Stichting PAMM
Het determineren van
de Chlamydia
trachomatis L-serotypen
Eindverslag, AVANS Hogeschool
Esther van Deurssen
09-04-2013
Begeleiders Stichting PAMM:
dr. Jeroen van de Bovenkamp j.van.de.bovenkamp@pamm.nl
Christel van Herk c.van.herk@pamm.nl
Begeleidster AVANS:
Kirsten Baken ka.baken@avans.nl
dr. Walter van Gils w.vangils@avans.nl
Studente:
Esther van Deurssen e.vandeurssen@student.avans.nl e.van.deurssen@pamm.nl
Periode:
3 september 2012 – 9 april 2013 Gegevens school:
AVANS Hogeschool, Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Lovensdijkstraat 61-63 4800 RA Breda Plaats en datum: Veldhoven, 9 april 2013 Versie: 1.0
Stichting PAMM
Het determineren van
de Chlamydia
trachomatis L-serotypen
Eindverslag, AVANS Hogeschool
I
Lijst van afkortingen
µl microliter
µM micromolair
AD amplification/detection
ANUU anus uitstrijk
ATP adenosinetrifosfaat
BGM Buffalo Green Monkey
BHQ Black Hole Quencher
BLAST basic local alignment search tool
BLSV blaasjesvocht
C concentratie
CERU cervix uitstrijk
CEUR cervix en urethra uitstrijk
CF complement fixatie
CT Chlamydia trachomatis
Ct cycle treshold
Cy5 Cyanine 5
dest gedestilleerd water
DNA Desoxyribonucleïnezuur
EB elementary body
EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
EIA enzyme immuno assay
FAM 6-carboxyfluoresceïne
FW forward
GuSCN guanidine thiocyanaat
HCV Hepatitis C virus
HEX Hexachloro-fluorescein
HIV Human immunodeficiency virus
HSV herpes simplex virus
HUIU huid uitstrijk
IFU infectieuze unit
kPCR kinetische polymerase chain reaction
LCR ligase chain reaction
LGV lymphogranuloma venereum
MES 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic Acid
mg milligram
MGB minor groove binder
min minuten
MONU mond uitstrijk
MRSA Meticilline-resistente Staphylococcus aureus
MSM mannen die seks hebben met mannen
MSV moleculair serologie virologie
NCBI national centre for biotechnology information
NFQ nonfluorescent quencher
nm nanometer
nM nanomolair
nmol nanomol
II
omp major outer membrane protein
OOGU oog uitstrijk
ORVA oropharyngeaal en vaginaal uitstrijk
P probe
PAMM pathologie anatomie medische microbiologie
PCR polymerase chain reaction
PENU penis uitstrijk
pH pondus Hydrogenium
PhHv phocine herpesvirus
PID pelvic inflammatory disease
pmp polymorphic outer membrane protein
pp-mix primer-probe mix
Q quencher
R reporter
R2 correlatiecoëfficiënt
RB reticular body
RIVM Rijksinstituut voor volksgezondheid en milieu
Rn normalized reporter signal
RNA Ribonucleïnezuur
ROX 5-(en- 6)-Carboxy-X-rhodamine
RV reverse
sec seconden
SOA seksueel overdraagbare aandoening
SP sample preparation
Taq Thermus aquaticus
Tm smelttemperatuur
URHU urethra uitstrijk
URIN urine monster
V volume
III
Samenvatting
Urogenitale Chlamydia trachomatis veroorzaakt wereldwijd een van de meest voorkomende SOAs. Chlamydia trachomatis bestaat uit verschillende serotypen, die verschillende aandoeningen kunnen veroorzaken. De serotypen A-C veroorzaken trachoom, een chronische ziekte aan het oog; de serotypen D-K veroorzaken urogenitale infecties en de serotypen L1, L2 en L3 veroorzaken lymphogranuloma venereum (LGV). LGV is een geslachtsziekte die voornamelijk uit tropische en subtropische gebieden geïmporteerd wordt. In 2003 is er in Rotterdam een kleine LGV epidemie ontstaan onder, overwegend HIV positieve, mannen die seks hebben met mannen (MSM).
Tijdens deze afstudeerstage lag de focus op de Chlamydia trachomatis serotypen. Voor de detectie van de L-serotypen heeft PAMM namelijk geen determinatie protocol, waardoor determinatie uitbesteed wordt. Door het opkomend aantal patiëntenmaterialen dat op LGV getest moet worden, wil PAMM zelf over een real-time PCR voor LGV detectie beschikken.
Het doel van deze afstudeerstage was het opzetten van een real-time PCR voor de determinatie van de Chlamydia trachomatis L-serotypen. Wanneer de test voldoet aan de kwaliteitseisen van de PAMM, zal de LGV real-time PCR gebruikt worden in de routine diagnostiek.
Om het doel te bereiken zijn als eerste primers en probes specifiek voor Chlamydia trachomatis L-serotypen geselecteerd en geoptimaliseerd. Hierbij is een primer-probe matrix opgezet met primer concentraties uiteenlopend van 50 nM t/m 900 nM en probe concentraties van 50 nM t/m 600 nM. Daarna is een duplex real-time PCR opgezet met targets voor LGV en PhHv (remmingscontrole). Vervolgens is een PCR validatie uitgevoerd, bestaande uit 4 onderdelen: 1) sensitiviteit bepalen m.b.v. een verdunningsreeks van positief LGV DNA; 2) specificiteit bepalen d.m.v. een specificiteitspanel; 3) reproduceerbaarheid bepalen d.m.v. LGV positief DNA gedurende 7 dagen in drievoud te onderzoeken; 4) klinische evaluatie, door 106 patiëntenmaterialen te onderzoeken op de aanwezigheid van LGV.
Uit de resultaten is gebleken dat de meest optimale primer-probe concentraties 300:300:200 nM (FW:RV:P) zijn. De analytische sensitiviteit van de LGV PCR is vastgesteld tussen 0.1 en 0.01 IFU. Tevens geven de resultaten weer dat de LGV real-time PCR specifiek en reproduceerbaar is. Tijdens de klinische evaluatie zijn 8 patiëntenmaterialen, afkomstig van mannen, positief op LGV getest.
Patiëntenmaterialen worden op LGV onderzocht, wanneer deze met behulp van de kPCR positief getest zijn voor Chlamydia trachomatis. Uit de resultaten is gebleken dat LGV alleen gedetecteerd wordt wanneer resultaat van de kPCR een Ct waarde van 29 of zwakker bevat.
Er kan geconcludeerd worden dat een real-time PCR voor de determinatie van de Chlamydia trachomatis L-serotypen is opgezet.
IV
Summary
Urogenital Chlamydia trachomatis causes one of the most common STDs worldwide. Chlamydia trachomatis exists of different serovars, which result in diverse diseases. Serovars A-C cause trachoma, a chronic eye disease, serovars D-K cause urogenitale infections and serovars L1, L2 and L3 cause lymphogranuloma venereum (LGV). LGV is an STD imported generally from tropical and subtropical areas. In 2003 a small LGV epidemic arisen at Rotterdam, among mainly HIV positive man having sex with man (MSM).
During this internship the main focus was on Chlamydia trachomatis L-serovars. At PAMM there is no determination protocol for detection of the L-serovars, which causes externalization of the detection. Because of the rising number of patients which have to be tested on LGV, PAMM wants to possess an in-house real-time PCR for LGV detection.
The aim of this internship was to design a real-time PCR for determination of Chlamydia trachomatis L-serovars. When the test fits to the quality standards of PAMM, the LGV real-time PCR will be used in the routine diagnostics.
To reach this goal, first primers and probes specific to Chlamydia trachomatis L-serovars are selected and optimized. Therefore a primer-probe matrix was used with primer concentrations varied from 50 nM to 900 nM and probe concentrations varied from 50 nM to 600 nM. Subsequently a duplex real-time PCR was designed with targets for both LGV and PhHv (control for inhibition). Next a PCR validation was performed, consisting of 4 parts: 1) specificity determination using a serial dilution of positive LGV DNA; 2) specificity determination using a specificity panel; 3) reproducibility determination by examining positive LGV DNA during 7 days in threefold; 4) clinical evaluation, by examining the presence of LGV using 106 patient samples.
The results show that the most optimal primer-probe concentrations were 300:300:200 nM (FW:RV:P). De analytical sensitivity of the LGV real-time PCR is between 0.1 and 0.01 IFU. The results also show that the LGV real-time PCR is specific and reproducible. During the clinical evaluation samples from 8 patients were examined. Samples from patients are only examined for the presence of LGV when these samples are positive for Chlamydia trachomatis using the kPCR. Results show that LGV detection only takes place when samples from the kPCR have a Ct value of 29 or weaker.
It can be concluded that a real-time PCR for determination of the Chlamydia trachomatis L-serovars has been designed.
V
Inhoudsopgave
Lijst van afkortingen ... I Samenvatting ... III Summary ... IV 1. Inleiding ... 1 1.1 Algemeen ... 1 1.2 Doel... 1 1.3 Opzet ... 1 2. Theoretische achtergrond ... 2 2.1 Chlamydia trachomatis ... 2 2.2 Pathogenese ... 3 2.3 Trachoom ... 4 2.4 Urogenitale infectie ... 5 2.5 Neonatale infectie ... 5 2.6 Lymphogranuloma venereum ... 6 2.7 Epidemiologie ... 7 3. Technieken ... 10
3.1 Diagnostiek van Chlamydia trachomatis ... 10
3.2 DNA isolatie ... 11 3.3 Moleculaire biologie ... 14 3.4 Validatie ... 20 4. Materialen en methoden ... 21 4.1 Benodigdheden ... 21 4.2 Methoden ... 22 Optimalisatie... 22 Validatie ... 25
De invloed van vriezen/dooien en de koelkast ... 26
EasyMAG ten opzichte van kPCR ... 26
Klinische evaluatie ... 27
Controles... 27
5. Resultaten ... 29
5.1 Optimalisatie ... 29
5.2 Validatie ... 33
5.3 EasyMAG ten opzichte van kPCR ... 36
5.4 Klinische evaluatie ... 38
VI
6.1 Discussie ... 39
6.2 Conclusie... 42
Literatuurlijst ... 43
Bijlagen ... 46
Bijlage I: Primer/probe design ... 46
Bijlage II: Het opzetten van de verdunningsreeks ... 48
Bijlage III: Berekening primer/probe concentraties (verdunning) ... 49
Bijlage IV: Overzicht optimalisatie primerconcentraties ... 50
Bijlage V: Overzicht optimalisatie primer/probe concentraties ... 51
Bijlage VI: Specificiteitspanel ... 52
Bijlage VII: Isolatie protocol EasyMAG ... 53
Bijlage VIII: Isolatie protocol Versant kPCR ... 55
Bijlage IX: TaqMan 7500 PCR protocol ... 59
Bijlage X: Analytische sensitiviteit ... 61
Bijlage XI: Standaarddeviaties en efficiënties van de reproduceerbaarheid ... 62
Bijlage XII: Efficiënties van de totale assay ... 64
1
1. Inleiding
1.1 Algemeen
PAMM is opgericht in 1947, wegens de behoefte aan een gezamenlijk ziekenhuislaboratorium voor pathologie en medische microbiologie in de regio Zuidoost-Brabant. Er wordt intensief en structureel samengewerkt met 4 ziekenhuizen, namelijk het Catharina ziekenhuis, Maxima Medisch centrum, St. Anna ziekenhuis en het Elkerliek ziekenhuis; huisartsen en andere zorgverleners. Sinds 2000 is PAMM een zelfstandig laboratorium. PAMM is verdeeld over 2 locaties, Eindhoven en Veldhoven. In Eindhoven is het laboratorium voor pathologie gevestigd en in Veldhoven het laboratorium voor Medische Microbiologie. Het laboratorium voor Medische Microbiologie is opgedeeld in twee richtingen: bacteriologie en MSV (moleculair, serologie en virologie). Mijn afstudeerstage vindt plaats op de afdeling MSV. Op de afdeling MSV wordt patiëntenmateriaal onderzocht op mogelijk pathogene micro-organismen. De routinewerkzaamheden bestaan uit verschillende onderzoeken, waaronder ook de detectie van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA).
Urogenitale Chlamydia trachomatis veroorzaakt wereldwijd een van de meest voorkomende SOAs (Chlamydia). Chlamydia trachomatis bestaat uit verschillende serotypen, die verschillende aandoeningen kunnen veroorzaken. De serotypen A-C veroorzaken trachoom, een chronische ziekte aan het oog, de serotypen D-K veroorzaken urogenitale infecties en de serotypen L1, L2 en L3 veroorzaken Lymphogranuloma venereum (LGV). LGV is een geslachtsziekte die voornamelijk uit tropische en subtropische gebieden geïmporteerd wordt. In 2003 is er in Rotterdam een kleine LGV epidemie ontstaan onder, overwegend HIV positieve, mannen die seks hebben met mannen (MSM).
1.2 Doel
Voor de detectie van de L-serotypen heeft PAMM geen determinatie protocol, waardoor de determinatie uitbesteed wordt. Aangezien het opkomend aantal patiëntenmaterialen dat op LGV getest moet worden, wil PAMM zelf over een real-time PCR voor LGV detectie beschikken. Gedurende deze afstudeerstage is onderzoek gedaan naar de determinering van de Chlamydia trachomatis L-serotypen.
Het doel van deze afstudeerstage was het opzetten van een real-time PCR voor de determinatie van de Chlamydia trachomatis L-serotypen. Het is de bedoeling dat de LGV PCR gebruikt gaat worden in de routinewerkzaamheden op PAMM.
1.3 Opzet
Dit verslag bevat in hoofdstuk 2 de theoretische achtergrond informatie welke achtereenvolgens informatie beschrijft over Chlamydia trachomatis, pathogenese, trachoom, urogenitale infectie, lymphogranuloma venereum en de epidemiologie. In hoofdstuk 3 wordt de theorie achter de technieken beschreven welke achtereenvolgens bestaat uit de paragrafen: diagnostiek, DNA isolatie, moleculaire biologie en validatie. De materialen en methoden zijn in hoofdstuk 4 beschreven en de resultaten zijn weergegeven in hoofdstuk 5. Hoofdstuk 6 bevat de discussie en conclusie en hoofdstuk 7 bevat de aanbevelingen. De referenties zijn opgenomen in de literatuurlijst en als laatste zijn de bijlagen te vinden.
2
2. Theoretische achtergrond
Gedurende dit hoofdstuk wordt de theorie rondom de afstudeeropdracht beschreven. Er wordt informatie verschaft over de bacterie Chlamydia trachomatis, de pathogenese, de aandoeningen die Chlamydia trachomatis veroorzaakt waaronder ook LGV en tevens wordt de epidemiologie beschreven.
2.1 Chlamydia trachomatis
Chlamydia trachomatis is wereldwijd een van de meest bekende en meest voorkomende pathogeen als veroorzaker van een seksueel overdraagbare aandoening. In 1907 werd Chlamydia trachomatis voor het eerst geïsoleerd uit ooguitstrijken, door Halberstaedter en Prowazek.[1] Pas in 1957 werd Chlamydia trachomatis geïsoleerd uit materiaal van de urogenitaliën.[2] Vanaf 1965, na ontwikkeling van de weefselkweek, was het mogelijk om klinisch onderzoek naar Chlamydia trachomatis infecties uit te voeren.[2]
Chlamydia trachomatis is een pathogene Gramnegatieve bacterie met een grootte van 0.2 micrometer, leeft obligaat intracellulair en vermenigvuldigt zich daar.[3][4] In het verleden werd Chlamydia trachomatis gerekend tot de virussen, omdat ze niet op kunstmatige voedingsbodems kunnen groeien. In tegenstelling tot alle andere bacteriesoorten is deze bacterie niet in staat zelf energie (ATP) voor zijn metabolisme aan te maken. Ook verloopt de aanmaak van aminozuren niet of nauwelijks. Hierdoor is Chlamydia trachomatis volkomen afhankelijk van een gastheercel, welke ATP en voedingsstoffen verschaft. Chlamydia trachomatis vermenigvuldigt zich in de gastheercel, waarbij de cel wordt vernietigd en de bacteriën vrijkomen om weer andere cellen te infecteren. Chlamydia trachomatis heeft een voorkeur voor cilindrisch epitheel van de cervix, de urethra en het rectum.[3]
Chlamydia trachomatis behoort tot de Chlamydiaceae familie, onder de orde Chlamydiales. Tegenwoordig is deze bacterie onderverdeeld in serovars, oftewel serotypen, die verschillende aandoeningen kunnen veroorzaken. Deze serotypen kunnen ook weer onderverdeeld zijn in subtypen, aangeduid met een ‘a’ of ‘b’. Op basis van klinische gegevens kan Chlamydia trachomatis ingedeeld worden in drie groepen.
1. De serotypen A, B/Ba en C veroorzaken trachoom. Dit is een chronische ziekte aan het oog waarbij het bindvlies ontstoken is en kan leiden tot blindheid.[5] Trachoom komt voornamelijk voor in ontwikkelingslanden onder gebrekkige hygiënische omstandigheden.
2. De serotypen D tot K veroorzaken urogenitale infecties. Deze groep veroorzaakt wereldwijd een van de meest voorkomende seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA): Chlamydia. De meeste Chlamydia infecties zijn a-symptomatisch en blijven daardoor onbehandeld.
3. Tevens is er een derde groep serotypen, namelijk de LGV-serotypen L1, L2/L2a/L2b en L3. Deze serotypen veroorzaken lymphogranuloma venereum (LGV). LGV is een aandoening die ontsteking van de lymfeklieren veroorzaakt.[4][6]
In tabel 1 zijn de serotypen en de bijbehorende aandoeningen weergegeven.
Tabel 1: Een overzicht van de serotypen van Chlamydia trachomatis, bijbehorende aandoeningen en verspreiding.
Serotypen Aandoening Verspreiding
A, B/Ba, C Trachoom Hand-naar-oog, fomiten, vliegen
D/Da, E, F, G/Ga, H, I/Ia, J/Ja, K Geslachtsziekten Seksueel overdraagbaar en perinataal
L1, L2/L2a/L2b, L3 Lymphogranuloma venereum Seksueel overdraagbaar, voornamelijk
homoseksuele contacten
Daarnaast zijn er andere soorten van de Chlamydiaceae familie, zoals Chlamydophila pneumoniae (veroorzaakt longontsteking), Chlamydophila abortus (veroorzaakt abortussen bij zoogdieren), Chlamydophila psitacci (veroorzaakt papegaaienziekte), Chlamydia suis (voorkomend bij zwijnen), Chlamydia muridarum (voorkomend bij knaagdieren van de familie muridae), e.a.[7] In figuur 1 is een fylogenetische stamboom zichtbaar van de familie Chlamydiaceae.
3
Figuur 1: Fylogenetische stamboom van de familie Chlamydiaceae.
2.2 Pathogenese
Alle Chlamydia soorten kunnen alleen voortbestaan in een eukaryotische gastheercel en doorlopen een unieke levenscyclus. Chlamydia treedt de gastheercel binnen, vermenigvuldigd zich daar en komt vervolgens weer vrij om nieuwe gastheercellen te besmetten. Gedurende deze cyclus komt Chlamydia voor in twee vormen: het infectieuze elementaire lichaam (‘elementary body’/EB) en het reticulaire lichaam (‘reticular body’/RB).[7][8] Het elementaire lichaam is de infectieuze vorm van de bacterie die zich buiten de cel bevindt. Het elementaire lichaam is klein, metabolisch inactief en is verantwoordelijk voor het binnentreden van de gastheercel. Na het binnendringen in de gastheercel, verandert de bacterie structuur van het elementaire lichaam in het reticulaire lichaam. Het reticulaire lichaam is groter, metabolisch actief en repliceert zich.[9]
De Chlamydia levenscyclus begint met het binnentreden van de elementaire lichamen in de gastheercel via de celmembraan. Nadat de elementaire lichamen de cel zijn binnengedrongen activeren ze, waarna de elementaire lichamen tot reticulaire lichamen differentiëren. Vervolgens delen de reticulaire lichamen zich binair in vesikels in het cytoplasma en een groot deel gaat hierbij over in nieuwe elementaire lichamen. De nieuwe elementaire lichamen komen vrij na versmelting van de vesikel met de celmembraan (cel lysis) en zijn in staat om weer opnieuw een gastheercel infecteren. Bij aanwezigheid van remmingsfactoren, die de groei verhinderen, differentieert Chlamydia in een niet-delende, persistente vorm. Wanneer de remmingsfactoren verwijderd zijn, keert Chlamydia weer terug in zijn oorspronkelijke vorm.[7][8] De cyclus is schematisch weergegeven in figuur 2. Chlamydiales Chlamydiaceae Chlamydia C. trachomatis C. suis C. muridarum Chlamydophila C. abortus C. caviae C. felis C. pecorum C. pneumoniae C. psittaci
4
Figuur 2: De Chlamydia levenscyclus, waarin Chlamydia de cel binnendringt, zich repliceert en de cel lyseert.
2.3 Trachoom
Trachoom wordt veroorzaakt door Chlamydia trachomatis serotypen A, B/Ba en C. Trachoom is een oogontsteking die blijvende littekens achter laat op het hoornvlies. In West-Europa komt trachoom zelden voor, toch is het wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Trachoom treedt op onder gebrekkige hygiënische omstandigheden en komt voornamelijk voor in Zuid-Europa, het Midden-Oosten en het Verre Oosten. [5][10]
2.3.1 Ziektebeeld
Trachoom veroorzaakt als eerste een ontsteking van het bindvlies (conjunctivis). De oogleden raken opgezwollen en het oog zelf wordt rood. Vervolgens ontstaan kleine bultjes aan de binnenkant van het bovenste ooglid, die een waas op de ogen leggen. Symptomen die hierbij optreden, zijn dikke etterige afscheiding in het ontstoken oog, roodheid van het oogwit en korrelig gevoel in het oog.
Na verloop van tijd ontstaat er littekenweefsel aan de binnenkant van de oogleden, waardoor de oogleden naar binnen worden getrokken. Hierdoor schuren de wimpers langs het hoornvlies waardoor het hoornvlies ernstig wordt beschadigd. Uiteindelijk kan dit leiden tot blindheid.[10][11]
2.3.2 Behandeling
Behandeling in het vroege stadium van trachoom kan door middel van antibioticaoogdruppels of –zalf, bestaande uit tetracycline 0.5%.[11] Bij voorkeur wordt azitromycine gebruikt, omdat azitromycine zeer effectief is en met slechts één orale dosis wordt een hoog genezingspercentage bereikt.[12]
5
2.4 Urogenitale infectie
Urogenitale Chlamydia infecties worden veroorzaakt door de serotypen D tot K. De urogenitale Chlamydia infectie veroorzaakt wereldwijd een van de meest voorkomende SOA. In 70% van de vrouwen en 50% van de mannen treden asymptomatische infecties op, waardoor veel Chlamydia infecties niet onderzocht worden.[2]
2.4.1 Ziektebeeld
Urogenitale Chlamydia infectie bij de vrouw.
Slechts een klein deel van de vrouwen waarbij Chlamydia trachomatis aangetroffen is, heeft klachten ondervonden. Klachten die kunnen ontstaan zijn: pijn of een branderig gevoel bij het plassen, veranderde afscheiding qua geur/kleur of hoeveelheid, bloeding van de cervix tussen menstruaties door, pijn of bloedverlies bij seksueel contact en onderbuikklachten.[13][2] Symptomatische infecties kunnen zijn: cervicitis (baarmoederhalsontsteking), urethritis (ontsteking van de urinebuis), endometritis (infectie van het endometrium), salpingitis (eileiderontsteking) en pelvic inflammatory disease (PID, ontsteking in het kleine bekken).[13] Endometritis, salpingitis en PID ontstaan meestal als gevolg van het opstijgen van een onbehandelde Chlamydia infectie en kunnen leiden tot chronische onderbuikpijn, verminderde vruchtbaarheid, infertiliteit en ectopische zwangerschap.
Tijdens de zwangerschap kan een onbehandelde Chlamydia infectie een verhoogd risico geven op voortijdige weeën, vroegtijdig gebroken vliezen, vroeggeboorte en een laag geboortegewicht. Ook heeft de vrouw na de bevalling een verhoogd risico op endometritis.[2]
Urogenitale Chlamydia infectie bij de man.
Mannen met een urogenitale Chlamydia trachomatis infectie ondervinden vaker klachten dan vrouwen. Als mannen klachten ondervinden, zijn dat een branderig gevoel bij het plassen, waterige tot pusachtige afscheiding en soms pijn in de balzak.[2] Chlamydia trachomatis is de hoofdoorzaak van niet gonokokken gerelateerde urethritis. Andere gevolgen van een urogenitale Chlamydia infectie kunnen zijn: epididymitis (bijbalontsteking), proctitis (endeldarmontsteking) en prostatitis (ontsteking van de prostaatklier). Deze aspecten treden voornamelijk op ten gevolge van een onbehandelde Chlamydia trachomatis infectie die opstijgt.[13][2] In 1-4% van de gevallen kan een opstijgende infectie leiden tot prostatitis en epididymitis wat uiteindelijk infertiliteit kan veroorzaken.[2]
2.4.2 Behandeling
Een urogenitale Chlamydia trachomatis infectie is goed te behandelen met antibiotica. Bij voorkeur wordt een behandeling gedaan met een eenmalige dosis azitromycine: 2 maal 500 mg per os in een keer innemen. Alternatief voor deze behandeling is een doxycyclinekuur: 2 maal per dag 100 mg gedurende 7 dagen. Tot nu toe is er geen noemenswaardige resistentie tegen de gebruikte geneesmiddelen gebleken.[2]
2.5 Neonatale infectie
Pasgeborenen van moeders met een Chlamydia trachomatis infectie kunnen geïnfecteerd worden tijdens de uitdrijvingsfase bij een vaginale bevalling. De kans op besmetting bedraagt 50-75% en ontwikkelt zich meestal in conjunctivitis en pneumonie.[14][2]
2.5.1 Ziektebeeld
Ongeveer 30-50% van de pasgeborenen van geïnfecteerde moeders krijgen 5-10 dagen na geboorte conjunctivitis.[13] Hierbij treden symptomen op zoals het tranen van de ogen en dikke, rode en gevoelige oogleden.[15] Minstens 50% van de pasgeborenen met conjunctivitis krijgen een neus- keelholte infectie.[14] In ongeveer 30% van de gevallen ontwikkelt zich, na 2-3 weken, Chlamydia pneumoniae.[13]
2.5.2 Behandeling
Een neonatale infectie wordt vaak behandeld met antibioticabevattende oogdruppels. Zoutwater oogdruppels kunnen ook gebruikt worden om plakkerige drainage uit de ogen te verwijderen.[15]
6
2.6 Lymphogranuloma venereum
De Chlamydia trachomatis L-serotypen zijn de oorzaak voor lymphogranuloma venereum (LGV), een geslachtsziekte die voornamelijk uit tropische en subtropische gebieden (zoals Afrika, Zuid Azië en de Caribische eilanden) geïmporteerd wordt. LGV werd voor het eerst beschreven als seksueel overdraagbaar in 1913 en in 1930 werd Chlamydia trachomatis als veroorzaker van LGV vastgesteld.[2] De Chlamydia trachomatis L-serotypen bestaan uit L1, L2 en L3 serotypen. Na verloop van tijd is serotype L2 onder te verdelen in L2, L2’, L2a en L2b. Deze indeling is gebaseerd op enkele verschillen in aminozuren.[16]
2.6.1 Ziektebeeld
De L-serotypen zijn veel invasiever en geven een ernstiger ziekteverloop dan andere Chlamydia trachomatis serotypen. Dit verschil in ziekteverloop wordt veroorzaakt doordat de serotypen D-K alleen slijmvliesepitheel infecteren en de L-serotypen de dieper gelegen lagen infecteren. Dit leidt tot versleping van de infectie en heftige immunologische reacties. Een infectie met Chlamydia trachomatis L-serotypen kan ernstige klachten tot gevolg hebben.[17]
Het klinische beloop van LGV kan verdeeld worden in drie stadia.
1. Het inoculatie stadium. Afhankelijk van de plaats van besmetting, ontstaat er ongeveer 3 tot 30 dagen na de besmetting een klein onopvallend zweertje op de contactplaats, dat meestal weer snel verdwijnt. Dit zweertje hoeft niet altijd te ontstaan en blijft vaak onopgemerkt.
2. Het locoregionale stadium. Na een aantal weken ontstaat er een infectie in de onderliggende weefsels, die resulteert in een heftig verlopende ontsteking van het slijmvlies. Ook kan er, door versleping van de bacterie naar de lymfeklieren, een ontsteking van de lymfeklieren (lymfadenopathie) optreden. Er is meestal sprake van lymfeklierzwellingen in de lies.
3. Het late stadium. Er wordt gesproken van het late stadium bij een langdurige onbehandelde LGV infectie. In dit stadium leiden chronisch ontstoken wondjes tot littekens van het genitaal stelsel. Bij onbehandelde LGV kan fibrose leiden tot onomkeerbare complicaties, zoals beschadiging van de organen in de onderbuik, genitaliën en lymfen, stricturen (vernauwing van organen), infertiliteit en het ‘frozen pelvis syndrome’. Er wordt gesproken van het ‘frozen pelvis syndrome’ wanneer er verklevingen rond de organen in het bekken zijn ontstaan. Behalve de bovengenoemde complicaties, kan ook onomkeerbaar lymfeoedeem (ophoping van lymfevocht) van de externe genitaliën ontstaan (elefantiasis).[17][2]
Naast de verschillende LGV stadia wordt het klinisch beloop tevens bepaald door de inoculatie plaats. Er worden drie LGV syndromen onderscheiden. Anorectale LGV, inguinale LGV en faryngeale LGV. Over anorectale LGV wordt gesproken als het om een infectie van het rectum gaat. Hierbij ontstaan klachten zoals anale afscheiding, pijn, jeuk, krampen en obstipatie. Inguinale LGV is een infectie van de uitwendige genitaliën en geeft klachten zoals pijnlijke lymfeklierzwelling. Bij faryngeale LGV heeft inoculatie van de keelholte plaatsgevonden. Dit LGV syndroom is zeldzaam en kan zorgen voor slijmvliesafwijkingen en lymfadenopathie in de nek en/of hals.[2]
2.6.2 Behandeling
Het is belangrijk om een urogenitale Chlamydia trachomatis infectie te onderscheiden van een LGV infectie, omdat de behandeling anders verloopt. Chlamydia trachomatis L-serotypen zijn namelijk in staat tot 16 dagen aan te houden onder een doxycyclinekuur. Daarom wordt er voor de behandeling van LGV een 21 dagen durende doxycycline kuur van 2 maal per dag 100 mg, voorgeschreven.[2]
7
2.7 Epidemiologie
2.7.1 Besmetting
Chlamydia trachomatis gebruikt als reservoir de mens. Aan de hand van de verschillende aandoeningen zijn verschillende besmettingswegen mogelijk. Besmetting kan alleen plaatsvinden door direct of indirect contact met de bacterie. Bij trachoom vindt besmetting voornamelijk plaats via oog-hand contact, door besmette voorwerpen en door vliegen. Ook kan verspreiding plaatsvinden via stofdeeltjes in de lucht. Een neonatale infectie vindt altijd plaats van moeder op kind en de overdracht van de infectie gebeurt tijdens de baring. Bij een urogenitale Chlamydia infectie en bij een infectie met LGV vindt besmetting plaats door middel van seksueel contact, waarbij de slijmvliezen met elkaar in aanraking komen. De belangrijkste overdracht is via onbeschermd seksueel contact zowel genitogenitaal en genitoanaal. Transmissie bij orogenitaal contact is mogelijk, maar vindt zelden plaats. Risicogroepen die in verband staan met LGV besmetting zijn MSM en personen met een HIV besmetting.[2]
Vanwege het vele voorkomen van asymptomatische Chlamydia trachomatis infecties, zijn er weinig betrouwbare gegevens over de gemiddelde infectieduur en de besmettelijkheid van Chlamydia trachomatis. Er is wel bekend dat de transmissie van man naar vrouw gemakkelijker verloopt dat de transmissie van vrouw naar man. De transmissiekans van man naar vrouw is 45% en van vrouw naar man is 28%.[2]
2.7.2 Verspreiding
Urogenitale Chlamydia trachomatis veroorzaakt wereldwijd een van de meest voorkomende SOA’s. Na afronding van een landelijk screeningsonderzoek in 2004 onder 21 000 personen is er geschat dat er jaarlijks ongeveer 60 000 nieuwe infecties ontstaan.[18] Er is een groot besmettingsrisico onder seksueel actieve vrouwen, met name onder de 25 jaar. Dit risico is gerelateerd aan de (gemiddeld genomen) grotere seksuele activiteit op een leeftijd onder de 25 jaar en waarschijnlijk ook aan het vaker voorkomen van ectropion in deze leeftijdsgroep. Ectropion is een verschijnsel waarbij het cilindrisch epitheel, wat zich normaal gesproken in de baarmoederhals bevindt, uitbreidt naar buiten. Dit verschijnsel komt vaak voor bij mensen onder de 25 jaar. Het slijmvlies waaruit ectropion is opgebouwd is gevoeliger voor een infectie met Chlamydia trachomatis. Ook personen uit grote steden, personen die al eerder positief getest zijn, HIV positieve MSM en personen met een Surinaamse/Antilliaanse/Arubaanse achtergrond hebben een verhoogd besmettingsrisico. In figuur 3 zijn verschillende etnische groepen te zien met het percentage positieve Chlamydia trachomatis testen. Andere risicofactoren betreffen frequente verandering van partner, meerdere partners en onveilige seks.[2][13]
Figuur 3: Het percentage positieve testen van Chlamydia trachomatis per etnische groep, geslacht en seksuele voorkeur.[19]
8 In 2011 werden er 12 913 gevallen van urogenitale Chlamydia trachomatis gediagnosticeerd, met een algehele positiviteit van 11.5%. Het aantal gevallen is toegenomen met 12% vergeleken met 2010, maar daarentegen is het percentage positieve chlamydia testen nauwelijks toegenomen: van 11.2% in 2010 naar 11.5% in 2011. In figuur 4 is een overzicht weergegeven van het aantal positieve Chlamydia trachomatis testen van 2004 tot en met 2011.
Het aantal positieve Chlamydia trachomatis gevallen in 2011 bestond voor 47% uit vrouwen, 35% uit heteroseksuele mannen en 8% uit MSM. Van de positieve patiëntenmaterialen was 56% afkomstig van personen onder de 25 jaar. 18% van de positieve gevallen bestond uit vrouwen in de leeftijdsgroep 15-19 jaar en 20% bestond uit mannen in de leeftijdsgroep 15-19 jaar. Van personen die al eerder positief zijn getest op een SOA is 16% positief getest, bij personen afkomstig uit Suriname, de Nederlandse Antillen en/of Aruba is 18% positief getest en ook 18% is positief getest bij HIV positieve MSM.[19]
Figuur 4: Het totaal aantal Chlamydia trachomatis testen en percentage positieve testen per geslacht en seksuele voorkeur over de jaren 2004-2011. [19]
In 2003 was er in Rotterdam een kleine LGV epidemie geconstateerd onder, overwegend HIV positieve, MSM. Vanaf 2004 volgden meldingen van uitbraken uit de rest van Nederland, Europese landen en de VS. Ook de rest van Noord-Amerika en Australië volgden kort daarop.[2] In 2008 werden in de SOA centra 9433 nieuwe positieve Chlamydia diagnoses gesteld. Hiervan werd 100 keer een LGV infectie gediagnosticeerd, allemaal in MSM en waarvan 71% HIV positief was.[2] Uit gegevens van het RIVM blijkt dat in 2010 in de SOA centra 11526 nieuwe positieve Chlamydia diagnoses gesteld werden, waarvan 66 LGV positief en hiervan was 74% HIV positief.[2] In figuur 5 is het aantal positieve LGV diagnoses weergegeven over de jaren 2004-2011.
9 De meerderheid van de LGV infecties werd veroorzaakt door Chlamydia trachomatis serotype L2. Voornamelijk de L2b variant werd gevonden. Er is nagegaan of er sprake was van een nieuwe LGV uitbraak óf dat de L2b variant ook al voor 2002 voorkwam, maar onopgemerkt is gebleven. Uit onderzoek is gebleken dat de L2b variant terug te vinden is tot in de jaren ’80. Het Chlamydia trachomatis L2b serotype bevat hedendaags dezelfde mutaties in het ompA gen als gevonden zijn in de jaren ’80. Hierdoor kan geconcludeerd worden dat de huidige uitbraak zich al langer verspreid.[20]
Hoewel er overwegend MSM besmet zijn, is recent de eerste vrouwelijke patiënt met LGV gerapporteerd. Het is zeer waarschijnlijk dat deze LGV epidemie zich buiten de MSM gemeenschap zal gaan verspreiden. Het is aannemelijk dat LGV zich zal verspreiden naar biseksuele mannen en vervolgens naar heteroseksuele vrouwen.[21]
10
3. Technieken
In dit hoofdstuk wordt achtergrondinformatie over de technieken, gebruikt bij het opzetten van een LGV PCR, gegeven. Er wordt o.a. ingegaan op de principes van de EasyMAG, kPCR, conventionele PCR en real-time PCR.
3.1 Diagnostiek van Chlamydia trachomatis
Er zijn verschillende testen ontwikkeld voor de detectie van Chlamydia trachomatis, zoals celkweek, antigeendetectie en amplificatietesten. Echter, de testen voor Chlamydia trachomatis zijn niet altijd van toepassing op de L-serotypen. De reden hiervoor is dat veel testen opgezet worden voor een algemene Chlamydia trachomatis bepaling, dus waarin alle serotypen een positief resultaat opleveren. De belangrijkste testen zijn hieronder beschreven.
3.1.1 Celkweek
Celkweek is een van de testen die in het verleden werd uitgevoerd om Chlamydia trachomatis te determineren. Om Chlamydia trachomatis te kweken worden doorgaans McCoy cellen gebruikt. Een voordeel van celkweek is dat het een specificiteit bevat van nagenoeg 100%. Toch wordt het niet aanbevolen voor routine gebruik, omdat de nadelen opwegen tegen de voordelen. Een van de nadelen is dat celkweek van Chlamydia trachomatis niet sensitief is. Bovendien neemt celkweek veel tijd in beslag waardoor het een aantal dagen kan duren voor een uitslag bekend is. Celkweek kan alleen uitgevoerd worden met levende organismen, waardoor er maatregelen getroffen moeten worden tijdens transport en opslag van patiëntenmateriaal.[13]
3.1.2 Serologie
Antigeentesten zijn jarenlang gebruikt om Chlamydia trachomatis infecties aan te tonen. Antigeentesten zijn ten opzichte van de kweek sneller en goedkoper en vereisen geen levende organismen. Maar ook deze testen zijn niet altijd even betrouwbaar. Een acute Chlamydia trachomatis infectie kan meestal niet gedetecteerd worden, omdat het enige tijd duurt voordat een titerstijging plaatsvindt. Ook kan het voorkomen dat er kruisreacties plaatsvinden met andere Chlamydia species.
De meest voorkomende antigeentesten zijn complement fixatie (CF) testen, immunofluorescentie testen en enzym immuno assays (EIA).[13]
De complement fixatie test is lange tijd gebruikt om Chlamydia trachomatis infecties aan te tonen. De test is niet erg betrouwbaar, omdat alleen het gen specifiek is en daardoor geen onderscheid maakt tussen C. trachomatis, C. psittaci en C. pneumoniae. LGV werd onderscheiden doordat een infectie met LGV leidt tot hogere titerbepalingen dan een infectie met Chlamydia trachomatis serotypen A-K. Immunofluorescentietesten kunnen onderscheid maken tussen infecties met verschillende Chlamydia species, maar worden niet vaak gebruikt in de routine omdat het een fluorescentie microscoop en specialistische kennis vereist. Met EIA testen worden Chlamydia trachomatis antigenen gedetecteerd, meestal lipopolysaccharide. De meeste EIAs maken geen onderscheid tussen de verschillende Chlamydia trachomatis serotypen, waardoor deze test niet geschikt is voor de detectie van LGV.[13][17]
3.1.3 DNA amplificatie testen
De afgelopen jaren hebben zich verschillende ontwikkelingen plaatsgevonden in de moleculaire biologie, die hebben gezorgd voor een doorbraak. Deze ontwikkelingen betreffen DNA amplificatie testen, zoals polymerase chain reaction (PCR), real-time PCR, ligase chain reaction (LCR) etc. Deze amplificatie testen blijken veel sensitiever te zijn dan de celkweek en serologische testen. Daarbij zijn de amplificatie testen snel en kunnen ze de Chlamydia trachomatis serotypen onderscheiden, waardoor ze geschikt zijn voor gebruik in de microbiologische laboratoria.[17]
Er is een real-time PCR ontwikkeld voor de determinatie van Chlamydia trachomatis L-serotypen. Hierover is beschreven dat er voornamelijk detectie plaatsvindt van twee specifieke genen. Het omp1 gen en het pmp-H gen. Het omp1 gen is geschikt voor de typering van de L-serotypen, waarin de serotypen L1, L2 en L3 worden
11 onderscheiden. Het pmp-H gen is specifiek voor de gehele groep van L-serotypen en is dus geschikt voor het onderzoeken naar LGV. Op PAMM is de typering van de L-serotypen niet relevant, dus wordt er gedetecteerd met behulp van het pmp-H gen.[4]
3.2 DNA isolatie
3.2.1 EasyMAG
DNA/RNA extractie vindt plaats met behulp van de NucliSENS® EasyMAG®. De EasyMAG is een semi-geautomatiseerd apparaat wat DNA en/of RNA extractie verschaft uit verschillende biologische materialen. Het zorgt ervoor dat er 24 reacties in ongeveer 40-60 minuten geïsoleerd kunnen worden. In één run kan DNA/RNA uit meerdere biologische materialen geïsoleerd worden met dezelfde extractie methode, wat een groot voordeel is in de diagnostiek. Ook is het mogelijk om het input volume en het elutie volume per monster aan te passen. Kortom, er kan één techniek gebruikt worden voor de extractie van alle sample typen en volumen. Het principe van de EasyMAG is gebaseerd op de BOOM technologie, ontwikkeld door Boom et al.[22][23] en verder ontwikkeld voor automatisering door een research team van BioMérieux. De BOOM technologie maakt gebruik van magnetische silica, dat de eigenschap heeft om nucleïnezuren, dus DNA en RNA, te binden.[11] De EasyMAG werkt met vloeibare of vervloeide patiëntenmaterialen. Er wordt via een aantal stappen van complex biologisch materiaal naar zuiver nucleïnezuur gewerkt.
De eerste stap is het lyseren van het patiëntenmateriaal met behulp van een lysisbuffer. Hierdoor wordt elke cellulaire stof, viraal deeltje, bacterie of schimmel gelyseerd en komt het DNA/RNA vrij. Een andere functie van de lysisbuffer is het inactiveren van nucleases die aanwezig kunnen zijn, waardoor de nucleïnezuren stabiel blijven. De lysisbuffer kan op 2 manieren worden toegevoegd: ‘on board’ en ‘off board’. Bij ‘on board’ lysis wordt er door de EasyMAG zelf lysisbuffer toegevoegd, volgens een standaard protocol. Bij ‘off board’ lysis wordt handmatig lysisbuffer toegevoegd, waardoor de lysis stap gevarieerd kan worden. Tijdens de volgende stap wordt de magnetische silica toegevoegd. Het vrijgekomen DNA/RNA bindt aan de silica en daarna wordt de silica, met de gebonden nucleïnezuren, weggevangen met behulp van een magneet. Vervolgens wordt het geheel gewassen, waardoor al het ongebonden materiaal verwijderd wordt. Gedurende de wasstap worden 2 verschillende wasbuffers gebruikt: wasbuffer
1 en wasbuffer 2. Wasbuffer 1 bevat een 5M Guanidine thiocyanaat (GuSCN) oplossing, welke vrijwel gelijk is aan de lysisbuffer. Tijdens deze wasstap worden remmers en celresten weggevangen. Wasbuffer 2 is een MES buffer die zorgt voor het wegwassen van de GuSCN, afkomstig van de lysisbuffer en wasbuffer 1. Vervolgens vindt elutie van het DNA/RNA plaats door wasbuffer 3 toe te voegen. Wasbuffer 3 is een boraatbuffer en dient als elutiebuffer. Deze buffer heeft een pH van 8.5, waardoor de condities gunstig worden voor het losmaken van de nucleïnezuren van de silica. Deze pH verandering zorgt er tevens voor dat de nucleïnezuren niet opnieuw aan de silica zullen binden. Vervolgens wordt de temperatuur naar 70 °C verhoogd, waardoor de elutie plaatsvindt. Als laatste wordt de magneet verplaatst, zodat de silica en het eluaat gescheiden worden. Het eluaat moet binnen 30 minuten verzameld worden, omdat de silica na deze tijd is opgedroogd en zal dan uitzakken. In figuur 6 is het principe van de EasyMAG schematisch weergegeven.[11][12][24]
Deze stappen vinden plaats in een vessel, waarin als eerste het patiëntenmateriaal wordt gepipetteerd. Bij deze vessel hoort een aspirator, wat vergeleken kan worden met een reeks pipettips. Het toevoegen en verwijderen van buffers wordt automatisch gedaan met behulp van een ‘dispense needle’. Deze ‘dispense
Figuur 6: Het principe van extractie m.b.v. de EasyMag.[12]
12 needle’ staat direct in contact met de buffers en komt niet in aanraking met het patiëntenmateriaal. Met behulp van de aspirator worden de buffers afgepipetteerd. De silica moet handmatig toegevoegd worden, omdat deze in de koeling bewaard wordt en dus geen deel uit maakt van het automatische protocol.[24]
De EasyMAG kent drie protocollen, namelijk Specific A, Specific B en Generic 2.0.1. Deze protocollen zijn afgestemd op specifieke sample typen en kunnen niet door elkaar in eenzelfde run gebruikt worden. Het Generic protocol is ontwikkeld voor gebruik van diverse sampletypen die relatief eenvoudig van samenstelling zijn zoals plasma, serum of liquor. Tijdens dit protocol wordt gebruik gemaakt van 50 µl silica en een elutie stap van 5 minuten bij 65 °C. Het Specific A protocol is ontwikkeld voor DNA rijke samples zoals feces. Hierbij is de hoeveelheid silica die gebruikt wordt 140 µl, de elutie stap duurt 10 minuten bij 70 °C en het elutievolume is vastgezet op 70 µl of 110 µl. Het Specific B protocol is speciaal ontwikkeld voor de extractie van volbloed. De input is maximaal 200 µl (EDTA) volbloed en het standaard elutie volume is 50 µl. Er wordt gebruik gemaakt van 140 µl silica en een afwijkend wasprotocol met langere wasstappen en een extra wasstap met wasbuffer 2. Op PAMM wordt het specific A protocol als standaard isolatieprotocol gebruikt.[24]
De EasyMAG is een betrouwbare extractie techniek, mede dankzij de eenvoudige en mechanisch bediende buffers. De EasyMAG bevat een detectie systeem, welke het vloeistof level in de buffers kan detecteren. Hierdoor wordt voorkomen dat er te weinig buffer aanwezig is. Ook bevat de EasyMAG een detectiesysteem om de hoeveelheid vloeistof in de vessels te meten, zodat er een melding afgegeven wordt als er te weinig vloeistof aanwezig is. Alle producten bevatten barcodes, waardoor deze gemakkelijk terug te herleiden zijn. Het contaminatierisico is minimaal door gebruik van wegwerpmaterialen en het gebruik maken van vacuüm. Er is geen cross-contaminatie, doordat de ‘dispense needles’ niet in contact komen met de patiëntenmaterialen.[25] Het apparaat zelf bestaat uit verschillende onderdelen. De belangrijkste zijn: de reagens module, filter deur, barcode reader, werk gedeelte, proces gedeelte, keyboard en touch-screen, aan-/uitschakelaar, elektronica compartiment en vloeistof compartiment (figuur 7).
De reagens module bevat de buffers die tijdens de extractie gebruikt zullen worden en het detectiesysteem om de hoeveelheid buffer in de flessen te meten. Alle buffer flessen bevatten een specifieke barcode en moeten geregistreerd worden. Een koolstof filter bevindt zich onder de reagens module. Er is tevens een barcode reader aanwezig, welke dient voor het registreren van het patiëntenmateriaal, de controles, de aspirator, de vessel en aspirator, en de reagentia. In het
werkgedeelte bevinden zich de vessel en aspirator, een lekbak en een gedeelte wat onder het apparaat uitgeschoven kan worden. In het proces gedeelte vindt de extractie plaats. Hier worden de buffers toegevoegd aan de patiëntenmaterialen, bevindt zich de magneet en bevindt zich het verwarmingselement. Het toetsenbord en touch-screen zijn verbonden met een computer. Hierop staat de software waarmee de juiste protocollen worden ingesteld en de patiëntenmaterialen ingevoerd worden.[24]
Figuur 7: Schematisch overzicht van de EasyMag, waarbij de belangrijkste onderdelen genummerd zijn.[25]
13
3.2.2 kPCR
Een andere methode voor de extractie van DNA is met behulp van de Versant kPCR®. De kPCR maakt gebruik van een DNA/RNA isolatie techniek gevolgd door een specifieke real-time PCR reactie waarin detectie van het target DNA plaatsvindt door middel van een probe. De kPCR bestaat uit twee systemen: het Versant kPCR moleculair systeem sample preparation (SP) en het Versant kPCR moleculair systeem amplification/detection (AD).
Het SP systeem is een geautomatiseerd systeem dat zorgt voor de sample preparatie, het isoleren en zuiveren van nucleïnezuren en daarnaast is het SP systeem in staat PCR reacties in te pipetteren in een 96-wells plaat. De nucleïnezuur isolatie is gebaseerd op de BOOM technologie (beschreven in paragraaf 3.2.1).
De isolatie neemt 2 tot 3 uur in beslag, afhankelijk van het aantal samples, en ondergaat verschillende stappen. Om te beginnen wordt er aan de samples een chaotropische bindingbuffer (GuSCN), proteinase K, magnetische silica en eventueel een interne controle toegevoegd. De cellen worden gelyseerd en er vindt binding plaats van de nucleïnezuren aan de magnetische silica. Vervolgens vinden er een aantal wasstappen plaats, waarna het DNA ge-elueerd wordt. Tenslotte worden de PCR reagentia uitgevuld in een 96-wells PCR plaat en wordt de benodigde hoeveelheid eluaat hieraan toegevoegd.[26] Het principe van het SP systeem is te zien in figuur 8.
Figuur 8: Schematische weergave van het principe van het SP systeem van de kPCR.
Na de nucleïnezuur isolatie vindt amplificatie plaats in het Versant kPCR moleculair systeem AD, wat ongeveer 1 uur en 45 minuten in beslag neemt. Het AD systeem is een real-time PCR apparaat, wat gedurende de amplificatie de fluorescente signalen van de probe meet en opslaat. Op PAMM wordt de kPCR toegepast voor de detectie van de volgende SOA veroorzakende bacteriën: Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae. Onderscheid tussen Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae en de interne controle wordt gemaakt door middel van verschillende labels aan de probes. De Chlamydia trachomatis probe bevat de labels: 5’FAM-3’BHQ, de Neisseria gonorrhoeae probe bevat: 5’Cy5-3’BHQ en de probe voor de interne controle bevat: 5’HEX-3’BHQ.[27] Theorie over de real-time PCR is te vinden in paragraaf 3.3.2.
14
3.3 Moleculaire biologie
3.3.1 Conventionele PCR
De PCR techniek wordt wereldwijd gebruikt in de moleculaire biologie. PCR is de afkorting van polymerase chain reaction (polymerase ketting reactie) en wordt gebruikt om een specifiek DNA fragment te amplificeren. Polymerase komt van het enzym DNA polymerase, dat gebruikt wordt om een DNA fragment te verdubbelen. Hierna worden elk van deze moleculen opnieuw gerepliceerd in een tweede cyclus van de replicatie, waaruit 4 keer het aantal originele moleculen komen. Dit wordt steeds herhaald tot een bepaald aantal cycli, de ‘chain reaction’. Wat tijdens de PCR gebeurt, is het natuurlijke proces van de DNA replicatie, maar dan een aantal keer zeer snel achter elkaar en voor een specifiek DNA fragment.
Een standaard PCR programma bestaat uit drie hoofdstappen. De eerste stap is de denaturatiefase. Hier wordt het dubbelstrengs DNA gesplitst tot enkelstrengs DNA, doordat de waterstofbruggen tussen de twee strengen verbroken worden. Gedurende de tweede stap, de aanhechtingsfase (annelingsfase), worden de primers gebonden aan het enkelstrengs DNA. Er zijn altijd twee primers nodig: één voor de 5’-streng (de forward primer) en één voor de 3’-streng (de reverse primer). De derde stap is de extensiefase. Tijdens deze fase wordt een complementaire DNA streng gevormd door het polymerase enzym, m.b.v. dNTPs.
3.3.2 Real-time PCR
Gedurende deze afstudeerstage wordt gewerkt met de real-time PCR. Met de real-time PCR kan de replicatie van het DNA al tijdens de reactie gedetecteerd worden m.b.v. fluorescentie. Dit is een snelle methode voor het opsporen van micro-organismen. De real-time PCR maakt gebruik van een forward primer, reverse primer en een probe. De probe is een enkelstrengs DNA fragment, wat complementair is aan het DNA van het target. De probe is specifiek voor het target en is gelabeld met een reporter molecuul en een quencher molecuul. De reporter bevindt zich aan de 5’ kant en de
quencher bevindt zich aan de 3’ kant van de probe. Zolang de probe intact is, bevinden deze moleculen zich dicht bij elkaar en onderdrukt de quencher het fluorescerende signaal van de reporter.[28][29]
Als de te detecteren sequentie aanwezig is, zal de probe tijdens de annealing stap hybridiseren op deze sequentie. Daarna binden de primers aan een specifieke sequentie aan weerszijden van de probe (figuur 9.A). De probe moet eerder binden dan de primers, omdat anders het amplificatie proces al start zonder de probe. Wanneer het DNA polymerase een nieuwe DNA streng gaat synthetiseren vanaf de 5’-kant, wordt de probe afgebroken door exo-nuclease activiteit van het DNA polymerase (figuur 9.B en 9.C). Hierdoor worden de reporter en quencher van elkaar gescheiden. Het fluorescerende signaal van de reporter wordt niet meer onderdrukt door de quencher en wordt meetbaar (figuur 9.D). Bij elke cyclus wordt het fluorescerende signaal, evenredig aan het aantal gevormde producten, sterker. De toename van het fluorescerende signaal is een maat voor de hoeveelheid PCR product wat geproduceerd wordt.[29]
15
3.3.3 Primers en probe
3.3.3.1 De ontwikkeling van de primers en probe
[28]De juiste ontwikkeling van primers en probe is de basis van een specifieke PCR reactie. Het is belangrijk dat de primers en probe aan een aantal voorwaarden voldoen. Wanneer de primers en probe aan deze voorwaarden voldoen zijn ze geschikt voor gebruik.
De voorwaarden voor de primers zijn: - Een lengte van 18-30 nucleotiden - Een GC gehalte van 40%-60%
- De smelttemperatuur (Tm) tussen 55 en 60 °C
- De sequentie van de primer moet zo dicht mogelijk bij de sequentie van de probe liggen - De primer en probe sequenties mogen niet overlappen
Naast de voorwaarden waaraan primers moeten voldoen, zijn er ook nog voorkeuren waar primers aan moeten voldoen. Deze voorkeuren zijn niet verplicht, maar het zorgt wel voor een betere kwaliteit van de primers. De voorkeuren waar primers aan moeten voldoen zijn:
- Het eindigen op een G, C, CG of GC, maar niet meer dan twee G en/of C’s in de laatste 5 nucleotiden - Binnen de primers zo min mogelijk complementaire sequenties, anders kunnen hairpins ontstaan - Tussen de forward en de reverse primer zo min mogelijk complementaire sequenties, anders kunnen
primer-dimeren ontstaan
- De forward primer en reverse primer moeten zo min mogelijk in Tm schelen, maximaal 4 °C Daarnaast zijn er ook nog voorwaarden waaraan een probe moet voldoen:
- Een lengte van 18-30 nucleotiden - Een GC gehalte van 30%-80%
- Tm van de probe moet 8 tot 10 °C hoger zijn dan de Tm van de primers - Gebruik de probe sequentie met meer C dan G
- Voorkom een G aan de 5’ kant
- Zo min mogelijk dezelfde nucleotiden achter elkaar
3.3.3.2 Primers en probe voor de determinatie van de Chlamydia trachomatis L-serotypen
Na uitgebreid literatuuronderzoek is gebleken dat het pmp-H gen een geschikt target is voor de determinatie van Chlamydia trachomatis serotypen. Het pmp-H gen is specifiek voor onderzoek naar LGV, omdat bij alle L-serotypen een gedeelte van de sequentie ontbreekt in vergelijking met de L-serotypen A-K.[4][31] Dit gedeelte komt alleen voor bij de L-serotypen en is een deletie van 36 nucleotiden, rood omcirkeld in figuur 10. Met behulp van Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) en Clustal W wordt onderzocht of de primer en probe sequenties specifiek zijn. Hiervoor zijn alle sequenties van de serotypen van Chlamydia trachomatis opgezocht in de databank van het National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Serotype L1 heeft Genbank nummer AY184167.1, serotype 2 heeft Genbank nummer AY184168.1 en serotype L3 heeft Genbank nummer AY184169.1. De sequenties zijn onder elkaar gezet met behulp van Clustal W en met elkaar vergeleken om de specificiteit van de primers en probe te controleren, zie bijlage I. Wanneer blijkt dat de primers en probe specifiek zijn voor alleen de L-serotypen, worden ze gecontroleerd met BLAST. Met BLAST worden de sequenties van de primers en probe vergeleken met de databank om theoretisch uit te sluiten dat er kruisreacties plaats kunnen vinden met andere micro-organismen. Een specificiteit panel, ingezet in de real-time LGV PCR, zal in de praktijk uitwijzen of er geen kruisreactie plaats kan vinden met andere micro-organismen.
16
Figuur 10: Sequenties van alle Chlamydia trachomatis serotypen. Het specifieke gedeelte van de L-serotypen is rood omcirkeld.
In het artikel van Verweij et al.[32] wordt beschreven dat het L2b serotype afwijkt van de overige L-serotypen. Het L2b serotype heeft een mutatie van één nucleotide in het gedeelte waar de probe op hecht. Deze mutatie bevindt zich op nucleotide 479 en is in L2b gemuteerd van een C naar een T. Om alle L-serotypen zo specifiek mogelijk te detecteren heeft de probe een wobble gekregen op de plek van mutatie, zodat beide nucleotiden aanwezig zijn. Deze wobble is opgenomen in de probe sequentie en is te zien in figuur 11.
Wobbles staan voor twee of meerdere nucleotiden die op dezelfde plek in een sequentie kunnen voorkomen. Wobbles worden aan primers en/of probes toegevoegd om zo een sequentie die verschillende nucleotiden op één plek kan bevatten, te herkennen. Bijvoorbeeld bij de L-serotypen: voor de detectie van alle L-serotypen zijn dezelfde primers en probe ontwikkeld, maar bij het L2b serotype wijkt één nucleotide af. Met behulp van de Y wobble worden op deze plek, tijdens de probe productie, in de ene helft van de probes op deze plaats een C nucleotide ingebouwd en in de andere helft een T nucleotide. Hierdoor worden alsnog alle L-serotypen herkent. Een overzicht van alle wobbles die kunnen voorkomen is weergegeven in tabel 2.
Tabel 2: Overzicht van alle mogelijk wobbles.
Wobble Coderend voor
R A, G W A, T M A, C Y C, T S C, G K G, T B C, T, G D A, G, T H A, C, T V A, C, G N A, C, T, G
Figuur 11: Sequentie van het product wat gevormd wordt na amplificatie. Roze is de forward primer, blauw is de reverse primer en grijs is de probe met daarin roodgedrukt de wobble.
17
3.3.3.3 Taqman probes
Het PCR product wordt gedetecteerd met een Taqman probe die sequentiespecifiek is. Taqman probes, ook bekend als Double-Dye Oligonucleotides, Double-Dye Probes of Dual-Labelled probes, zijn wereldwijd de meest gebruikt probes voor een real-time PCR. De probe is een enkel strengs sequentie die complementair is aan een deel van het te detecteren fragment. De probe bestaat uit een fluorescent label aan de 5’ kant en een quencher aan de 3’ kant. Het fluorescente label wordt door het PCR apparaat aangestraald met een bepaalde golflengte en de energie van het fluorescente label wordt vervolgens geabsorbeerd door de quencher.
De probe hecht op het te amplificeren DNA fragment tijdens de annealingsfase van de PCR, waardoor een dubbelstrengs fragment ontstaat. Vervolgens wordt het te amplificeren DNA fragment verlengd vanaf de forward primer met behulp van het Taq DNA polymerase. Hierdoor wordt de probe per nucleotide afgebroken vanaf de 5’ kant. Dit zorgt ervoor dat het fluorescente label en de quencher los van elkaar komen, waardoor de quencher het fluorescerende signaal niet meer kan onderdrukken. Er zal een onomkeerbare stijging in fluorescentie optreden, wat tijdens elke cyclus gemeten kan worden. Op deze manier is de DNA amplificatie in real-time te volgen.[28]
Tijdens dit onderzoek is een Taqman probe gebruikt met een FAM fluorescent label aan de 5’ kant en een minor groove binder (MGB) nonfluorescent quencher (NFQ) aan de 3’ kant.
FAM is de benaming van 6-carboxyfluorescein en is wereldwijd het meest gebruikte fluorescent label om oligonucleotiden mee te labelen. FAM reageert snel en is oplosbaar in water. Het absorptie maximum is 492 nm en het emissie maximum is 517 nm. FAM speelt een grote rol bij real-time PCR toepassingen, omdat het gebruikt wordt als fluorescente reporter.[33]
De MGB-NFQ quencher bestaat, zoals de naam al aanduidt, uit 2 delen: het MGB deel en het NFQ deel. Het MGB molecuul heeft als eigenschap dat het tussen het duplex DNA kan gaan zitten. Het MGB molecuul bindt namelijk aan de ‘minor groove’ van de DNA helix (zie figuur 12) en stabiliseert hierbij de annealing van de probe en het target. Hierdoor wordt de smelttemperatuur van de probe verhoogd, waardoor er kortere probes gebruikt kunnen worden. Een kortere probe zorgt
ervoor dat de invloed van de quencher op de reporter groter wordt. Het tweede gedeelte van de probe is de niet fluorescerende quencher. Deze quencher wordt ook wel ‘dark hole’ quencher genoemd, omdat het als eigenschap heeft het verschil in achtergrond fluorescentie verminderen. Een NFQ zendt zelf geen fluorescerend signaal uit, maar werkt als een energie transfer acceptor en vangt dus het fluorescerende signaal van de reporter weg. Deze opgevangen energie wordt omgezet in warmte of zichtbaar licht.[28]
Figuur 12: Schematische weergave van de binding van de MGB-NFQ quencher aan de minor groove van de DNA helix.
18
3.3.4 SYBR Green
Behalve een probe is het ook mogelijk om SYBR Green te gebruiken in een real-time PCR. SYBR Green detecteert PCR producten door te binden aan dubbelstrengs DNA wat tijdens de PCR gevormd wordt. Gebonden SYBR Green geeft een fluorescent signaal af. Dit proces vindt plaats via 4 stappen (figuur 13):
1. Wanneer de SYBR Green Master Mix toegevoegd wordt aan het sample, bindt de SYBR Green meteen aan alle dubbelstrengs DNA fragmenten.
2. Tijdens de PCR vindt een denaturatie stap plaats, wat ervoor zorgt dat alle DNA enkelstrengs wordt. De SYBR Green komt tijdens deze stap weer vrij in de oplossing en straalt geen fluorescent signaal uit. 3. Tijdens de extensiefase wordt er PCR
product gevormd.
4. SYBR Green bindt aan alle dubbelstrengs DNA fragmenten en zorgt voor een toename van fluorescentie, wat door het apparaat gedetecteerd wordt.[34][35]
Nadelen van SYBR Green ten opzichte van het gebruik van probes zijn: 1) SYBR Green is minder specifiek; 2) het is niet geschikt voor een multiplex PCR. Een voordeel van SYBR Green is dat het goedkoper is dan het gebruik van probes. SYBR Green wordt vaak gebruikt voor het optimaliseren van de primer concentratie in de real-time PCR.
SYBR Green bindt alle dubbelstrengs DNA fragmenten waardoor het belangrijk is om te controleren of er non-specifiek product is gevormd. Om dit te controleren wordt er op het einde van de PCR run een smeltcurve uitgevoerd. Het principe is dat elk product een andere smelttemperatuur (de temperatuur waarbij 50% van het DNA fragment enkelstrengs is geworden) heeft en daardoor dus onderscheiden kan worden.
3.3.5 Interpretatie van de resultaten
De PCR reactie vindt plaats met behulp van de ABI PRISM 7500 FAST Real-Time PCR System. Hiervoor wordt de PCR mix en het DNA in een 96-wells plaat gepipetteerd. Tijdens de reactie van de PCR kunnen meerdere targets gedetecteerd worden door middel van fluorescentiesignalen. De fluorescentie wordt gemeten en uitgezet in een curve met op de x-as het aantal cycli en op de y-as de ΔRn. De Rn waarde is de emissie intensiteit van de reporter gedeeld door de emissie intensiteit van de passieve referentie (ROX). ROX is een fluorescent label wat niet deel neemt aan de reactie, maar zorgt voor het normaliseren van de fluorescentie van de reporter. De Rn bestaat uit Rn+ en Rn-. De Rn+ is de Rn waarde die gemeten wordt na elke cyclus in de PCR reactie en de Rn- is de waarde die gemeten wordt in de 1e cyclus van de PCR reactie (hier worden nog geen signalen gedetecteerd). De ΔRn is de Rn+ - Rn-. De ΔRn geeft kort gezegd de sterkte van het fluorescente signaal weer.[28][35]
Figuur 14 geeft een schematisch overzicht weer van een amplificatiecurve. Hierin is te zien dat bij de eerste 15 cycli geen signaal is gedetecteerd, wat de baseline wordt genoemd. Aan de hand van deze baseline kan de threshold waarde bepaald worden. De threshold is de mate van fluorescentie waarbij het signaal niet meer tot de achtergrond behoord, maar tot detecteerbaar DNA wordt gerekend. De threshold kan automatisch berekend worden door de software van het real-time PCR systeem zelf of handmatig ingesteld worden. Wanneer de threshold wordt verschoven bij verschillende reacties, zullen ook de Ct waarden verschuiven. Bij PAMM wordt de threshold handmatig ingesteld op 0.1, zodat de Ct waarden niet automatische verschuiven. Dit is belangrijk bij het controleren van de werking van een test, omdat de Ct waarden van de controles in een vooraf bepaalde range moeten vallen.
19 Het belangrijkste resultaat is de ‘Cycle
threshold’ (Ct). Dit is het cyclus nummer waarbij het fluorescente signaal (ΔRn) boven de threshold uitkomt, dus wanneer voor het eerst detecteerbare hoeveelheden geamplificeerd DNA waargenomen worden. De Ct waarde hangt van de threshold waarde af en geeft de sensitiviteit van de assay weer. Als de Ct waarde laag is, wat betekent dat de fluorescentie de threshold na een paar cycli al passeert, dan is de hoeveelheid DNA in het sample hoog.[28]
Het is belangrijk dat de detectie met een zo hoog mogelijke efficiëntie plaatsvindt. De detectie van een 10 keer verdunning hoort in theorie met een Ct waarde van 3.3 te stijgen (100% efficiëntie). Om de efficiëntie te bepalen wordt gebruik gemaakt van een standaardcurve met op de x-as de DNA verdunning en op de y-as de Ct waarden. Vervolgens wordt de volgende formule gebruikt: Efficiëntie = 10(−1/ℎ𝑒𝑙𝑙𝑖𝑛𝑔 )-1. Een assay is efficiënt
wanneer de berekende efficiëntie tussen 90% en 110% zit, dit is bij een helling tussen 3.1 en 3.58.[28] Wanneer er gebruik gemaakt wordt van
SYBR Green in plaats van een probe, vindt determinatie niet alleen plaats door middel van een amplificatie curve maar tevens met behulp van een smeltcurve. Detectie van het juiste DNA fragment vindt plaats door bepaling van de smelttemperatuur en deze te vergelijken met referentiewaarden. Een voorbeeld is weergegeven in figuur 15. Hierbij is de smelttemperatuur van het te detecteren DNA fragment 85 °C. Er zijn 3 mogelijke resultaten weergegeven: een piek bij 85 °C, wat het juiste DNA fragment weergeeft; een piek tussen 70°C en 75°C, wat een aspecifiek DNA fragment voorstelt; en geen piek, wat wil zeggen dat er geen amplificatie heeft plaatsgevonden.[34]
Figuur 14: Schematische weergave van de amplificatie curve van de real-time PCR.[36]
Figuur 15: Overzicht van 3 verschillende resultaten die kunnen optreden als resultaat van de smeltcurve.[34]
20
3.4 Validatie
Voor een PCR protocol daadwerkelijk in verschillende laboratoria gebruikt kan worden, zal deze eerst gevalideerd moeten worden. Validatie is het aantonen dat een methode op de juiste wijze werkzaam is en dat het aan alle eisen voldoet.
Bij validatie wordt er op 3 onderdelen onderzocht: sensitiviteit, specificiteit en reproduceerbaarheid. Onder sensitiviteit wordt de gevoeligheid van de techniek verstaan. Hierbij wordt bijvoorbeeld de detectiegrens bepaald door middel van een verdunningsreeks, waarbij gekeken wordt bij welke concentratie de techniek het meest gevoelig is en tot welke concentratie het DNA gedetecteerd kan worden. Specificiteit wil zeggen hoe specifiek de techniek is. In dit onderzoek wordt onderzocht of de Chlamydia trachomatis LGV PCR specifiek is voor LGV en geen kruisreactie geeft met andere bacteriestammen. Hiervoor wordt een specificiteitspanel gebruikt met o.a. bacteriën die voorkomen als normale flora, urogenitale pathogenen en Chlamydia trachomatis LGV verwante bacteriën. De PCR zou alleen specifiek moeten zijn voor de Chlamydia trachomatis L-serotypen (L1, L2, L3) en dus alleen bij deze L-serotypen een positief resultaat moeten opleveren. Met de reproduceerbaarheid wordt bedoeld of de techniek onder alle omstandigheden hetzelfde resultaat oplevert. Er zijn twee onderdelen van reproduceerbaar, namelijk intra- en reproduceerbaar. Bij inter-reproduceerbaarheid zal gekeken worden of andere personen dezelfde uitslag krijgen en of er na een dag, een maand of bijvoorbeeld een week ook hetzelfde resultaat uitkomt. Intra-reproduceerbaar houdt in dat de resultaten binnen de run met elkaar overeenkomen. Dus wanneer er 3 runs worden uitgevoerd met dezelfde samples, zouden alle 3 de runs dezelfde resultaten moeten geven. Precies hetzelfde resultaat komt (vrijwel) nooit voor, maar de afwijkingen tussen deze runs horen minimaal te zijn.
Wanneer de validatie is uitgevoerd vindt er tenslotte ook een klinische evaluatie plaats. Tijdens de klinische evaluatie worden patiëntenmaterialen onderzocht op de aanwezigheid van LGV. Patiëntenmaterialen bevatten storende factoren, waardoor meteen wordt nagegaan of dit van invloed is tijdens de DNA isolatie en de real-time PCR. Met behulp van de klinische evaluatie wordt als het ware onderzocht of de LGV PCR ‘werkt’.
21
4. Materialen en methoden
Voor de detectie van Chlamydia trachomatis L-serotypen is een LGV real-time PCR opgezet. Dit hoofdstuk beschrijft de benodigde materialen en methoden die zijn toegepast om de LGV PCR op te zetten.
4.1 Benodigdheden
De materialen die gebruikt zijn tijdens de afstudeeropdracht, zijn:
Primers en probe
Er is een uitgebreide literatuurstudie gedaan, waaruit is gebleken dat het Chlamydia trachomatis pmp-H gen het meest geschikt is als target voor de detectie van de L-serotypen. Dit gen bevat namelijk voor alleen de L-serotypen een deletie van 36 nucleotiden, wat het zeer specifiek maakt. Na amplificatie ontstaat een DNA product van 62 basenparen. De primers en probe zijn weergegeven in tabel 3.
Tabel 3: De primers en probe die gebruikt zijn tijdens de PCR met de bijbehorende sequenties en posities in het pmp-H gen.
Naam Sequentie Positie
LGV forward primer 5’-CTGTGCCAACCTCATCATCAA-3’ 377-397
LGV reverse primer 5’-AGTGATGCTCGGAAAGGGTCT-3’ 418-438
LGV probe 5’-CYTGCTCCAACAGT-3’ 403-416
NucliSens EasyMAG
De EasyMAG wordt gebruikt voor nucleïnezuur extractie. De EasyMAG maakt gebruik van magnetische silica om het DNA te isoleren en er kunnen 24 samples binnen één uur geïsoleerd worden. Binnen PAMM wordt, daar waar mogelijk, gewerkt met het Specific A protocol.
Versant kPCR
De kPCR wordt gebruikt voor SOA en HCV onderzoek. Met de kPCR worden patiëntenmaterialen getest op Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae. Tijdens dit afstudeeronderzoek wordt de kPCR alleen gebruikt voor DNA extractie en de detectie van Chlamydia trachomatis.
ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System
Om een PCR uit te voeren, wordt gebruik gemaakt van de ABI PRISM 7500 Fast real-time PCR system. Er kunnen per PCR run 96 samples geamplificeerd en gemeten worden. Het analyseren van de resultaten gebeurd met de 7500 Software v2.0.5.
LGV positief materiaal
- Positief DNA. Een extern laboratorium heeft LGV positief DNA opgestuurd, wat gebruikt is tijdens het onderzoek. Het LGV positieve DNA betreft L2a DNA en L2b DNA. Het L2a DNA is een zuivere Chlamydia stam met een concentratie van 20 IFU/µl. Het L2b DNA is geïsoleerd patiëntenmateriaal.
- LGV stam. PAMM beschikt zelf ook over twee LGV stammen: LGV1994 en LGV1999. Deze stammen zijn opnieuw in cellijnen gebracht en zo opgekweekt.
Patiëntenmaterialen
