RAPPORT 89. 22 Haart 1988
Voedingszuren in eieren: Ontwikkeling van een gaschromatografische methode
M.L. Essers
Afdeling Vetchemie
Goedgekeurd door: drs B.G. Muuse
Rijks-K\valiteitsinstituut voor land- en tuinbomo~produkten (RIKILT) Bornsesteeg 45, 6708 PD Wageningen
Postbus 230, 6700 AE Wageningen Telefoon 08370-19110
Telex 75180 RIKIL Telefax 08370-17717
Copyright 1989, Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouw-produkten.
Overname van de inhoud is toegestaan, mits met duidelijke bron-vermelding. VERZENDLIJST INTERN: Directeur Sectorhoofden Drs J.M.P. den Hartag Afdeling AC
Programmabeheer en Informatieverzorging Bibliotheek EXTERN: DLO (2x) VKA Spelderholt Drs B.G. Muuse (IBVL) L.M.H. Frijns (CLRVV)
INHOUD blz.
SAHENVATTING 3
1 INLEIDING 5
2 HOOFDLIJNEN VAN HET ONDERZOEK 5
3 BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKDELEN VAN DE METHODE 6
3.1 Hanstervoorbewerking (klaring) 6
3.2 Extractie van de zuren 7
3.3 Methylering en ge analyse 7
4 RESULTATEN EN DISCUSSIE 7
4.1 Extractie van de zuren 7
4.2 Hethylering en ge analyse 8
4. 3 Nauwkeurigheid en bet romo~baarheid van de met ho de 9
5 CONCLUSIES 10
LITERATUUR 11
BIJLAGEN
A Schematische weergave van de methode B Chromatagram van standaarden
C Chromatagram van monster zonder toevoegingen D Ontwerp analysevoorschrift
-2-SAHENVATTING
Onderzoek is gedaan om een minder bewerkelijke en snellere methode te verkrijgen voor de bepaling van enkele organische zuren in eiproduk-ten. De organische zuren melkzuur en barnsteenzuur zijn parameters voor de hygiënische k\o~aliteit van de gebruikte heelei grondstof. 3-Hydroxyboterzuur is een parameter om broedeieren aan te tonen. De huidige methode bevat een bewerkelijke clean up en ook een arbeidsin-tensieve stap om de organische zuren, met behulp van extrelut, vanuit de waterfase in de organische fase te brengen.
Bovendien zijn de resultaten van de kwantitatieve bepaling van melk-zuur en barnsteenzuur met de huidige methode niet zo betrouwbaar. Door toepassing van een andere clean up en het gebruik van natriumsul-faat in plaats van extrelut is het mogelijk gebleken om de bepaling aanmerkelijk sneller en beter uit te voeren. In dit onderzoek is de methode stap voor stap gecontroleerd. De methode is bruikbaar gebleken voor toepassing als routinemethode voor het screenen van eieren en ei-produkten op gehalten aan melkzuur, 3-hydroxyboterzuur en barnsteen-zuur. De bet romo~baarheid van de methode moet nader \olürden vastgesteld aan de hand van praktijkmonsters en vergelijking met de enzymatische methode.
4-1 INLEIDING
Bij de bereiding van eiprodukten is de k1~aliteit van de grondstoffen van groot belang voor de uiteindelijke k1~aliteit. De microbiologische toestand van de oorspronkelijk gebruikte eieren is ook na pasteurisa-tie in het eindprodukt nog na te gaan door de bepaling van het melk-zuur (Mz) en barnsteenzuur (Bz) gehalte (Mulder et al., 1987, Littmann et al., 1982a en 1982b). Om het gebruik van eieren die bevrucht en
be-broed zijn te controleren is inmiddels een wettelijke regeling en con-trole ingesteld door de EEG waarbij gebruik 1~ordt gemaakt van het 3-hydroxyboterzuur (3-HBA) gehalte (Steverink et al., 1984,
Uijtenboogaart et al., 1986). In de literatuur zijn gaschromatografi-sche analysemogelijkheden voor deze drie zuren beschreven door met name Littman (1985). De methode is echter zeer tijdrovend en is voor 3-HBA veel sneller uit te voeren door toepassing van een extrelut ko-lom in de extractie procedure. Deze methode is beschreven in intern RIKILT voorschrift A425 en gepubliceerd door Elenbaas et al. (1986). Deze methode is echter minder geschikt gebleken voor Bz en nog minder voor Mz. Voor Mz is een recovery gevonden van circa 60% hetgeen te wijten is aan onvolledig elueren van het Mz van de extrelut kolom. Bovendien is de methode met extrelut nog steeds tijdrovend. Doel van het onderhavige onderzoek is de ontwikkeling van een routinematige GC methode voor de analyse van de drie genoemde zuren. Hiertoe is voor de cleanup en extractie van de zuren uit de waterfase een snellere en be-tere methode ontwikkeld. Het gaschromatografische deel van de bepaling is gelijk gebleven aan het reeds bestaande analysevoorschrift voor de gaschromatografische bepaling van 3-HBA (intern RIKILT voorschrift A 425).
2 HOOFDLIJNEN VAN HET ONDERZOEK
Voor het onderzoek zijn 30 scharreleieren gebruikt. Ze zijn ontdaan van schil en gehomogeniseerd met behulp van een Waring blender. Van het homogenaat zijn porties van circa 100 gram bij -20°C bewaard en vlak voor gebruik ontdooid. Daar de enzymatische methode, in een door
-6-Duitse onderzoekers georganiseerde ringtest, geschikt is gebleken voor de bepaling van Mz, 3-HBA en Bz is voor wat betreft de extractie van de zuren uit het ei en het klaren van de oplossing de procedure van deze methode gebruikt. Uit de ringtest is ook gebleken dat de extrelut procedure niet geschikt is voor alle drie de zuren. Nagegaan is of het water niet eenvoudigweg met behulp van watervrij natriumsulfaat ver-wijderd kon worden. Tenslotte is de methylering van de zuren ten op-zichte van het interne RIKILT voorschrift (A425) voor de bepaling van 3-HBA enigszins maar niet fundamenteel ge\~ijzigd. In het onderzoek zijn de diverse stappen in de bepaling per fase gecontroleerd op be -trou\~baarheid en tenslotte is de totale methode getoetst door aan de monsters standaarden toe te voegen van Mz, 3-HBA en Bz in oplopende concentraties tot circa 1,25 maal het toegestane gehalte in eieren. Op drie verschillende dagen zijn deze monsters ei zonder en met vijf ver-schillende niveaus van toevoegingen geanalyseerd.
3 BESCHRIJVING VAN DE ONDERZOEKDELEN VAN DE METHODE
Een schema van de diverse stappen in de bepaling is weergegeven in bijlage A. Het onderzoek op de betrouwbaarheid van deze stappen wordt hier achtereenvolgend beschreven.
3.1 Monstervoorbewerking (klaring)
Als basis hiervoor diende de enzymatische methode uit de Duitse rin g-test. De monsterhoeveelheden zijn aangepast om een geschikte concen-tratie van de zuren voor een gaschromatografische analyse te verkrij-gen. Verder is de pH vlak voor filtratie, anders dan in het enzymati-sche voorschrift, verlaagd tot 3,5 om alle zuren in de zuurvorm te houden. De monstervoorbewerking is als volgt uitgevoerd: Aan 10 gram ei is 22 ml water en 300 ~1 van een glutaarzuuroplossing toegevoegd
(interne standaard, 100 mg/100ml). Door de oplossing gedurende 20 min bij 100°C te plaatsen worden de eiwitten gedenatureerd. De klaring van de oplossing is verder uitgevoerd met behulp van Carrez I en II. Ten-slotte is aangezuurd met 200 ~1 8N HCL tot een pH van circa 3,5. Door filtratie is tenslotte een heldere waterige oplossing van de zuren verkregen.
3.2 Extractie van de zuren
De extractie van de zuren uit de waterige oplossing met behulp van ex-trelut is zoals eerder vermeld niet geschikt voor Mz en Bz. Nagegaan is of de zuren met behulp van watervrij natriumsulfaat uit de waterfa-se in de ethylacetaat kon worden overgevoerd. Ter vermijding van in-sluitsels is 2 ml filtraat en 40 ml ethylacetaat met behulp van een magnetische roerder geroerd onder voorzichtig toevoegen van 3,5 gr
wa-tervrij natriumsulfaat. Na nog eens krachtig schudden is de ethylace-taat gefiltreerd en nogmaals met 40 rul ethylacetaat geschud en de ethylacetaat gefiltreerd. De 80 ml ethylacetaat is daarna tot droog ingedampt. Met behulp van een eimonster met toegevoegde standaarden is nagegaan of deze extractie volledig was voor de drie zuren.
3.3 Methylering en ge analyse
De methylering is afgezien van een kleine wijziging uitgevoerd volgens de methode genoemd in intern voorschrift A 425. De '~ijziging bestond uit het gebruik van een reacti-therm met vials in plaats van reageer-buizen en extra toevoeging van NaHC03 (watervrij) tot volledige neu-tralisatie. Verder is voor filtreren de oplossing op 4°C gebracht om zo veel mogelijk zouten in de oplossing te laten uitkristalliseren om dichtslibben van de ge kolom tegen te gaan. De ge analyse is conform het interne voorschrift A 425 uitgevoerd. Een chromatagram van stan-daarden en een chromatagram van een monster zonder toevoegingen zijn weergegeven in respectievelijk bijlage B en C.
4 RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1 Extractie van de zuren
Dit is een toetsing van de totale analyseprocedure zonder invloeden van de klaring. Voor het overbrengen van de zuren van water naar
ethylacetaat is gebruik gemaakt van 2 maal 40 ml ethylacetaat. Om deze stap te controleren is van een monster met toevoegingen het waterige filtraat, verkregen na de klaring, in vijfvoud geanalyseerd. De gemid-delden en standaardafwijkingen (s) staan vermeld in tabel 1. Om de ef-fectiviteit van de extractie van de zuren na te gaan zijn ook andere
-
8-hoeveelheden ethylacetaat gebruikt. Aan een monster ei met 68 ppm Mz is 515 ppm Mz toegevoegd en het waterige filtraat met verschillende
hoeveelheden ethylacetaat geextraheerd. Er is voor Mz gekozen omdat
bekend is dat dit zuur ten opzichte van de andere zuren het slechts
oplosbaar is in ethylacetaat. Uit de resultaten bleek dat met
aflopen-de hoeveelheaflopen-den ethylacetaat de recovery van Mz navenant daalde. Het
gebruik van 2 maal 40 ml ethylacetaat is dus noodzakelijk.
Tabel 1. Resultaten van de onderdelen van de methode
gemiddeld
in mg/kg
ad 4.1 extractie van de zuren Mz n=5 202
3-HBA n=5 2,17 Bz n=5 14,05 ad 4.2 methylering Mz n=5 105 3-HBA n=5 1,42 Bz n=5 8,43 ad 4.2 ge analyse gemiddeld verschil (X) Mz n=8 10,4 3-HBA n=9 0,25 Bz n=9 0,97 4.2 Methylering en ge analyse s 5,51 0,09 1,45 8, 23 0.12 0,41 s (0,89 9,3 0,22 0,86 x X)
Dit is een toetsing van de totale analyse echter zonder de invloeden
van klaring en extractie met ethylacetaat. Vijf maal 2ml van een wat
e-rig filtraat van een monster met toevoegingen is volgens schema behan-deld met ethylacetaat. De ethylacetaat frakties zijn bij elkaar
werd uitgevoerd. De gemiddelden en standaardafwijkingen (s) staan ver-meld in tabel 1. Uit de resultaten van 4.1 (extractie van de zuren) en 4.2 (methylering) blijkt dat de spreidingen in de analysen in hoofd-zaak absoluut en niet van het niveau afhankelijk zijn. Bz vormt hierop een uitzondering. Bij Bz bestaat het probleem dat in het ge chromate-gram een piek voorkomt vlak na Bz die soms stoort bij de kwantifica-tie.
Ter toetsing van de ge bepaling zijn verschillende monsters na de ge analyse nogmaals in de ge geinjekteerd en geanalyseerd. De gevonden gemiddelde verschillen en standaardafwijkingen (s) staan vermeld in tabel 1. Dit gaf nagenoeg dezelfde spreiding als bij de extractie van de zuren (4.1) en methylering (4.2) zodat geconcludeerd werd dat de spreidingen in de analysen in hoofdzaak worden veroorzaakt door de ge procedure.
4.3 Nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de methode
Ter indicatieve vaststelling van de betrouwbaarheid van de methode zijn op drie verschillende dagen een monster zonder en met vijf ver-schillende toevoegingen geanalyseerd. De toevoegingen '~aren zodanig dat de gehalten van de te bepalen zuren circa 25, 50, 75, 100 en 125% van de toegestane gehalten in eieren waren. De gemiddelde gehalten van de drie monsters zonder toevoegingen '~aren: Mz 52 mg/kg, 3-HBA 0,9 mg/kg en Bz 3,0 mg/kg.
Van alle 15 monsters zijn de recovery's van elk van de toegevoegde zu-ren bepaald. Hierna is de gemiddelde recovery van elk toegevoegd zuur met standaardafwijking berekend. Recovery's die meer dan 2 maal de standaardafwijking verschilden van het gemiddelde zijn verworpen waar-na opnieuw het gemiddelde met standaardafwijking en variatiecoeffi-ei ent (cv) is berekend. De resultaten hiervan zijn als volgt:
gemiddelde recovery% s cv
Mz n=14 102,2 11 '5 11 '3
3-HBA n=14 104,3 28,2 27,0
-10-Hieruit blijkt dat Hz en Bz goed te bepalen zijn met de nieuwe metho-de. De gemiddelde recovery van 3-HBA is goed echter de spreiding is groot (cv 27%). Indien de resultaten gesplitst 1qorden in monsters met een toevoeging van kleiner en groter dan 1,5 mg/kg (gehalten van re-spectievelijk kleiner en groter dan circa 2 mg/kg) dan zijn de resul-taten als volgt:
toevoeging gemiddelde s CV
mg/kg recovery%
3-HBA n=6 (1 '5 133,0 38,9 29,2
3-HBA n=8 >1,5 88,8 13' 0 14,6
Hieruit blijkt dat bij gehalten aan 3-HBA kleiner dan circa 2 mg/kg de methode minder nauwkeurig is. Voor screenen van praktijkmonsters is de methode echter geschikt. De methode zal in de praktijk getoetst moeten worden en de resultaten vergeleken met de enzymatische methode zodat de bet rou1qbaarheid en reproduceerbaarbeid bepaald kunnen worden.
5 CONCLUSIES
Uit het onderzoek van de diverse stappen in de methode blijkt dat deze
geen noemenswaardige invloed hebben op het eindresultaat daar de standaardafwijking niet daalde naarmate later in de methode werd be-gonnen. De spreidingen in de analyse worden in hoofdzaak veroorzaakt door de ge procedure.
De nieuwe methode, loleergegeven in een ont1o1erp analysevoorschrift in bijlage D, is bruikbaar voor het screenen van monsters.
De betrouwbaarheid en interne reproduceerbaarheld van de methode zal moeten worden vastgesteld door middel van praktijkmonsters en verge-lijking met de enzymatische methode.
LITERATUUR
Elenbaas H.L., Muuse B.G., Haasnoot
w.,
Rutjes B., Stouten P., Uijttenboogaart T.G. and Steverink T.G. (1986)Determination of lncubator-Reject Eggs in Egg Products by means of the 3-Hydroxybutyric Acid Content. 1. Improved Enzymatle and Gas
Chromatographic Assays.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1986, 34, 663-666.
Littmann S., Schulte E. und Acker L. (1982a)
Beurteilung des hygienische Zustandes von Eiprodukten vor der Pasteurisierung uber das Muster der organische Sauren.
1. Gaschromatographische Methode zuur gleichzeitigen Bestimmung de organischen Sauren des Huhnereis.
z
.
Lebensm. Unters. Forsch., 1982, 175, 101-105. Littmann S., Acker L. und Schulte E. (1982b)Beurteilung des hygienische Zustandes von Eiprodukten vor der Pasteurisierung uber das Muster der organische Sauren.
2. Das Sauremuster in Eiprodukten in Abhangigkeit von der hygienischen Situation
z
.
Lebensm. Unters. Forsch., 1982, 175, 106-112. Littmann S. (1985)Zur chemisch-analytischen Untersuchung von Eiprodukten und Beurteilung ihres hygienischen Zustandes an Hand des Gehaltes an
verderbsspezifischen organischen Sauren.
Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 1985, 81 Jahrg., 11, 345-350.
Mulder R.W.A.W., Bolder N.M., Muuse B.G., Cazemier G. en den Hartog J,M.P. (1987).
Het vaststellen van de microbiologische k\~aliteit van eiprodukten aan de hand van gehalten aan barnsteenzuur en melkzuur.
-12
-Steverink A.T.G., Uijttenboogaart Th.G. en Elenbaas H.L. (1984)
Aantonen van uitgeschouwde broedeieren in eiprodukten.
Pluimveehouderij (14e jaargang), 2 november 1984, 9-11.
Uijtenboogaart T.G., Steverink T.G., E1enbaas H.L., Haasnoot W.,
Muuse B.G., and Stouten P. (1986).
Determination of Incubator-Reject Eggs in Egg Products by means of the
3-Hydroxybutyric Acid Content. 2. Levels of 3-HBA in Different Kinds
of Eggs and Egg Products and the Development of 3-HBA during
Incubation.
gehomogeniseerd heelei of eipoeder
monster zonder toevoegingen monster met toevoegingen
+
standaard zuren+
interne standaard+
interne standaard+
\o1ater+
water 20 minuten 100°C carrez I en carrez II afkoelen 200 ~1 8 N zoutzuur 15 minuten laten staan filtreren2 cc filtraat extraheren met
2 x 40 cc ethylacetaat en watervrij natriumsulfaat
ethylacetaat indampen
methylering met 1 ml HCL/methanol 2 mol/1
neutraliseren met 0,25 ml ammonia/methanol 5 mol/1 op pH brengen met NaHC03
10 minuten bij 4°C
filtreren over acrodisc 0,45 ~m
1. Melkzuur 2. 3-Hydroxyboterzuur 3. Barnsteenzuur 4. Glutaarzuur C":l ::r' "1 0 9 Ol r-t 0 OQ "1 Dl 8 < Ol ;:1 Cl) r-t Ol ;:1 0.. Dl Ol "1 0.. (I) ;:1 c::s 1-'-w. ... Dl OQ (I) c::s
BIJLAGE D
(RIKILT rapport 89.22)
ONTWERP ANALYSEVOORSCHRIFT
EIEREN:
GASCHRO~~TOGRAFISCHE BEPALING VAN MELKZUUR, 3-HYDROXYBOTERZUUR EN BARNSTEENZUUR
1. Toepassingsgebied
De methode is van toepassing voor eieren en eiprodukten.
2. Definitie
Het gehalte aan melkzuur, 3-hydroxyboterzuur en barnsteenzuur '~ordt
gaschromatografisch bepaald en uitgedrukt in mg/kg monster.
3. Beginsel
Een gehomogeniseerd monster wordt na verhitten geklaard met behulp van
carrez I en carrez II. Na aanzuren van de oplossing tot pH 3,5 en
filtreren wordt een heldere waterige oplossing verkregen. De
organi-sche zuren worden uit de waterfase overgebracht in ethylacetaat door binding van het water aan watervrij natriumsulfaat. Na indampen van de ethylacetaat worden de zuren onder verwarming met zoutzure methanol
gemethyleerd. Het zoutzuur wordt vervolgens met ammoniakale methanol
geneutraliseerd en de oplossing op pH gebracht met natriumbicarbonaat. Na afkoelen tot 4°C en filtreren is deze oplossing geschikt voor de gaschromatografische analyse met een Cp Wax 57 eb capillair kolom. De
ge zuiverheid.
4.1 Zoutzuur, 8 N
4.2 Carrez I oplossing. Los 15 gram K4[Fe(CN)6).3H20 op in water en vul aan met water tot 100 ml.
4.3 Carrez II oplossing. Los 30 gram ZnS04.7H20 op in water en vul aan met water tot 100 ml water.
4.4 Amylalcohol (antischuimmiddel).
4.5 Natriumsulfaat, watervrij.
4.6 Methanolische zoutzuuroplossing, 2 mol/L. Bereiding volgens bijlage I.
4.7 Methanolische ammoniakoplossing, 5 mol/L. Bereiding volgens bijlage II.
4.8 Natriumbicarbonaat (NaHC03)
4.9 Ethylacetaat (Uvasol Merck 863), of ethylacetaat p.a. mits een
blanco analyse daarmee geen storende stoffen vertoont.
4.10 Glutaarzuur (interne standaard), oplossing in water (lOOmg/100 ml).
\veeg circa 100 mg glutaarzuur, op O, 1 mg naUivkeurig, af in een maat -kolf van 100 ml. Los op in water en vul aan met water tot 100 ml.
Vervolg Bijlage D 4.12 3-Hydroxyboterzuur.
4.13 Barnsteenzuur.
5. Toestellen en hulpmiddelen
Naast gebruikelijke laboratoriumapparatuur en hulpmiddelen:
5.1 Gaschromatograaf met een FID detektor geschikt voor capillaire ko-lommen en splitless injectie.
5.2 Vial van 4 ml met septurn en schroefdop.
5.3 Reacti-therm heating module (Pierce) geschikt voor vials van 4 ml.
5.4 Rotavapor.
5.5 Magnetische roerder.
5.6 0,45 ~m filter, b.v. Acrodisc Cr (Gelman).
5.7 Flesje van 100 ml met schroefdop, hoog model.
5.8 Waterbad, instelbaar op 100°C
6. ~verk1djze
Een schema van de \<1erk1>1ijze is loleergegeven in bijlage lil.
6.1 Monster voorbereiding.
6. l. 1 Reelei
Weeg af in duplo 10 gram gehomogeniseerd ei, op 2 decimalen nauwkeu-rig, in een flesje van 100 ml (5.6). Voeg toe 22 ml water en 300 pl glutaarzuuroplossing (4.10). Homogeniseer de oplossing goed met behulp van een roervlo. Handel verder volgens 6.2.
300 ~1 glutaarzuuroplossing (4.10). Homogeniseer de oplossing goed met behulp van een roervlo. Handel verder volgens 6.2.
6.2 Klaring en extractie
Voeg toe l druppel amylalcohol, sluit het flesje af met alluminiumfo-lie en plaats gedurende 20 minuten in een kokend waterbad.
Haal het flesje uit het waterbad, laat gedurende circa 3 minuten af-koelen, en voeg toe 1,5 ml Carrez I oplossing (4.2). Sluit het flesje
af en schud krachtig. Voeg toe 1,5 ml Carrez ll oplossing, sluit flesje af en schud nogmaals krachtig. Laat afkoelen tot kamertempera
-tuur en voeg 200 ~1 8 N HCL toe, meng en laat 15 minuten staan. Meng en filtreer over een normaal vouwfilter. (pH van filtraat is circa 3,5). Pipetteer circa 2 ml van het heldere filtraat in een erlenmeyer
met slijpstuk van 200 ml. Voeg 40 ml ethylacetaat (4.9) toe.
Breng een roervlo in de erlenmeyer en voeg onder goed roeren 3,5 gr natriumsulfaat (4.5) toe. Verwijder de roervlo uit de oplossing
(afspoelen met ethylacetaat), sluit de erlenmeyer af met een stop, en schud krachtig gedurende 30 seconden en filtreer de ethylacetaat over
een normaal vouwfilter in een indampkolf van 250 ml. Voeg aan het
re-sidue in de erlenmeyer nogmaals 40 ml ethylacetaat toe, sluit af, en
schud nogmaals krachtig en filtreer. Damp het filtraat in tot plus minus 2 ml aan de rotavapor (5.4) bij 40°C en breng de vloeistof met
een pasteurpipet over in een vial van 4 ml (5.2). Plaats de vial in de
reacti-therm module (5.3) en damp het monster droog onder een stikstof
stroom, bij 40°C. Het monster is nu geschikt voor methylering.
6.3 Hethylering
Voeg l ml methanolische zoutzuuroplossing toe aan het droge extract in de vial. Sluit de vial goed af en verhit gedurende l uur bij 60°C. Koel de vial af met koud stromend water. Voeg toe 0,25 rul
methanoli-sche ammoniakoplossing (4.7) en meng. Voeg een spatelpunt natriumbi-carbonaat toe en meng voorzichtig (schuimvorming).
Vervolg bijlage D
Blijf spatelpuntjes natriumbicarbonaat toe voegen en mengen (eventueel met een tubemixer) totdat geen schuimvorming meer optreedt. Sluit de vial af met een nieuwe schroefdop plus septurn en koel gedurende 10 mi-nuten bij 4°C. Verwijder zoutkristallen uit het gemethyleerde monster met een 0,45 pm filter (5.5) en vul een monsterflesje voor de gaschro-matograaf. Vul het flesje aan met methanol. Het monster is nu geschikt
voor de gaschromatografische scheiding.
7. Bereiding van een standaardoplossing voor bepaling van de respons-factoren (Kf)
Weeg af 110 mg lithiumzout van melkzuur (afhankelijk van de zuiverheid komt dit overeen met circa 100 mg melkzuur), 100 mg 3-hydroxyboter-zuur, 100 mg barnsteenzuur en 100 mg glutaarzuur , op 0,1 mg naUio~keu rig, in een erlenmeyer van 200 ml. Los de zouten op in circa 50 ml methanol en vul aan tot circa 100 ml met ethylacetaat.
Pipeteer uit deze oplossing circa 30 ~1 in een vial van 4 ml en damp met behulp van een stikstof stroom bij 40°C in tot droog. Handel verder volgens 6.3
8 Gaschromatografische analyse Omstandigheden:
- kolom: capillair CP Wax 57 CB fused silica, 25 meter lang met een interne diameter van 0,22 mm (Chrompack).
- Injektortemperatuur: 280°C - Detektortemperatuur: 280°C - Draaggas: Helium, 1,1 bar
- Kolomtemperatuur: tijdens injektie 50°C, daarna met 3°C/min naar 200°C en 15 minuten constant op 200°C
- Injektie: 2 pl, splitless. De splitter wordt geopend na 120 seconden met een splitverhouding van 1:100
Piekidentificatie:
De piekidentificatie geschied met behulp van de standaarden. Een chro-matagram van standaarden en een chromatagram van een monster zijn weergegeven in bijlage IV.
Bereken de Kf \vaarden van melkzuur, 3-hydroxyboterzuur en barnsteen-zuur ten op zichte van glutaarzuur op de volgende manier:
opp. glutaarzuur B
Kf t.o.v. glutaarzuur = x
A mg glutaarzuur
waarin A oppervlak van te bepalen zuur.
B mg van te bepalen zuur in oplossing (7)
9.2 Berekening monsters
Bereken uit de gevonden piekoppervlakten en de responstaktoren het
gehalte aan melkzuur, 3-hydroxyboterzuur en barnsteenzuur.
A x C x E x 1000
F
B x D
waarin:
F
=
gehalte van het betreffende zuur in mg/kg oorspronkelijkmateriaal.
A oppervlak van het te bepalen zuur.
B oppervlak van glutaarzuur.
C hoeveelheid glutaarzuur in mg, toegevoegd aan monster.
D g ei ingewogen.
E Kf van te bepalen zuur ten opzichte van glutaarzuur.
10 Herhaalbaarheid
Vervolg Bijlage D
11 Opgave van de resultaten
Deze resultaten worden weergegeven in mg/kg heelei of eipoeder.
De afronding van de resultaten zijn afhankelijk van de nog te bepalen herhaalbaarheid.
Verantwoordelijk: drs B.G. Muuse Samensteller: M.L. Essers
Leid gedurende ca. 30 min zoutzuurgas door methanol. Zoutzuurgas is te
genereren door. voorzichtig geconcentreerd zoutzuur te druppelen bij
geconcentreerd zwavelzuur. Het ontstane zoutzuurgas wordt door
gecon-centreerd zwavelzuur geleid als wasvloeistof en doorgeleid door
metha-nol.
Uit de gewichtstoename van de methanoloplossing is de
zoutzuurconcen-tratie te berekenen. Deze dient ca. 2 mol/L te zijn (dit is een
ge-wichtstoename van 7,5 g per 100 ml methanol).
150 ml H2S04 en 100 ml HCL leveren ca. 32 g HCL gas.
Bijlage II
Bereiding van een ammoniakale methanoloplossing.
Leid gedurende ca. 45 min ammoniakgas door methanol. Ammoniakgas is te
genereren door een geconcentreerde ammoniakoplossing te verhitten
on-der refl1m. Het vrijkomende gas wordt gedroogd door het door ongeblu-ste kalkbrokjes te leiden en wordt vervolgens door methanol geleid. Uit de gewichtstoename van de methanol is de ammoniaconcentratie te berekenen. Deze dient ca. 5 mol/L te zijn (dit is een gewichtstoename van 8,5 g per 100 ml methanol).
gehomogeniseerd heelei of eipoeder + interne standaard + water 0 20 minuten 100 C carrez I en carrez II afkoelen 200 ~1 8 N zoutzuur 15 minuten laten staan
filtreren
2 cc filtraat extraheren met
2 x 40 cc ethylacetaat en watervrij natriumsulfaat
ethylacetaat indampen
methylering met 1 ml HCL/methanol 2 mol/1
neutraliseren met 0,25 ml ammonia/methanol 5 mol/1 op pH brengen met NaHC03
10 minuten bij 4°C
filtreren over acrodisc 0,45 ~m
Bijlage IV
Chromatagram van standaarden
4
2 3
1
1
Chromatagram van een monster
4
