd op het laboratorium van de apotheek bij Erasmus MC te Rotterdam.
De theoretische achtergrond van de STIP DOA methode en de AxSYM methode worden in hoofdstuk 2 uitgebreid beschreven. Vervolgens worden de materialen en de
werkzaamheden uitgelegd (hoofdstuk 3). De resultaten van de experimenten zijn in hoofdstuk 4 gepresenteerd. Daarna volgen de discussie (hoofdstuk 5) en de conclusie (hoofdstuk 6). Tenslotte zijn in hoofdstuk 7 de aanbevelingen terug te vinden.
Lucia Baljeu-Neuman 8
1.1 Doel onderzoek
Het doel van dit onderzoek is de bestaande methode Systematische Toxicologische Identificatie Procedure van drugsmisbruik (STIP DOA), die bij ZANOB (Ziekenhuisapotheek Noordoost Brabant) gebruikt wordt, uit te voeren, te optimaliseren en te valideren.
1.2 Doelstelling
In de huidige situatie wordt bij het Erasmus MC de drugs screening in urine met behulp van de autoanalyser AxSYM uitgevoerd. De uitslag van de drugs screening wordt als negatief of positief gerapporteerd. Als de urine van de patiënt minder drugs dan de cut-off waarde bevat, is de uitslag negatief gerapporteerd en als de hoeveelheid van de drug in de urine hoger dan de cut-off waarde is, wordt de uitslag als positief gerapporteerd.
De “cut-off “ – waarde (afkapwaarde) is de concentratie van de betreffende drug
waarboven een uitslag als positief wordt beoordeeld. De cut-off waarde is zo vastgesteld dat de kans op een fout-positieve uitslag klein is.
Voorgeschreven cut-off waarden en de ijkstoffen voor de autoanalyser AXSYM zijn in tabel 1 weergegeven. De autoanalyser is gekalibreerd op deze waarden.
De richtlijnen voor de afkapwaarden zijn in het rapport “Onderzoek op Druggebruik” van de Gezondheidsraad uit 1998 te vinden.[2]
Tabel 1. Cut-off waarde en de aantoonbaarheid voor de drugs screening in urine [2]
Drug IJkstof Cutt-off waarde (mg/L) Gemiddelde detectietijd
Opiaten morfine 0,30 2-6 dagen
Amfetamineachtige d-amfetamine 1,00 1-3 dagen
Cocaïne benzoylecgonine 0,30 2-6 dagen
Methadon methadon 0,25 2-6 dagen
Cannabinoïden 11-nor-∆9-THC-9-COOH 0,05 10-14 dagen Benzodiazepinen desmethyldiazepam 0,20 1 dag – 2 weken
Barbituraten secobarbital 0,20 2-7 dagen
De reden voor de ontwikkeling van een andere methode is om de positieve uitslagen van de autoanalyser AXSYM te kunnen controleren, confirmeren en de eventuele vals positieve resultaten te identificeren.
Een bevestigingsonderzoek is in sommige gevallen noodzakelijk. Bijvoorbeeld voor het testen van monsters die afkomstig zijn van pasgeboren kinderen. Hierbij worden de cut-off waarden niet gehanteerd, omdat er ook rekening dient te worden gehouden met de gesteldheid van de moeder. De aanwezigheid van drugs in de urine van de baby moet dan ook bevestigd worden door een andere analysemethode in verband met de (juridische) consequenties voor de moeder.
Lucia Baljeu-Neuman 9
1.3 Hypothese
De identificatie van de drugs in urine met behulp van STIP DOA is gebaseerd op de match van de retentietijd (Rt) en het UV-spectrum. Men verwacht daardoor dat de drugs individueel (en niet als klasse) onderscheiden en geïdentificeerd kunnen worden.
Bijvoorbeeld bij een positieve uitslag met behulp van de autoanalyser AxSYM op opiaten kan men de opiaat identificeren als morfine, monoacetyl-morfine, hydromorfon of codeïne. Hetzelfde geldt ook voor de amfetamineachtige drugs.
Men verwacht dat de STIP DOA methode ook in gebruik zal worden genomen op het Klinisch Farmacologisch en Toxicologisch Laboratorium van de Apotheek bij Erasmus MC te Rotterdam.
Lucia Baljeu-Neuman 10
Hoofdstuk 2: Theoretische achtergrond
2.1 Referentie methode
Voor de bepaling van drugs in urine wordt tegenwoordig op het Klinisch Farmacologisch en Toxicologisch Laboratorium van Erasmus MC te Rotterdam de autoanalyser AxSYM van de firma Abbott gebruikt. De methode is gebaseerd op de Fluorescence Polarisation Immunoassay (FPIA) techniek.
2.1.1 Autoanalyser AxSYM
De AxSYM van de firma Abbott is een geautomatiseerd apparaat dat immunochemische analyses uitvoert (figuur 1). Het apparaat kan 60 tot 120 tests per uur uitvoeren
afhankelijk van het type test. Voor de drugs screening maakt de AxSYM gebruik van de Fluorescentie Polarisatie Immunoassay (FPIA) technologie. Het is een semikwantitatieve analyse, waardoor de resultaten als positief of negatief worden gerapporteerd (zie hoofdstuk 1.1).
Figuur 1: Het Abbott AxSYM apparaat
Voor een screening op opiaten, amfetamineachtige stoffen, cocaïne metaboliet benzoylecgonine, methadon, cannabinoïden, benzodiazepinen en barbituraten is er 400 µL urinemonster benodigd. Er worden controlestandaarden gebruikt (tabel 15) en specifieke reagentiakits.
Een reagentiakit voor drugsbepaling bevat drie flesjes met daarin: - antilichaam in een buffer met eiwit stabilisator (flesje1);
- voorverdunningsoplossing, buffer met eiwit stabilisator (flesje 2);
Lucia Baljeu-Neuman 11 In het Sampling Center wordt de nodige hoeveelheid reagentia en monster gepipetteerd in de verschillende putjes van de reactie buis). In een apart putje wordt het monster samen met een lijnverdunningsoplosmiddel (die zich in het voorraad centrum bevindt)
gepipetteerd. Verder wordt een deel van deze oplossing gemengd met het
voorverdunningsoplosmiddel (van flesje 2), het antilichaam ( van flesje 1) en meer lijnverdunningsoplosmiddel om vervolgens direct te worden overgebracht naar het Processing Center. Hier wordt tenslotte de tracer toegevoegd (van flesje 3) waarna de competitieve bindingsreactie begint.
De intensiteit van het gepolariseerde licht wordt door de FPIA optische montage gelezen. Het resultaat wordt door het Systeem Controle centrum geproduceerd.
2.1.2 FPIA techniek
Een immunoassay bestaat uit een competitieve bindingsreactie van een antilichaam met twee soorten antigenen: antigenen van het monster en gelabelde antigenen gekoppeld aan fluoresceïne (tracer) van de reagentia. Het gelabelde antigeen (analyte-tracer) strijdt met de antigenen van het monster (analyte) om zich aan de beperkte bindingsplaatsen van het antilichaam (antibody) te binden.(figuur 2)
Figuur 2. Competitieve bindingsreactie
Een antilichaam bestaat uit een groot eiwitproduct (albumine) dat in staat is om aan een antigeen te koppelen. De antilichamen worden gebruikt als een reagens om chemische substanties te detecteren.
Sommige antilichamen zijn zeer specifiek als bijvoorbeeld de antilichamen voor benzoylecgonine, andere hebben een lagere specificiteit, bijvoorbeeld de antilichamen voor opioïden en amfetamineachtige stoffen. Hierbij is er sprake van een groepsreactie.
Het gelabelde antigen en het antigen van het monster gaan een competitie aan om zich aan het beperkt aantal bindingsplaatsen op het antilichaam te binden.
De polarisatiefluorescentie techniek is gebaseerd op de roterende eigenschappen van moleculen in oplossing. Een antigen dat aan het antilichaam gebonden is zal langzamer roteren dan een vrij antigen. Het verschil tussen gebonden en ongebonden antigen is een maat voor de polarisatie van het licht.
Als de concentratie van het antigen in het monster hoog is, dan binden deze zich aan het antilichaam en blijven de gelabelde antigenen vrij. Deze kleine moleculen roteren sneller waardoor ze het licht in alle richtingen emitteren met als gevolg een afname van de polarisatie.(figuur 3)
Lucia Baljeu-Neuman 12 Als de concentratie van het antigen in het monster laag is, dan binden de gelabelde
antigenen zich aan het antilichaam. Deze grote moleculen roteren traag waardoor ze het licht in een richting emitteren, waardoor een toename van de polarisatie plaats
vindt.(figuur 4)
Figuur 4. Monster met lage concentratie antigen (de polarisatie neemt toe)
De AxSYM software berekent de concentraties van drugs in de monsters.
Voor elk component of klasse componenten is er een zespunts kalibratielijn opgeslagen in het geheugen. De concentratie van een bepaalde stof in een monster is berekend op basis van deze kalibratielijn met behulp van de polarisatiewaarde die het monster genereerde.
2.1.3 Kruisreactiviteit en meetbereik
In de “Customer Service” brochure van firma Abbott zijn de stoffen met gelijksoortige structuur (of degene die gelijktijdig gebruikt worden) die kruisreactiviteit kunnen
veroorzaken vermeld. [3-5] In tabel 2 zijn de meest voorkomende kruisreactieve stoffen vermeld samen met het meetbereik en andere specifieke eigenschappen van de AxSYM methode.
Tabel 2. De specifieke eigenschappen van de AxSYM methode
Component IJkstof Afkapwaarden (mg/L) Meetbereik AxSYM (mg/L) Kruisreactiviteit Opiaten morfine 0,30 0,025 1,00 6-acetylmorfine codeïne dihydrocodeïne ethylmorfine hydromorfon hydrocodon Amfetamine- achtige d-amfetamine 1,00 0,100 8,00 l-amfetamine methamfetamine MDA MDEA MDMA Benzoylecgonine benzoylecgonine 0,30 0,030 5,00 cocaïne ecgonine ecgonine methylester
Lucia Baljeu-Neuman 13
2.2 STIP DOA 2.2.1 Inleiding
De Systematische Toxicologische Identificatie Procedure (STIP) werd in 1987 ontwikkeld voor de toxicologische screening in plasma door het laboratorium van de ZANOB
(voormalige Centrale Ziekenhuis Apotheek) in Den Bosch. Deze methode heeft in de Nederlandse ziekenhuizen de screening met behulp van dunne laag chromatografie vervangen.
De Systematische Toxicologische Identificatie Procedure (STIP) bestaat uit: - monstervoorbewerking met behulp van vloeistof-vloeistof extractie, - chromatografische scheiding met behulp van High Performance Liquid
Chromatography (HPLC), - Diode Array detectie,
- identificatie middels een speciaal software pakket (S.T.I.P. Beta), - interpretatie van de resultaten.
Sinds 2006 is de STIP methode aangepast voor de drugsbepaling in urine, onder de naam Toxicologische Identificatie Procedure voor Drugs of Abuse (STIP DOA).
STIP DOA is een afgeleide methode van STIP en bestaat dus uit dezelfde stappen die hiervoor voor STIP beschreven zijn.
De belangrijke verschillen tussen deze twee methoden zijn: - de matrix: urine voor STIP DOA en plasma voor STIP; - het volumemonster: 0,1 mL urine versus 2 mL plasma;
- de monstervoorbewerking: solid-phase extractie (SPE) in plaats van vloeistof – vloeistof extractie. SPE wordt verder in het verslag nog nader uitgelegd.
- de retentietijden: omdat het eluens voor STIP DOA 91 % water bevat (bij STIP is dat slechts 53%), zijn de retentietijden langer waardoor er sprake is van een betere scheiding (zie bijlage 1);
- het injectievolume: voor STIP DOA is dit 50 µL (i.p.v. 20 µL voor STIP) voor een voldoende respons;
- de “Concentration Multiplication Factor” (CMF): is 0,4 voor STIP DOA en 0,1 voor STIP. De 0,1 waarde komt uit het feit dat het plasmamonster tien keer
geconcentreerd wordt voordat het geanalyseerd is. De waarde voor STIP DOA is 0,4 want het monster wordt niet geconcentreerd maar er wordt 2,5 keer meer
geïnjecteerd dan bij het plasmamonster. De CMF is belangrijk voor de berekening van de concentratie van de stoffen (zie formule 2 verder op).
Om het verschil te tonen tussen de twee systemen STIP DOA en STIP, schrijft de
identificatie software de namen van de gevonden stoffen bij de STIP DOA in hoofdletters.
2.2.2 Beschrijving STIP DOA methode
STIP DOA methode bestaat uit: Monstervoorbewerking, chromatografische scheiding m.b.v. HPLC, Diode Array detectie, identificatie middels S.T.I.P. Beta en interpretatie van de resultaten. Deze punten worden in de volgende paragrafen nader toegelicht.
• Monstervoorbewerking m.b.v. SPE
Een urinemonster bevat veel metabolieten en de kans op storing door co-medicatie is dan ook groot. Daarom is het noodzakelijk om eerst de onzuiverheden te verwijderen. Dit voorkomt de vervuiling van de analytische kolom en verhoogt daardoor de levensduur. Tegelijkertijd worden de gewenste componenten geconcentreerd en geïsoleerd van de matrix.
Lucia Baljeu-Neuman 14 Er is bij de solid-phase (vaste stof) extractie (SPE) gewerkt met een vacuüm Manifold
installatie. Deze methode is sneller en minder bewerkelijk dan vloeistof - vloeistof extractie. Bovendien zijn de recoveries hoog en reproduceerbaar, is de selectiviteit van stationaire fase groot en zijn de extracten zo schoon dat ze zelfs voor Liquid
Chromatography met Mass Spectrometry-detectie (LCMS) geschikt zouden zijn.
De gebruikte SPE-kolom is de “Bakerbond Narc TM -2 Speedisk PN 8175” (3 ml) van de producent J.T. Baker. De elutie wordt onder vacuüm uitgevoerd met behulp van een vacuüm – Manifold installatie.
De stationaire fase is een mengsel van apolair reverse phase (RP) octadecylsilaan (C-18) en actieve silanolgroepen (kationwisselaar) gebonden op silicagel. De silanolgroepen zijn zwakzure groepen en kunnen positief geladen ionen (kationen) uitwisselen.
De silicadeeltjes van de SPE-Speedisk zijn groter (10 µm in doorsnede)dan de deeltjes die in een HPLC-kolom gebruikt worden, waardoor het oplosmiddel sneller doorstroomt. De gewenste stoffen van het monster worden geadsorbeerd op de vaste stof en daarna zuur en/of basisch ge-elueerd.
Het urinemonster bevat zowel neutrale als zure en basische stoffen en een gecombineerde SPE-kolom (RP en kationwisselaar) is daarom het beste keuze.
De SPE-kolom wordt eerst geconditioneerd en geactiveerd met een (1 ml) basische acetonitril oplossing (3% ammonia in acetonitril) en daarna met (1 ml) zure
citroenzuurbuffer (pH 3,0). Acetonitril bevochtigt het oppervlak van het adsorptiemiddel en zorgt voor het activeren van de octadecylsilaan en de citroenzuurbuffer voor het activeren van de silanolgroepen.
Het urinemonster (0,1 ml) wordt opgebracht samen met (3 ml) citroenzuurbuffer pH 3,0. De buffer zorgt er voor dat de basische stoffen van het monster geprotoneerd worden en zich aan de actieve zwakzure silanolgroepen binden. Het vacuüm moet zo geregeld worden dat er ca. 1 druppel per seconde door de kolom trekt om voldoende tijd te hebben voor de interactie met de stationaire fase.
De zure en neutrale stoffen van het urinemonster binden zich aan de octadecylsilaan en de basische stoffen aan de actieve silanolgroepen van de stationaire fase van de SPE kolom.
Als de kolom droog is, worden de zouten en verdere verontreinigingen met (3 ml) gedistilleerd water weggespoeld terwijl de zure, neutrale en de basische stoffen op de SPE kolom geadsorbeerd blijven (fractie 1).
Met (3 ml) ACN worden de zure en neutrale stoffen uit de kolom weggespoeld (fractie 2).
Door het elueren met (3 ml) basische acetonitril oplossing (3% ammonia in ACN) worden de basische stoffen van de kolom uitgewisseld met ammonia (sterkere base) en uit de SPE kolom weggespoeld (fractie 3). In het basische eluaat bevinden zich de opiaten, amfetamineachtige stoffen en benzoylecgonine.
Het basische eluaat (fractie 3) wordt droog gedampt onder een stikstof- of luchtstroom bij 40 0C, en vervolgens in 0,1 ml STIP DOA eluens opgelost. Deze oplossing wordt verder m.b.v. STIP DOA methode geanalyseerd.
Lucia Baljeu-Neuman 15
• Chromatografische scheiding
STIP DOA is een isocratische, reverse phase (RP) en kation exchange HPLC methode. In reverse phase chromatografie is de stationaire fase apolair en de mobiele fase polair. Een kationwisselaar is voorzien van (zwak) zure groepen die positieve ionen (kationen) kan uitwisselen.
De stationaire fase van de STIP DOA kolom bestaat uit silicadeeltjes (5 µm in doorsnede) waaraan apolaire (RP) octadecylsilaan (C-18) en zwakzure actieve silanolgroepen
(kationwisselaar) gebonden zijn. Er wordt ook een voorkolom gebruikt, om de levensduur van de analytische kolom te verlengen.
Een endcapped RP kolom is een kolom waarin de onregelmatige silanolgroepen die zich op het silicaoppervlak bevinden, via een secundaire bindingsstap worden omgezet zodat er geen ongewenste secundaire interacties plaats kunnen vinden.
De mobiele fase bestaat uit: 910 ml Milli-Q water, 146 µl Triethylamine (TEA) en circa 700
µl fosforzuur 85% (zie hoofdstuk 3.5.1 bereiding eluens). De pH wordt op 3,5 gesteld (met KOH 10%) en daarna wordt 90 ml acetonitril toegevoegd.
Het STIP DOA eluens bevat 91% water waardoor de (apolaire en minder polaire)
componenten langer op de analytische kolom blijven met als resultaat een betere scheiding.
Triethylamine is een concurrerende base. Deze zorgt ervoor dat de basische
componenten sneller van de actieve silanolgroepen afkomen. Dit zorgt ook voor een betere vorm van de pieken (minder tailing).
Het fosforzuur activeert de silanolgroepen. De hoeveelheid gebruikt fosforzuur is afhankelijk van het aantal actieve silanol-groepen van de kolom.
Het zure milieu (pH 3,5) zorgt voor het protoneren van de stikstoffen van de basische stoffen van het urinemonster.
• Detectie
Er wordt een diode array detector (DAD) gebruikt. Deze neemt het UV- absorbtiespectrum van het monster op. De spectra worden met een deuteriumlamp in het ultraviolet gebied opgenomen, dat tussen 190 en 380 nm ligt.
Voor een maximale gevoeligheid, worden de spectra gelezen bij 200 nm, omdat de te bepalen componenten een maximum absorptie rond deze waarde vertonen
(zie bijlage 2).
Om ervoor te zorgen dat de stoffen van het urinemonster door de S.T.I.P. Beta software herkend kunnen worden, dient de DAD goed gekalibreerd te zijn.
• Identificatie
Eerst wordt gecontroleerd of de pieken van het verkregen chromatogram goed
geïntegreerd zijn. Indien nodig, worden deze handmatig geïntegreerd. Daarna wordt per piek het spectrum gelezen en opgeslagen. Verder wordt m.b.v. het speciale software pakket S.T.I.P. Beta het spectrum van de onbekende stof vergeleken met de spectra van de ingestelde bibliotheek.
De beste match (maximum is 1,0000) van de retentietijden en van de spectra worden in beeld gebracht. Belangrijk om te weten is dat de match voor de STIP DOA met
Lucia Baljeu-Neuman 16 De match is berekend volgens de formule 1 en de concentratie indicatie volgens de
formule 2.
∑
∑
∑
∑
∑
∑
∑
)
n
)
Y
Y
(
)*
n
)
X
X
(
n
Y
*
X
-XY
=
MATCH
2 n =1 i 2 n =1 i 2 n =1 i 2 n =1 i n =1 i n =1 i n =1 i 2(
-(
-X = absorptie onbekende stof Y = absorptie stof van databank
n = het aantal datapunten tussen de minimale en maximale golflengte Formule 1. Spectrum - match berekening
*cmf
r
100
*
C
*
n
)
Y
Y
n
Y
*
X
-XY
=
Conc
y 2 n =1 i 2 n =1 i n =1 i n =1 i n =1 i(
-∑
∑
∑
∑
∑
Conc = concentratie-indicatie onbekende stof X = absorptie onbekende stof
Y = absorptie stof van databank
n = het aantaal datapunten tussen de minimale en maximale golflengte CY = concentratie bekende stof (van databank)
r = recovery
cmf = concentratie vermenigvuldigfactor Formule 2. Concentratie-indicatie berekening
• Interpretatie van de resultaten
Als het spectrum van het urinemonster overeenkomt met een spectrum van een stof in de bibliotheek (een match > 0,99) en het verschil tussen hun retentietijden niet groter is dan 15%, dan is de onbekende stof geïdentificeerd.
De conclusies dienen getrokken te worden door het samenvoegen van informatie verstrekt door de retentietijden, de match van de UV spectra, maar ook door de aanwezige metabolieten.
De eindconclusie wordt samen met de apotheker getrokken. Deze houdt ook rekening met de klinische symptomen van de patiënt.
Lucia Baljeu-Neuman 17
2.3 Methode validatie
Bioanalytische validatie van de methode omvat alle procedures die aantonen dat een bepaalde methode voor kwantitatieve meting van analyten in een bepaalde biologische matrix, als bijvoorbeeld bloed, plasma, serum of urine, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn voor het beoogde gebruik.
De “Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation”, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) en Center for Veterinary Medicine (CVM), van May 2001 [6] bevat algemene aanbevelingen voor bioanalytische methode validatie.
Er zijn drie soorten validaties: volledige, gedeeltelijke en cross- validatie.
- volledige validatie: er worden parameters als specificiteit, selectiviteit, precisie,
juistheid, lineariteit, bereik, gevoeligheid, detectiegrenzen, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid, recovery, robuustheid en stabiliteit getest. Volledige validatie is belangrijk bij het ontwikkelen en implementeren van een nieuwe methode, een nieuw geneesmiddel of als er nieuwe metabolieten worden toegevoegd aan een bestaande assay voor de kwantificering.
- gedeeltelijke validatie: de gevalideerde parameters kunnen variëren van één tot
alle parameters van een volledige validatie. Gedeeltelijke validatie is gebruikelijk als er wijzigingen zijn met betrekking tot de matrix, de instrumenten, concentratie gebied of bij het in gebruik nemen van een methode van andere laboratoria.
- cross-validatie: vergelijking van twee of meer bioanalytische methoden. Een
voorbeeld van cross-validatie is wanneer een gevalideerde methode (comparator) als referentie voor de nieuwe methode wordt gebruikt.
Daar de STIP DOA methode reeds in gebruik is bij het ZANOB laboratorium kan de methode op het Erasmus MC laboratorium in gebruik worden genomen na een gedeeltelijke validatie. De parameters die gevalideerd dienen te worden zijn door de leidinggevende in overleg met de apotheker bepaald.
De volgende parameters worden gevalideerd: selectiviteit, lineariteit, juistheid, recovery en herhaalbaarheid. De resultaten van de STIP DOA methode worden ook vergeleken met degene van de autoanalyser AxSYM (cross- validatie).
Lucia Baljeu-Neuman 18 Hoofdstuk 3: Materiaal en methoden
In dit hoofdstuk worden eerst de benodigde apparatuur, software en reagentia die nodig zijn voor het uitvoeren van de STIP DOA methode vermeld. Daarna volgt er een
gedetailleerde beschrijving van de werkwijze ervan.
3.1 Apparatuur en materialen
Onderstaande materialen zijn benodigd voor de drugs screening in urine.
Voor de monstervoorbewerking:
• Vacuüm pomp (Heto-Holten),
• Indampblok (Liebisch),
• Vacuüm Manifold installatie en
• SPE kolom ‘Bakerbond Narc TM -2 Speeddisk PN 8175’ (3 ml). Voor de chromatografische scheiding
Het HPLC- systeem bestaat uit:
• System Controler Shimadzu SCL-10A VP,
• Auto sampler: Shimadzu SIL-10D VP,
• Kolomoven: Shimadzu CTO-10A VP,
• Pomp: Shimadzu LC-10AD VP,
• Degasser: Shimadzu DGU-14A degasser,
• Mengkamer: Shimadzu FCV10AL VP Low Pressure Gradient Valve en
• Diode Array Detector: Shimadzu SPD – M 10A VP.
• Kolom: LiChrospher ®100 RP-18 endcapped ” 125 x 4 mm, 5 µm deeltjesgrootte, Merck
• Voorkolom: ChromSep Guard Column SS 10x2 mm, Reversed Phase, Varian Overige apparatuur: • Analytische balans, • Millipore MQ Synergy, • Koelkast / vriezer, • pH-meter. Overige materialen:
• Glazen vials, buizen en flesjes,
• Maatcilinders van 100 ml en 1000 ml,
• Eppendorf automatische pipetten (0,1 ml tot 5 ml) en pipettenpunten.
3.2 Software
• LC Solution, versie 1.21, Shimadzu
Lucia Baljeu-Neuman 19
3.3 Reagentia
De volgende reagentia, grondstoffen, calibratiecontroles en controlestandaarden zijn gebruikt:
• acetonitril (ACN) supragradient HPLC kwaliteit, Bisolve Chemicals,
• fosforzuur 85%,P.A., Merck (Art. nr. 100030),
• kaliumhydroxide P.A.,Merck, (Art. nr. 1.05033.0500),
• ammonia solution 25% Suprapur, Merck (Art.nr. 1.05432.1000),
• triethylamine (TEA) HPLC grade, Fisher Scientific (Art. nr. T/3203/07),
• bufferoplossing pH 3,00 CertiPUR , Merck (Art.nr. 1.09434.1000),
• controlestandaard STIP/DOA (testmengsel), Lot 20091027, ZANOB,
• cocaïne metaboliet calibratie standaarden, Abbott,
• controlestandaarden (multicomponent low, medium, high), Abbott,
• morfine HCl 3-water, P.A.,Spruyt Hillen (Art. nr. 224010) en
• codeïne diwaterstofffosfaat hemihydraat, P.A., Spruyt Hillen (Art. nr. 228410).
3.4 Stockoplossingen
• morfine stockstandaard 1
14,7 mg morfine HCl 3-water (M= 375,8) is in 100 mL methanol opgelost. Dit komt overeen met 111,16 mg/L morfine (M= 285,34). Hieruit is een werkoplossing met een concentratie van 1,12 mg/L gemaakt (1 ml. stockoplossing 1 in 100 ml. demiwater). Verder zijn de verdunningen voor het testen van de lineariteit en herhaalbaarheid volgens tabel 3 gemaakt.
Tabel 3. Morfine verdunningen
Verdunning Volume werkoplossing (mL) Volume water/urine (mL) Concentratie (mg/L) A 1 1 0,558 B 1 2 0,372 C 1 3 0,279 D 1 4 0,2232 • morfine stockstandaard 2
Er is 20 mg morfine HCl 3-water (M= 375,8) in 100 mL methanol opgelost. Dit komt overeen met 151,86 mg/L morfine (M= 285,34).
• codeïne stockstandaard
Er is 18,6 mg codeïne diwaterstoffosfaat 0,5-water (M = 406,44) in 100 mL methanol opgelost. De concentratie codeïne (M = 299,36) is 137,0 mg/L.
Lucia Baljeu-Neuman 20
3.5 Werkwijze
Hier worden de eluensbereiding, monstervoorbewerking, HPLC instellingen en de identificatieprocedure met de bijbehorende interpretatie beschreven.
3.5.1 Bereiding eluens
Een liter eluens wordt als volgt bereid:
• 910 ml Milli-Q water
• 146 µl triethylamine (TEA) (N(CH2CH3)3) • [(STIP - factor ) x 705] µl fosforzuur 85%.
• tot pH 3,5 met kaliumhydroxide (KOH) 10% brengen
• 90 ml acetonitril (ACN) toevoegen.
De STIP-factor wordt gebruikt om het verschil in de hoeveelheid actieve silanolgroepen per kolom te compenseren. De kolom is getest door ZANOB en de STIP-factor wordt vermeld in het kolomcertificaat. Bijvoorbeeld de STIP-factor van de gebruikte kolom is 0,993.
3.5.2 Voorbewerking monster
Het monster is in de volgende stappen voorbewerkt met behulp van solid-phase extractie:
Stap 1 - Conditioneren/ Activeren:
Eerst wordt er 1 ml. 3% ammonia 25% in acetontril oplossing in elke SPE kolom gepipetteerd en daarna 1 ml. citroenzuurbuffer pH 3,0. Er wordt een laagje citroenzuurbuffer op het oppervlak van de kolom gelaten.
Stap 2 - Monster opbrengen:
Het monster (100 µl) wordt samen met 3 ml buffer oplossing pH 3,0 opgebracht. Het vacuüm wordt zo geregeld dat er circa 1 druppel per seconde doorgaat.
Stap 3 – Wassen:
De SPE-kolom is met 3 ml. demiwater afgespoeld.
Stap 4 - Zure elutie
De zure (en neutrale) componenten zijn met 3 ml acetonitril geelueerd (fractie 1). Deze fractie is verder niet geanalyseerd met de STIP DOA methode, maar kan geanalyseerd worden met de STIP methode.
Stap 5 – Basische elutie:
De basische componenten zijn met 3 ml 3% ammonia 25% in acetontril geelueerd (fractie 2). Hierin bevinden zich de target drugs van STIP DOA (amfetamineachtige stoffen, benzoylecgonine en opiaten).
Het basische eluaat (fractie 2) is droog gedampt bij 40 ºC (indampblok of een waterbad) onder lucht- of stikstofstroom. Het residu is in 100 µl eluens opgelost en is verder met behulp van de HPLC geanalyseerd.
Lucia Baljeu-Neuman 21
3.5.3 HPLC instellingen • Autosampler:
- spoelvolume 0,2 mL (voor bemonstering) - spoelsnelheid 0,035 mL/sec
- bemonsteringssnelheid 0,015 mL/sec. - injectievolume 50 µL
• Oven:
- temperatuur 25 0C. Soms was deze circa 28 0C, omdat de ventilatie van het lab onvoldoende was. • DAD: - Deuterium (D2) lamp - golflengte interval 196 - 366 nm, - bemonsteringsfrequentie 1,5625 Hz - runtijd 50 min. • Pomp: - isocratische methode - flow 0,6 mL/min. 3.5.4 Identificatie
Het chromatogram is in de postrun van LC-Solutions bekeken (bij 200 nm). Indien nodig is de basislijn gecorrigeerd en zijn de pieken opnieuw geïntegreerd. Op de maximumhoogte van de piek is het UV spectrum bekeken en op de zuiverheid van de piek gelet. Daarna is dit spectrum met behulp van de S.T.I.P. Beta software geïdentificeerd (zie figuur 5).
Lucia Baljeu-Neuman 22
3.5.5 Interpretatie
Als de retentietijd en het UV-spectrum van de onbekende stof overeenkomen met een specifieke stof van de bibliotheek, is deze geïdentificeerd.
Door de recoveries in te voeren is de concentratie-indicatie berekend.
Bijvoorbeeld in figuur 5 is de onbekende stof geïdentificeerd als efedrine en de concentratie-indicatie is 0,91 mg/L.
Lucia Baljeu-Neuman 23
3.6 Flowschema
Het flowschema dat tijdens de praktijkuitvoering gevolgd is, wordt hierna weergeven.
Figuur 6. STIP DOA flowschema
Conditioneren: 1 ml 3% ammonia 25% in ACN
Activeren:1 ml citroenzuurbuffer pH 3,0
Monster opbrengen :
0,1 ml urine + 3 ml citroenzuurbuffer pH 3,0
SPE-kolom wassen: 3 ml MilliQ-water
Zure elutie: 3 ml ACN
Basische elutie: 3 ml 3% ammonia 25% in ACN
M o n s te rv o o rb e w e rk in g
Basische eluaat droog dampen ( 40 °C/ perslucht) ; het residu in 0,1 ml eluens oplossen
Eluens maken:
910 ml water + 0,146 ml TEA + 0,7 ml H3PO4 op pH 3,5 brengen met KOH 10%; voeg 90 ml ACN toe
Maak de methode aan: - flow 0,6 ml/min - oventemperatuur 25 0 C - λ 196-366 nm - injectievolume 50 µl - looptijd 50 min. H P L C - D A D s c h e id in g e n d e te c ti e
Open het STIP Search programma
- zoek voor elke piek die een spectrum vertoont de beste match met de spectra van de bibliotheek
R e s u lt a te n b e o o rd e le n
Lucia Baljeu-Neuman 24 Hoofdstuk 4: Resultaten
In dit hoofdstuk staan de uitslagen van de experimenten vermeld die op het laboratorium uitgevoerd zijn. Als eerste is de optimalisatie van de detectie behandeld gevolgd door de nabewerkingen volgens de STIP DOA methode. Als laatste komen de cross-validatie en de methode validatie aan bod.
4.1 Optimalisering detectie
Voor dit onderzoek wordt de SPD–M 10A VP diode array detector van de firma Shimadzu gebruikt. De spectra worden met een deuteriumlamp in het ultraviolet gebied
(190 en 380 nm) opgenomen.
Gezien het algoritme van de spectrum-match berekening (zie formule 1, hoofdstuk 2.2.2), is het aantal data punten tussen de minimale en maximale golflengte(n) beslissend voor de herkenning van de onbekende stoffen. Voor de Shimadzu DAD is experimenteel bepaald dat er 170 punten tussen de minimale en de maximale golflengte nodig zijn.
De bepaling is als volgt uitgevoerd: Een bekende stof met een bekende concentratie wordt geanalyseerd op verschillende UV-intervallen van 170 punten breed, beginnend met 190-360 nm en eindigend met 200-370 nm. De match en de concentratie-indicatie zijn met behulp van S.T.I.P. Beta software gelezen. Het optimale detectie-interval is het interval waarbij de beste match van de spectra (> 0,99) verkregen wordt en de
concentratie-indicatie het dichtst bij de theoretische concentratie ligt.
Bij het optimaliseren van de detectie is het gebruikelijk om een stof die een spectrum met specifieke kenmerken heeft te gebruiken voor de afstemming van de detector. Hier zou benzoylecgonine de beste keuze zijn geweest, omdat deze een uitdagend spectrum heeft (zie bijlage 2). Deze stof is echter niet op het lab aanwezig en omdat het onder de
Opiumwet valt, is de bestelprocedure ingewikkeld waardoor deze een lange levertijd heeft. Daarom is er morfine gebruikt voor de optimalisering van de detector. Morfine is aanwezig op het lab. Daarbij heeft morfine een korte retentietijd (ca. 4,3 minuten) wat het mogelijk maakt om de detectie binnen één dag af te stemmen.
Er is een academische oplossing van morfine (1,12 mg/L) geïnjecteerd onder dezelfde condities met uitzondering van het DAD interval. De resultaten zijn in tabel 4 weergeven.
Tabel 4. De UV-spectra match en concentratie-indicatie van morfine per UV interval
DAD interval (nm) Match UV-spectra en Rt Concentratie-indicatie (mg/L) Retentietijd (min.) 190 - 360 0,9394 1,43 4,31 191 - 361 0,9603 1,43 4,31 192 - 392 0,9789 1,41 4,30 193 - 363 0,9914 1,38 4,31 194 - 364 0,9110 1,38 4,30 195 - 365 0,9980 1,34 4,31 196 - 366 0,9979 1,32 4,34 197 - 367 0,9904 1,30 4,30 198 - 368 0,9757 1,22 4,31 199 - 369 0,9757 1,26 4,30 200 - 370 0,9548 1,21 4,31
Op basis van bovenstaande resultaten is geconcludeerd dat het optimale detectie interval voor deze detector tussen 196 en 366 nm ligt. Verder is de herhaalbaarheid bij dit interval getest volgens de STIP DOA methode. Deze resultaten zijn in tabel 5 weergegeven.
Lucia Baljeu-Neuman 25 Tabel 5. De herhaalbaarheid van de UV-spectra match en de concentratie-indicatie
Match (UV-spectra en Rt) Concentratie-indicatie (mg/L) Rt (min.) 1 0,9978 1,32 4,31 2 0,9980 1,32 4,31 3 0,9979 1,32 4,31 4 0,9979 1,32 4,31 5 0,9980 1,33 4,31 6 0,9978 1,32 4,31 7 0,9978 1,33 4,31 8 0,9979 1,31 4,32 9 0,9979 1,34 4,32 10 0,9980 1,33 4,32 gemiddelde 0,9979 1,32 4,31 STDEV 0,0000 0,01 0,01 RSD 0,0082 0,64 0,11
Op basis van de bovenstaande resultaten is besloten dat de spectra voor de STIP DOA methode tussen 196 en 366 nm opgenomen moet worden.
4.2 Nawerken van de STIP DOA methode
Het goed functioneren van de methode is gecontroleerd met behulp van de
controlestandaard die ZANOB produceert. Dit is een mengsel van morfine, efedrine, codeïne, amfetamine, MDA, MDMA, benzoylecgonine, MDEA en atropine met een concentratie van 1 mg/L per component in demiwater. De structuur en de UV-spectra van deze componenten zijn in bijlage 2 weergegeven.
De verkregen chromatogrammen zijn in figuur 7 te zien.
In het eerste chromatogram van EMC is te zien dat voor de atropinepiek (Rt = 38,74 min.) een andere piek, bijna zo groot als de atropinepiek, aanwezig is (Rt = 36,26 min.).
Daarentegen is bij ZANOB de atropinepiek om 36,85 min. geelueerd en om 39,79 min. elueert een andere component.
In het tweede chromatogram (ook van EMC) is er geen storende piek vlak bij of na de atropinepiek. De twee analysen zijn op verschillende tijden uitgevoerd. Er is geen verklaring voor de af- of aanwezigheid van de storende piek.
De controlestandaard is 22 keer getest gedurende zeven maanden. De gemiddelden van de concentraties, de matches van de UV-spectra en de retentietijden zijn in tabel 6 gepresenteerd.
De gemiddelde concentraties van de componenten zijn binnen het 0,80 en 1,20 mg/L interval met uitzondering van benzoylecgonine (0,79 mg/L) en atropine (1,40 mg/L). De gemiddelde UV-spectra matches zijn > 0,99 met uitzondering van de componenten die na 20 minuten elueren, namelijk MDMA, benzoylecgonine, MDEA en atropine.
Met uitzondering van de benzoylecgonine, zijn de retentietijden op het laboratorium van het EMC langer dan die bij het ZANOB. Vergeleken met de retentietijden zoals vermeld in de bibliotheek zijn deze ook langer met één uitzondering: het MDMA is bijna hetzelfde (zie bijlage 3).
Lucia Baljeu-Neuman 26 A
B
C
Figuur 7. De chromatogrammen van de controlestandaard STIP DOA
(A en B zijn EMC-chromatogrammen en C is ZANOB-chromatogram [7])
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min 0 10 20 mAU 200nm,4nm (1.00) M o rf in e E fe d ri n e C o d e in e A m fe ta m in e M D A M D M A B e n z o y le c g o n in e M D E A A tr o p in e 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min 0 25 50 mAU 200nm4nm (1.00) M o rf in e /4 .2 0 8 E fe d ri n e /9 .1 6 8 C o d e in e /1 1 .1 4 2 A m fe ta m in e /1 3 .2 1 4 M D A /1 6 .6 9 5 M D M A /2 0 .3 6 3 B e n z o y le c g o n in e /2 6 .6 3 7 M D E A /3 0 .4 9 4 /3 6 .2 5 6 A tr o p in e /3 8 .7 3 9
Lucia Baljeu-Neuman 27 Tabel 6. Controlestandaard ZANOB (22 keer gemeten in 7 maanden)
Component Gem. conc. (mg/L) ST DEV. conc . Gem. UV-spectra match STDEV. UV-spectra match Gem. Rt (min.) STDEV. Rt morfine 1,11 0,19 0,9979 0,00 4,30 0,18 efedrine 0,90 0,13 0,9910 0,00 9,50 0,51 codeïne 0,94 0,10 0,9972 0,00 11,70 0,86 amfetamine 0,96 0,10 0,9928 0,01 13,80 0,79 MDA 0,88 0,10 0,9924 0,00 17,50 1,17 MDMA 0,83 0,13 0,9866 0,01 21,86 1,50 benzoylecgonine 0,79 0,17 0,9359 0,09 27,30 2,53 MDEA 0,80 0,21 0,9398 0,10 32,10 2,31 atropine 1,40 0,60 0,9796 0,12 40,43 2,50 4.3 Cross-validatie (schaduwdraaien)
De urinemonsters van de patiënten zijn geanalyseerd met behulp van de autoanalyser AxSYM. De monsters die positief getest zijn op opiaten, amfetamine en benzoylecgonine, zijn nadien met behulp van de STIP DOA methode geanalyseerd.
De monsters voor het Kwaliteitsbewaking Klinische Geneesmiddelanalyse en Toxicologie (KKGT) ringonderzoek zijn ook dubbel gedraaid.
Verder is er urine gespiked met codeïne, morfine en met een codeïne-morfine mengsel en geanalyseerd met behulp van de AxSYM en STIP DOA.
Tenslotte is het urinemonster van een vrijwilliger die codeïne gebruikte volgens de twee methoden geanalyseerd.
De resultaten van al deze experimenten zijn hierna gepresenteerd.
4.3.1 Patiëntenmonsters
Een zeven-tal patiëntenmonsters die met de AxSYM methode positief gevonden zijn, zijn bewaard in de vriezer ( - 18 °C) en later met de ST IP DOA methode geanalyseerd. De gevonden concentraties zijn in tabel 7 weergegeven.
Het AxSYM resultaat is met ” > “ doorgegeven als de gevonden drugsconcentratie in het monster groter is dan de hoogste calibratie standaard (zie tabel 2). Het is niet nodig om het monster opnieuw verdund te meten voor een exacte concentratie. Aangezien de uitslag boven de afkapwaarden is, wordt het sowieso positief gerapporteerd.
Op één uitzondering na zijn alle monsters volgens beide methodes positief gevonden voor de geteste drugs. Hier is de concentratie van benzoylecgonine met de STIP DOA
methode lager dan de cut-off waarde (0,3 mg/L), dus negatief. De benzoylecgonine concentratie van het monster 4 getest met STIP DOA is 65% lager dan degene die met de AxSYM gevonden is. Het is mogelijk dat deze twee monsters of een lage recovery
(slechte SPE-kolom) hadden of dat ze niet meteen ingevroren waren, want voor de monsters 2 en 3 komen de benzoylecgonine concentraties volgens beide methodes overeen.
Lucia Baljeu-Neuman 28 Voor de monsters die met de AxSYM methode positief op opiaten zijn getest, is codeïne (opiumalkaloïd met analgetische en hoestprikkeldempende werking) en hydromorfon (opiumalkaloïd met sterk analgetische werking gebruikt bij het behandelen van ernstige pijn bij kankerpatiënten) met STIP DOA geïdentificeerd. De gevonden concentraties zijn in beide gevallen boven de afkapwaarde. Tussen de concentraties is er 20% afwijking. Het amfetamineachtige van monster 5 is geïdentificeerd met STIP DOA als MDMA (3,4-methyleendioxymethamfetamine; Ecstasy) en de afwijking tussen de concentraties is 84%.
Tabel 7. Cross-validatie patiëntenmonsters
AxSYM STIP DOA
Monster
Concentratie (mg/L) Uitslag Concentratie (mg/L) Uitslag
1 opiaten >1 positief hydromorfon 0,80 positief 2 opiaten >1 positief codeïne 0,74 positief benzoylecgonine >5 positief benzoylecgonine 7,81 positief 3 benzoylecgonine >5 positief benzoylecgonine 9,16 positief 4 benzoylecgonine 2,12 positief benzoylecgonine 1,38 positief 5 opiaten >1 positief hydromorfon 0,80 positief amfetamine 6,77 positief MDMA 1,12 positief 6 benzoylecgonine >5 positief benzoylecgonine 3,34 positief
cannabis >0,1 positief niet aantoonbaar niet aantoonbaar 7 benzoylecgonine 1,48 positief benzoylecgonine 0,17 negatief Bovendien kan de STIP DOA methode gebruikt worden voor intoxicaties van stoffen die niet aantoonbaar zijn met de autoanalyser. Bijvoorbeeld fenyl-propanol of efedrine. Bij een patiënt die met intoxicatie bij Spoed Eisende Hulp opgenomen was, was het vermoeden van een vergiftiging met Khat bladeren. Deze bevatten het alkaloïd cathinone (cathion benoemd in de STIP Beta bibliotheek, zie bijlage 3) een amfetamineachtige stof . De drugs screening op opiaten, amfetamine, benzoylecgonine, methadon, cannabinoïden, benzodiazepinen en barbituraten met behulp van de AxSYM is negatief gevonden. Met de STIP DOA methode werd er echter fenyl-propanol amine met een concentratie-indicatie van 12,59 mg/L aangetoond. Fenyl-propanol amine is een metaboliet van efedrine en amfetamine.
Dit resultaat verklaarde de symptomen van de patiënt. De efedrine casus is in de volgende paragraaf uitgelegd.
4.3.2 Ringonderzoekmonsters
Het laboratorium van de apotheek neemt deel aan ringonderzoeken. Een daarvan is het “Kwaliteitsbewaking Klinische Geneesmiddelanalyse en Toxicologie” (KKGT)
ringonderzoek.
De KKGT stichting bevordert de kwaliteit van de klinische geneesmiddelanalyse, de klinische toxicologie en de analyse van andere lichaamsvreemde stoffen in
gezondheidszorglaboratoria.
De KKGT- ringonderzoekmonsters van 2011 zijn simultaan met beide methodes geanalyseerd.
De oude ringonderzoekmonsters die in de vriezer bewaard waren, werden tevens met STIP DOA geanalyseerd. De resultaten staan in tabel 8.
Lucia Baljeu-Neuman 29 Tabel 8. Cross-validatie ringonderzoek
Drugs concentratie (mg/L) Afwijk. conc. (%) KKGT
test AxSYM STIP DOA Theor. waarde AxSYM STIP DOA
2011 Opiaten 0,421 Hydromorfon 0,660 Hydromorfon 1,065 -60 -38 B1 Amfetamine 0,728 MDMA 0,570 MDMA 0,975 -25 -42 2010
C2 Opiaten > 1,000 Codeïne 1,590 Codeïne 2,035 - -22 2010
D1 Opiaten 0,383 Codeïne 0,230 Codeïne 0,290 32 -21 2010
D2 Opiaten 0,020 Efedrine 0,850 Efedrine 1,072 n.v.t. -21 Bij opiaten is de afwijking volgens de STIP DOA methode kleiner dan die volgens de AxSYM methode. Bij amfetamine is het juist andersom.
In de eerste drie monsters die met de AxSYM methode positief op opiaten getest zijn, is het opiaat hydromorfon (voor de eerste twee) en codeïne (voor de derde) met STIP DOA geïdentificeerd. De gevonden concentraties zijn in beide gevallen boven de afkapwaarde.
Het laatste monster bevat efedrine. Efedrine is een werkzame alkaloïde van de plant Ephedra en wordt gebruikt in sommige hoestdranken.
Onderzoek wees uit dat efedrine niet te bepalen is met de AxSYM methode voor opiaten. De gevonden concentratie 0,020 mg/L is namelijk onder de detectielimiet van 0,025 mg/L. Met de STIP DOA methode was de efedrine echter wel te identificeren en gaf de gemeten concentratie een afwijking van 21 % ten opzichte van de theoretische waarde aan.
4.3.3 Kruisreactiviteit
Om de hypothese te controleren op de codeïne- morfine kruisreactiviteit van de AxSYM methode zijn de volgende monsters geanalyseerd:
• urine gespiked met morfine (monster A),
• urine gespiked met codeïne (monster B),
• urine gespiked met codeïne en morfine (monster C) en
• een urinemonster van een vrijwilliger die codeïne gebruikte (monster D). De theoretische concentraties en de uitslagen van de twee methoden zijn in tabel 9 gegeven.
Tabel 9. Kruisreactiviteit codeïne-morfine
Theoretische
conc. (mg/L) STIP DOA AxSYM
Afwijking STIP DOA (%) Monster
codeïne morfine codeïne morfine opiaten codeïne morfine
Afwijking AxSYM (%) A - 0,56 - 0,61 0,53 - 9 -5 B 0,68 - 0,49 - 0,92 -28 - 35 C 0,45 0,30 0,44 0,43 0,97 -2 43 291) D n.v.t. - 0,632) - >1,00 n.v.t. n.v.t. n.v.t. 1)
ten opzichte van de som van de theoretische concentraties van codeïne en morfine 2)
Lucia Baljeu-Neuman 30 Met de STIP DOA methode is codeïne en morfine geïdentificeerd.
De grote afwijking van het monster B kan een consequentie van de voorbewerking van de monsters zijn of een minder kwalitatieve SPE kolom.
Monster D is twee keer gemeten. De ene keer is een concentratie van 0,50 mg/L gevonden de andere keer een concentratie van 0,75 mg/l. Hier kan de variatie ook een consequentie van de monstervoorbewerking zijn.
De grote afwijking bij monster C is een effect van de invloed van de urinematrix. Deze heeft een grote invloed bij morfine, met name voor lagere concentraties. In hoofdstuk 4.4 is dit verder toegelicht.
De AxSYM methode is zeer nauwkeurig voor morfine. Voor codeïne heeft deze methode kruisreactiviteit met morfine, waardoor codeïne monsters positief getest worden op opiaten.
4.4 Methode validatie
Methode validatie heeft als doel aan te tonen dat een methode geschikt is voor de
beoogde toepassing en dat er betrouwbare meetresultaten geproduceerd kunnen worden. De te valideren onderdelen voor de STIP DOA methode zijn: selectiviteit, lineariteit,
juistheid, herhaalbaarheid en recovery.
4.4.1 Selectiviteit
Het UV-spectrum op de retentietijd van de geanalyseerde stof hoort alleen van die stof afkomstig te zijn. De matrix dient het signaal niet te storen.
In de bibliotheek van de STIP Beta software zijn de specifieke urinepieken vermeld samen met hun retentietijden (zie bijlage 3). Om het matrixeffect te verifiëren zijn er vijf blanco urinemonsters van vrijwilligers geanalyseerd met behulp van de STIP DOA methode. De retentietijden (Rt) en de piekhoogten van de gevonden urinepieken zijn in tabel 10 weergegeven. De bijhorende chromatogrammen zijn in bijlage 4 terug te vinden.
Lucia Baljeu-Neuman 31 Tabel 10. Blanco urinemonsters
Urinepiek 1 Urinepiek 2 Urinepiek 3 Urinepiek 4 Urinepiek 5 Urinepiek 6 Rt Piek hoogte Rt Piek hoogte Rt Piek hoogte Rt Piek hoogte Rt Piek hoogte Rt Piek hoogte (min) (mAU) (min) (mAU) (min) (mAU) (min) (mAU) (min) (mAU) (min) (mAU)
4,08 19545 4,59 9987 6,14 9163 7,75 4436 9,23 22743 37,79 6829 3,41 19114 3,74 5825 6,72 48067 - - 9,21 25810 - - 3,73 47938 4,31 87931 6,67 48747 7,65 7566 9,21 21062 36,79 5752 4,00 40392 4,51 11637 6,64 61293 - - 9,20 21317 - - 3,99 38226 4,48 17362 6,62 298596 7,57 11743 9,18 41940 - -
Uit de resultaten van dit experiment is te zien dat het aantal pieken, de retentietijden en de piekhoogten in de monsters variëren. De urine matrix heeft een grote invloed op de componenten die rond 4 (zoals morfine), 6 en 9 minuten elueren. Voor de andere componenten is de methode voldoende specifiek.
De resultaten van de experimenten van hoofdstuk 4.2 en 4.3 bevestigen dat de drugs individueel geïdentificeerd kunnen worden op basis van hun retentietijd en het UV-spectrum. Daarom is de STIP DOA methode specifiek.
4.4.2 Lineariteit
De lineariteit van een methode is bepaald aan de hand van de kalibratielijn. De lineariteit van de STIP DOA methode is getest op morfine en benzoylecgonine.
Voor morfine is urine gespiked met morfine bij vier verschillende concentraties.
Voor benzoylecgonine is de lineariteit getest op de AxSYM controlestandaarden van de firma Abbott, omdat deze stof onder de Opiumwet valt en de bestelprocedure ingewikkeld en langdurig is. De controlestandaarden bestaan uit urine gespiked met een bekende concentratie benzoylecgonine.
De resultaten voor morfine zijn terug te vinden in tabel 11 en figuur 8.
Lucia Baljeu-Neuman 32
• morfine
De theoretische concentraties in gespiked urine samen met de gemeten concentraties zijn in tabel 11 weergeven. De kalibratielijn is in figuur 8 geïllustreerd.
Tabel 11. Lineariteit morfine
Theoretische concentratie (mg/l) Gemeten concentratie (mg/L) Afwijking (%) 1 0,22 0,26 17 2 0,28 0,33 18 3 0,37 0,42 13 4 0,56 0,65 17
Figuur 8. Kalibratielijn morfine
De lineariteit is getest met behulp van de Goodness of Fit - test (GOF), waarbij gebruikt wordt gemaakt van de statistische F-toets via de optie regressie van Excel [8].
De resultaten zijn in bijlage 4 weergegeven.
Indien de berekende waarde van FGOF groter is dan de tabelwaarde FTABEL dan is de
FGOF-waarde significant. De parameters uit het model verklaren de variatie in metingen
dus goed. Voor morfine is FGOF 1485,44 en FTABEL 0,000673 (zie bijlage 5), dus
FGOF >> FTABEL.
FGOF is significant dus de parameters van het model verklaren de variatie in de
Lucia Baljeu-Neuman 33
• benzoylecgonine
De theoretische concentraties van de benzoylecgonine controlestandaarden en de gemeten concentraties na de solid-phase extractie van de monsters zijn in tabel 12 weergeven. De kalibratielijn is in figuur 9 geïllustreerd.
Door het vaststellen van de GOF (Goodness of Fit) – test (zie bijlage 6) zijn de volgende F-waarden bevonden: FGOF 469,73281 en FTABEL 0,00021. Omdat FGOF >> FTABEL is, is FGOF
significant. Bijgevolg verklaren de parameters van het model de variatie in de meetresultaten goed.
Tabel 12. Lineariteit benzoylecgonine controlestandaarden Abbott
Controle- standaard Theoretische concentratie (mg/l) Gemeten concentratie (mg/L) Afwijking (%) B 0,30 0,22 -27 C 1,00 0,65 -35 D 2,00 1,50 -25 E 3,00 2,23 -26 F 5,00 4,23 -15
Figuur 9. Kalibratielijn benzoylecgonine (Abbott standaarden)
Gebaseerd op de voorafgaande resultaten kan geconcludeerd worden dat de STIP DOA methode voor morfine en benzoylecgonine lineair is.
Lucia Baljeu-Neuman 34
4.4.3 Juistheid
De juistheid van een methode geeft aan of het resultaat voor een te bepalen component binnen vooraf gestelde grenzen overeenkomt met de werkelijke waarde.
De juistheid van de STIP DOA methode is getest met behulp van de controlestandaarden van de firma Abbott. Deze bestaan uit urine gespiked met methadon, secobarbital, nordiazepam, d-amfetamine, benzoylecgonine en morfine in lage (L), medium (M) en hoge (H) concentratie. De spreiding van de concentraties is van de bijsluiter van de controlestandaarden overgenomen. De methode is juist als de gemeten concentraties binnen het spreidingsinterval liggen.
De theoretische concentraties van de doelcomponenten van dit onderzoek, de gemeten concentraties met behulp van STIP DOA na voorbewerking van de monsters en de spreiding van de concentraties zijn in tabel 13 weergegeven.
Tabel 13. Juistheid m.b.v. de Abbott controlestandaarden
Controle- standaard Doelcomponent Theor. conc. (mg/L) Gemet. conc. (mg/L) Afwijking (%) Spreiding d-amfetamine 0,50 0,20 -60 0,305 - 0,695 benzoylecgonine 0,50 0,40 -20 0,343 - 0,657 L-controle morfine 0,25 0,35 40 0,197 - 0,303 d-amfetamine 1,50 0,41 -73 0,984 - 2,016 benzoylecgonine 1,50 1,09 -27 1,098 - 1,902 M-controle morfine 0,50 0,52 4 0,380 - 0,620 d-amphetamine 4,00 1,32 -67 2,860 - 5,140 benzoylecgonine 3,00 2,26 -25 2,185 - 3,814 H-controle morfine 0,80 0,92 15 0,630 - 1,000
De lage en de hoge controles van benzoylecgonine liggen binnen het spreidingsinterval, waardoor de methode voor deze concentraties juist is. De mediumcontrole wijkt -0,73% af van de onderste waarde van het interval, wat de methode onjuist maakt.
De lage controle morfine is onjuist. De medium en hoge controle zijn wel juist. Dus bij morfine is de methode juist voor concentraties hoger dan 0,25 mg/L.
De amfetaminecontroles zijn veel te laag en vallen allemaal buiten het spreidingsinterval. In de chromatogrammen van de standaardcontroles (figuur 10) is te zien dat de respons van de amfetamine heel laag is. De methode is dus niet juist voor amfetamine.
Lucia Baljeu-Neuman 35 L 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min 0.0 2.5 5.0 7.5 mAU 200nm,4nm (1.00) M o rf in e A m fe ta m in e B e n z o y le c g o n in e M 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min 0 5 10 15 20mAU200nm4nm (1.00) M o rf in e A m fe ta m in e Be n z o y le c g o n in e H 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min 0 5 10 15 20 25 30 35mAU200nm,4nm (1.00) M o rf in e A m fe ta m in e B e n z o y le c g o n in e
Lucia Baljeu-Neuman 36
4.4.4 Herhaalbaarheid
Herhaalbaarheid is de precisie verkregen met dezelfde methode, op identiek materiaal, door dezelfde analist, met dezelfde meetapparatuur, op zo dicht mogelijk bij elkaar gelegen tijdstippen.
De herhaalbaarheid van de STIP DOA methode is getest op basis van gespiked urine met morfine. De urine is gespiked met 0,11 mg/L (L), 0,45 mg/L (M) en 1,12 mg/L (H) morfine.
In verband met de invloed van de matrix, is de morfinepiek bij 0,11 mg/L niet te kwantificeren. De software STIP Beta herkent de piek als een urinepiek.
De gemeten concentraties van de herhaalbaarheid test zijn in tabel 14 weergegeven. Gebaseerd op deze resultaten kan geconcludeerd worden dat de STIP DOA methode voor amfetamine en morfine herhaalbaar is.
Tabel 14. Herhaalbaarheid getest op morfine
Gemeten concentraties morfine (mg/L)
M (theoretische concentratie 0,45 mg/L) H (theoretische concentratie 1,12 mg/L) 1 0,45 1,12 2 0,48 1,14 3 0,46 1,06 4 0,47 1,07 5 0,45 1,13 6 0,49 1,07 gem. 0,47 1,10 STDEV 0,02 0,04 RSD (%) 3,50 3,23 4.4.5 Recovery
De recovery (terugvinding) is berekend door de gemeten concentratie-indicatie van een component in urine na voorbewerking te vergelijken met de gemeten concentratie-indicatie van dezelfde component (in academische oplossing) na directe injectie.
De recovery van de STIP DOA methode is alleen getest bij morfine in verband met een tekort aan tijd. De resultaten zijn in tabel 15 weergegeven.
De monsters met een lage concentratie (0,11 mg/L) zijn niet te kwantificeren. De software STIP Beta herkent de piek als een urinepiek.
De gemiddelde recovery van de middelste concentratie morfine (0,56 mg/L) is 87,2%.
De gemiddelde recovery van de monsters met de hoogste concentratie (1,12 mg/L) is 87,7%.
Gebaseerd op deze resultaten kan geconcludeerd worden dat de recovery van de morfine gemiddeld 87,5% is.
Lucia Baljeu-Neuman 37 Tabel 15. Recovery morfine
Monster Theoretische concentratie (mg/L) Gemeten concentratie (mg/L) Recovery (%) M1 0,56 0,60 107,1 M2 0,56 0,45 80,4 M3 0,56 0,47 83,9 M4 0,56 0,47 83,9 M5 0,56 0,48 85,7 M6 0,56 0,46 82,1 gemiddelde M 0,56 0,49 87,2 H1 1,12 1,08 89,6 H2 1,12 1,13 91,2 H3 1,12 1,05 84,8 H4 1,12 1,06 84,0 H5 1,12 1,14 90,4 H6 1,12 1,12 86,4 gemiddelde H 1,12 1,10 87,7 L acad 0,11 0,13 n.v.t. M acad 0,56 0,56 n.v.t. H acad 1,12 1,25 n.v.t.
Om de recovery zonder het matrixeffect te bepalen, is er één academische oplossing (1,12 mg/L) voorbewerkt als een urinemonster (m.b.v. SPE) en één andere direct
geïnjecteerd. De gemeten piekhoogten zijn 26947mAU en 37888 mAU. De recovery daarvan is 71%. Aangezien dit experiment slechts eenmaal is uitgevoerd, is het niet mogelijk om te generaliseren.
