Eindverslag
Afstudeerstage TNO Defensie en Veiligheid, afdeling CBRN Protection.
Auteur: Maud Sangers
mnj.sangers@student.avans.nl Opleiding: Forensisch Laboratorium Onderzoek
Instelling: Avans Hogeschool Breda
Academie voor Technologie, Gezondheid en Milieu Lovensdijkstraat 61-63
4818 AJ Breda Tel. 076-5250500 Stagedocent Avans: Henk Haarman
hf.haarman@avans.nl
Begeleiders: Daan Noort
daan.noort@tno.nl Alex Fidder
alex.fidder@tno.nl
Opdrachtgever: Daan Noort
Locatie: Lange Kleiweg 137
2280 AA Rijswijk
Periode: 11-02-2013 t/m 28-06-2013
Versie: 1
Pagina | I
Voorwoord
Dit eindverslag is een verslaglegging van het onderzoek waar ik de afgelopen 20 weken bij TNO Defensie en Veiligheid mee bezig ben geweest en waar ik mijn studie Forensisch Laboratorium Onderzoek mee afsluit.
Ondanks dat dit een zelfstandig project was heb ik het uiteraard niet alleen gedaan. Daarom wil ik allereerst en in het bijzonder mijn begeleiders van TNO bedanken. Mijn procesbegeleider en opdrachtgever, Daan Noort, voor zijn onverminderde persoonlijke interesse in de voortgang van mijn project en zijn altijd kritische blik op de behaalde resultaten en geschreven verslagen. Mijn praktijkbegeleider, Alex Fidder, voor zijn hulp met de toegepaste technieken/methoden, zijn enthousiasme, maar bovenal voor zijn kennis over het project die hij maar al te graag met mij wilde delen. De feedback van Alex heeft meer dan eens tot inzichten geleid die enorm hebben bijgedragen aan het behalen van mijn doelstelling. Marcel Alblas, Lai Fun Chau en Marcel van der Schans wil ik graag bedanken voor het delen van hun uitgebreide kennis over bepaalde technieken en voor het helpen bij het toepassen hiervan. Ook wil ik graag Debora van der Riet en Albert Hulst bedanken voor het analyseren van mijn monsters en het toelichten van de resultaten. Ik ben daar meerdere malen op bezoek geweest met vele vragen die zij in alle rust beantwoorden. Daarnaast wil ik mijn docentbegeleider Henk Haarman bedanken voor de ondersteuning die hij vanuit school heeft geboden.
Als laatste maar zeker niet als minste wil ik al mijn collega’s bij TNO bedanken voor de leuke en leerzame tijd die ik hier heb gehad. In het bijzonder wil ik graag mijn medestudent en collega bij TNO, Jaitske, bedanken. Ik heb veel feedback, input en steun van haar mogen ontvangen tijdens mijn afstuderen. De discussies die we hadden leken soms eindeloos maar waren meer dan eens nuttig en inspirerend.
Maud Sangers Rijswijk, 7 juni 2013.
Pagina | II
Samenvatting
Het doel van het onderzoek is het ontwikkelen van een isolatiemethode waarmee Butyrylcholinesterase (met of zonder zenuwgasadduct) uit humaan plasma kan worden geïsoleerd in een zo schoon mogelijke matrix. De nieuwe isolatiemethode moet een matrix opleveren die niet stoort bij de massaspectrometrische bepaling, waardoor een zo laag mogelijke blootstelling aan een zenuwgas kan worden aangetoond. Daarnaast moet de nieuwe isolatiemethode snel, efficiënt, reproduceerbaar en gemakkelijk toepasbaar zijn.
Er werden 2 methoden gebruikt voor het isoleren van (Sarin-geremd) Butyrylcholinesterase uit humaan plasma: de basismethode (ontwikkeld door TNO) en een nieuwe methode, Immuno-Magnetic Separation (IMS, ontwikkeld door een ander lab met hulp van TNO). Bij de basismethode werd (geremd) Butyrylcholinesterase geïsoleerd met behulp van procainamide affiniteitsgel, hierna geconcentreerd met 100kD filters en uiteindelijk gedigesteerd met pepsine onder zure omstandigheden tot het nonapeptide, FGESAGAAS, met adduct (IMPA). Tijdens het onderzoek werd de basismethode geoptimaliseerd door het percentage mierenzuur bij de pepsine digestie te variëren van 5% tot 0,3%. Daarnaast werd de incubatietijd van het monster met pepsine gevarieerd van 2 tot 6 uur. Na de isolatie werden de monsters geanalyseerd met Liquid Chromatography- Triple Stage Quadrupole- Tandem Mass Spectrometry (LC-TSQ-MS/MS). Bij de IMS-methode werden magnetic beads gecoat met monoclonale antilichamen tegen Butyrylcholinesterase. Na de isolatie werd het aan de beads gebonden enzym gedigesteerd met pepsine en gefiltreerd met 10kD filters. De isolaten werden geanalyseerd met LC-TSQ-MS/MS of Liquid Chromatography- Quadrupole Time-Of-Flight- Tandem Mass Spectrometry (LC-QTOF-MS/MS).
Uit de resultaten bleek dat na het aanpassen van het percentage mierenzuur in de basismethode de matrix waarin het gedigesteerde FGESAGAAS-IMPA zich bevindt zuiverder wordt naarmate het percentage afneemt. De stoorpiek die te zien is na de LC-TSQ-MS/MS analyse neemt af naarmate het percentage mierenzuur wordt verlaagd en is het laagst bij 0,6% mierenzuur. Daarnaast neemt de FGESAGAAS-IMPA opbrengst toe naarmate de incubatietijd in de basismethode wordt verlengd (tot maximaal 4 uur). Ondanks alle aanpassingen is de matrix niet zuiver genoeg om FGESAGAAS-IMPA aan te kunnen tonen met de LC-QTOF-MS/MS.
Wanneer de IMS-methode gebruikt wordt om gefosfonyleerd Butyrylcholinesterase uit plasma te isoleren wordt er een schonere matrix verkregen. De matrix is zo schoon waardoor het mogelijk is om met de LC-TSQ-MS/MS een remming aan te tonen tot 1%. Daarnaast is het mogelijk om in de isolaten van de IMS-methode een 100% tot 50% remming aan te tonen met de LC-QTOF-MS/MS analyse. Behalve dat de IMS-methode zo specifiek is, is deze methode ook snel en gemakkelijk uit te voeren. De methode is gedeeltelijk (of helemaal) te automatiseren. Het nadeel aan de methode zijn de kosten van de materialen, er is getracht de gecoate beads te regenereren maar dit is niet gelukt. Uiteindelijk is geconcludeerd dat de IMS-methode een schikte methode is om Butyrylcholinesterase met (zenuwgas)adduct uit plasma te isoleren waardoor het mogelijk is om een laag remmingspercentage (1%) aan te tonen met de LC-TSQ-MS/MS.
Na het uitvoeren van het onderzoek zijn een aantal aanbevelingen gedaan. Zo zal de IMS-methode herhaalt moeten worden met plasma blootgesteld aan andere organofosfaten. Bovendien zal de methode nog gevalideerd moeten worden aangezien in het onderzoek alleen aandacht is besteed aan research en optimalisatie. Daarnaast zou er nog naar een andere isolatiemethode gekeken kunnen worden, zoals de methode met Huprine-19 affiniteitsgel. Bovendien kan de IMS-methode verder geoptimaliseerd worden door meer onderzoek te doen naar het regenereren van de gecoate beads en naar het besparen van materialen tijdens het experiment door de hoeveelheid beads en antilichamen te optimaliseren (omdat deze duur zijn bij de IMS-methode).
Pagina | III
Inhoudsopgave
Voorwoord ... I Samenvatting ... II Afkortingenlijst ... V 1 Inleiding ... 1 2 Theoretische achtergrond ... 2 2.1 TNO ... 2 2.2 Chemische wapens ... 3 2.3 Zenuwgassen ... 42.4 Werking van zenuwgassen ... 7
2.5 Verificatie van blootstelling aan zenuwgassen ... 9
3 Materialen & Methoden ... 13
3.1 Basismethode isolatie BuChE uit humaan plasma ... 13
3.2 Optimalisatie basismethode ... 13 3.3 Isolatiemethoden vergelijken ... 14 3.4 Immuno-Magnetic Separation ... 16 4 Resultaten ... 19 4.1 Optimalisatie basismethode ... 19 4.2 Isolatiemethoden vergelijken ... 21 4.3 Immuno-Magnetic Separation ... 22
4.4 Basismethode versus IMS ... 25
5 Discussie ... 26
5.1 Optimalisatie basismethode ... 26
5.2 Immuno-Magnetic Separation ... 27
5.3 Basismethode versus IMS ... 28
6 Eindconclusie ... 30
7 Aanbevelingen ... 31
Literatuurlijst ... 32
Bijlagen ... 34
Bijlage I Organogram TNO ... 35
Bijlage II Chemische eigenschappen Sarin, Soman en VX ... 36
Bijlage III Materialenlijst ... 37
Pagina | IV
Bijlage V Chromatogram LC-QTOF-MS/MS basismethode ... 40
Bijlage VI Resultaat invloed verschillende percentages mierenzuur ... 41
Bijlage VII Resultaat eiwitbepaling... 42
Bijlage VIII Resultaat eerste uitvoering IMS-methode ... 43
Bijlage IX Waarden bindingscapaciteitstest... 44
Pagina | V
Afkortingenlijst
AChE Acetylcholinesterase
AMPA’s Alkyl methylphosphonic acids (alkyl methylfosfonzuren) BuChE Butyrylcholinesterase
BuSChI Butyrylthiocholine iodide
CBRN Chemisch, Biologisch, Radiologisch en Nucleair CWA Chemical Warfare Agent (chemisch wapen)
CZS Centraal ZenuwStelsel
DTNB Dithiobisnitrobenzoaat
EMPA Ethyl methylphosphonic acid (ethyl methylfosfonzuur)
GA Tabun
GB Sarin
GD Soman
GF Cyclohexyl Sarin
IMPA IsoPropyl methylphosphonic acid (isopropyl methylfosfonzuur)
IMS Immuno-Magnetic Separation
LC-MS/MS Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry
LC-QTOF-MS/MS Liquid Chromatography- Quadrupole Time-Of-Flight- Tandem Mass Spectrometry LC-TSQ-MS/MS Liquid Chromatography- Triple Stage Quadrupole- Tandem Mass Spectrometry MPA Methylphosphonic acid (methylfosfonzuur)
OP Organophosphate (organofosfaat)
OPCW Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese)
SIM Single Ion Monitoring
SRM Single Reaction Monitoring
Pagina | 1
1 Inleiding
Een van de bedreigingen in deze tijd is de mogelijkheid van het gebruik van chemische wapens door strijdmachten of terroristische groeperingen. Onder deze wapens vormen de neurotoxische middelen, beter bekend als zenuwgassen, de grootste bedreiging vanwege hun zeer schadelijke effect op de mens. De constante dreiging van aanvallen met chemische wapens geeft een sterke reden om grondig onderzoek te doen naar chemische wapens. TNO is één van de organisaties in de wereld die zich bezig houdt met het onderzoek naar chemische wapens. Binnen TNO wordt onder andere onderzoek gedaan naar drie verschillende zenuwgassen: Sarin, Soman en VX. Zenuwgassen zijn organofosfaten die binden aan enzymen die werkzaam zijn in het centrale zenuwstelsel. Deze binding van het zenuwgas zorgt ervoor dat het enzym, Acetylcholinesterase, zijn werking niet kan doen. Dit kan schadelijke effecten geven en zelfs de dood tot gevolg hebben. Naast Acetylcholinesterase hechten zenuwgassen zich ook aan het enzym Butyrylcholinesterase. Vanaf 2001 is er binnen TNO Defensie en Veiligheid een methode ontwikkeld waarmee de blootstelling aan een zenuwgas in het menselijk lichaam kan worden aangetoond. Butyrylcholinesterase dient hierbij als biomarker. Het door zenuwgas geremde enzym wordt geïsoleerd door middel van affiniteitschromatografie met een procainamide kolom. Na het isoleren wordt het geremde Butyrylcholinesterase enzymatisch geknipt met pepsine tot peptiden. Van alle verkregen peptiden is de peptide waar de binding met een organofosfaat heeft plaatsgevonden het gewenste product. Deze peptide is negen aminozuren lang (nonapeptide) en heeft een sequentie van FGESAGAAS. Het mengsel van peptiden kan met behulp van de Liquid Chromatograpy- Tandem Mass spectrometry (LC-MS/MS) geanalyseerd worden.
Het doel van het onderzoek is het ontwikkelen van een methode waarmee Butyrylcholinesterase met (zenuwgas)adduct uit humaan plasma kan worden geïsoleerd in een zo schoon mogelijk matrix voor massaspectrometrische analyse. De “nieuwe” isolatiemethode moet een matrix opleveren die niet stoort bij de Liquid Chromatography-Triple Stage Quadrupole- Tandem Mass Spectrometry (LC-TSQ-MS/MS) en bij de Liquid Chromatography- Quadrupole Time-Of-Flight- Tandem Mass spectrometry (LC-QTOF-MS/MS) analyse, waardoor een zo laag mogelijke blootstelling aan een zenuwgas kan worden aangetoond. Daarnaast moet de nieuwe isolatiemethode ook snel, efficiënt, reproduceerbaar en gemakkelijk toepasbaar zijn.
Het doel komt voort uit een probleem dat is opgetreden na het vervangen van een analyseapparaat. De in 2001 ontwikkelde methode heeft altijd voldaan. Echter is de “oude” LC-MS/MS eind 2012 vervangen door een nieuwer en geavanceerder model, Liquid Chromatography- Quadrupole Time-Of-Flight- Mass spectrometry (LC-QTOF-MS/MS). Door een andere manier van meten is de momenteel aangeboden matrix niet schoon genoeg om het te analyseren nonapeptide te kunnen meten. De matrix stoort te veel bij de analyse met de nieuwe LC-QTOF-MS/MS. Daarnaast is de matrix ook niet schoon genoeg om een laag remmingspercentage (plasma geremd met zenuwgas) aan te kunnen tonen bij de analyse met de LC-TSQ-MS/MS. De opwerkingsmethode (isolatiemethode) van het te analyseren nonapeptide is dus een zeer belangrijke factor in dit onderzoek.
Het eindverslag bestaat uit zeven hoofdstukken, de literatuurlijst en de bijlagen. In hoofdstuk 2 wordt de achtergrondinformatie benodigd voor het onderzoek beschreven. In hoofdstuk 3 staat de aanpak van het onderzoek beschreven. In dit hoofdstuk worden de materialen, methoden en technieken die gebruikt zijn om de doelstelling te behalen, toegelicht. In hoofdstuk 4 worden de resultaten van het onderzoek weergegeven en toegelicht. In hoofdstuk 5, discussie, worden de resultaten bediscussieerd. In hoofdstuk 6 staat de eindconclusie en uiteindelijk wordt in hoofdstuk 7 aanbevelingen gegeven richting TNO voor verder onderzoek. Na de aanbevelingen volgt de literatuurlijst en tot slot de bijlagen van het onderzoek.
Pagina | 2
2 Theoretische achtergrond
2.1 TNO
In 1932 werd de ‘Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek’ (TNO) opgericht op basis van een speciale wet, de TNO-wet, die in 1930 was aangenomen. TNO is een onafhankelijke onderzoeksorganisatie die op basis van haar expertise en onderzoek een belangrijke bijdrage levert aan de concurrentiekracht van bedrijven en organisaties, aan de economie en aan de kwaliteit van de samenleving als geheel. TNO werkt voor uiteenlopende opdrachtgevers: het MKB, grote bedrijven, dienstverleners, maatschappelijke organisaties en overheden. De overheid is misschien wel de grootste en belangrijkste opdrachtgever van TNO. In de TNO-wet wordt de relatie van TNO met de overheid geregeld. Het komt er globaal op neer dat TNO een onafhankelijke onderzoeksorganisatie is die op ‘armlengte’ van de overheid opereert. Diezelfde wet beschrijft ook de speciale relatie tussen TNO en het Ministerie van Defensie. Vrijwel al het defensie gericht wetenschappelijk onderzoek wordt buiten het Ministerie gedaan en voor een groot deel bij TNO[1].
2.1.1 Organisatie
Aan de top van de TNO organisatie staat de Raad van Bestuur, die belast is met het besturen van de organisatie. De Raad van Bestuur wordt gecontroleerd door de Raad van Toezicht en specifiek voor het defensieonderzoek door de Raad van Defensie onderzoek[1, 2].
TNO heeft in totaal ±3900 medewerkers die werkzaam zijn binnen zeven thema’s en drie expertisegebieden[1, 2]. De zeven thema’s zijn: “Healty Living”, “Industrial Innovation”, “Defence, Safety and Security”, “Energy”, “Mobility”, “Built Environment” en “Information Society”. De thema’s houden zich vooral bezig met het netwerken bij de bestaande en/of nieuwe klanten en het binnenhalen van projecten. De drie expertisegebieden zijn: “Technical Sciences”, “Behavior and Societal Science”, “Earth, Environmental and Life Sciences”. De drie expertisegebieden houden zich bezig met het uitvoeren van projecten, het in stand houden van kennis, de ontwikkeling van medewerkers en het up-to-date houden van apparatuur[3].
De afdeling waarbinnen de opdracht is uitgevoerd, “CBRN Protection”, valt onder het expertisegebied “Earth, Environmental and Life Sciences” en werkt voornamelijk voor het thema “Defence, Safety and Security”[1]. In bijlage I, organogram TNO, staat de TNO organisatie in een schema weergegeven.
2.1.2 CBRN Protection
CBRN incidenten zijn gebeurtenissen, waarbij per ongeluk of opzettelijk Chemische, Biologische, Radiologische of Nucleaire agentia vrijkomen. Incidenten met CBRN agentia zijn een potentiële dreiging voor militairen, hulpdiensten en voor de samenleving in het algemeen. De kans dat een CBRN incident plaatsvindt is klein, maar de impact hiervan in termen van fysieke schade en sociale effecten op lange termijn wordt bijzonder hoog geacht[2].
De afdeling “CBRN Protection”, gesitueerd in het Prins Maurits gebouw in Rijswijk, heeft ongeveer 50 medewerkers die zich richten op het ontwikkelen van een geheel aan inzicht, technologie en methoden voor het verbeteren van CBRN-bescherming in brede zin[1, 2]. De afdeling beschikt over een hoog-tox lab voor chemische strijdmiddelen, analytische en organische labs, isotopenlabs, BSL (biosafety level) labs en relevante diermodellen.
Pagina | 3 “CBRN Protection” heeft vele opdrachtgevers. Het Nederlandse Ministerie van Defensie is de primaire klant van “CBRN Protection”. Tevens dragen ze bij aan het verbeteren van de medische bescherming tegen toxische stoffen in opdracht van de Amerikaanse overheid[2]. Bovendien is TNO aangewezen als “designated laboratory” voor de Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons (OPCW), wat de sterke positie van TNO voor de analytische chemie weergeeft[4].
De kennis en het werkveld waarbinnen CBRN Protection opereert is zeer breed. Binnen de afdeling zijn vijf werkvelden en vele kennisgebieden. De uitgevoerde opdracht valt binnen het werkveld “Diagnose en Therapie” en heeft raakvlakken met het kennisgebied: “Ontwikkeling en evaluatie van systemen en methoden voor de detectie, bemonstering, identificatie en diagnose van chemische agentia en gerelateerde componenten”.
2.2 Chemische wapens
Een van de aspecten die onderzocht worden op de afdeling “CBRN Protection” zijn chemische wapens. Een zeer toxische chemische stof bedoeld om tegenstanders in de oorlogsvoering te verwonden, te doden, uit te schakelen of te beheersen wordt een chemisch wapen (Chemical Warfare Agent, CWA) genoemd[5].
2.2.1 Historie
Sinds het begin van de geschiedenis worden er al chemicaliën gebruikt in de oorlogsvoering. Het begon met onwelriekende stoffen, irriterende stoffen, giftige planten en dieren, maar ook rottende lichamen. Sinds de geboorte van de chemie worden toxische chemicaliën speciaal gemaakt voor de oorlog. Moderne CWA’s werden voor het eerst tijdens de Eerste Wereldoorlog op grote schaal gebruikt[6]. Sindsdien is er een verscheidenheid aan CWA’s ontwikkeld en ingezet in vele oorlogen, conflicten, terreuraanslagen, gijzelingen en rellen[5].
Uiteindelijk, in 1993, kwamen een groot aantal landen bij elkaar om het Verdrag Chemische Wapens (Chemical Weapons Convention) te tekenen. Dit verdrag verbood de ontwikkeling, productie, werving, de opslag, overdracht of het gebruik van chemische wapens. Daarnaast eiste het de vernietiging van alle bestaande voorraden[6, 7]. Niet alle landen hebben het Verdrag Chemische Wapens getekend. Tot op de dag van vandaag zijn er nog zes staten die het verdrag niet ondertekend hebben: Angola, Egypte, Noord-Korea, Somalië, Zuid-Soedan en Syrië[7]. Daarnaast zijn er nog twee staten die het verdrag wel hebben getekend, maar nog niet hebben geratificeerd (bekrachtigd): Israël en Myanmar.
Daarnaast is er nog de geschiedenis van het gebruik van chemische wapens bij terrorisme. De eerste chemische terroristische aanslag (op grote schaal) vond plaats in de Verenigde Staten in 1982. Er stierven zeven jonge mensen nadat ze een dodelijke concentratie cyanide hadden binnengekregen via paracetamol capsules. De meest bekende chemische terroristische aanslag vond in 1995 plaats in het metrosysteem van Tokyo, Japan. Leden van een sekte vergiftigden mensen met een dodelijke dosis van Sarin (een zenuwgas). Hoewel het gebruik van chemische strijdmiddelen in terroristische activiteiten lijkt te zijn beperkt, kan dit geen garantie gegeven voor het mogelijke gebruik in de toekomst[6].
2.2.2 Categorieën en effecten
Hierboven staan al een aantal chemische wapens genoemd, zoals Cyanide en Sarin. Naast deze twee toxische stoffen zijn er nog tientallen soorten die als chemisch strijdmiddel gebruikt worden. Al deze stoffen kunnen ingedeeld worden in drie categorieën: irritantia, incapacitantia en letale middelen[8]. Irritantia zijn chemische stoffen die een prikkelende werking uitoefenen op ogen, ademhalingswegen en/of de huid[8, 9]. De intentie van een irritantia is niet het doden of verwonden van de vijand, daarvoor ligt de werkzame dosis van de stoffen te ver onder de dodelijke dosis.
Pagina | 4 Incapacitantia zijn middelen die de tegenstander tijdelijk kan uitschakelen zonder (of met een beperkte kans) blijvend letsel te veroorzaken[8]. Incapacitantia kunnen verder ingedeeld worden in stoffen met een fysieke of een psychische werking. Stoffen met een fysieke werking reageren met het centrale zenuwstelsel en kunnen een tijdelijk verminderd bewustzijn, desoriëntatie, blindheid of verlamming veroorzaken. Incapacitantia met een psychische werking zijn stoffen die hallucinaties en acute verwardheid (delirium) veroorzaken.
Letale middelen zijn bedoeld om te doden of ernstige schade toe te brengen. Letale middelen kunnen onderverdeeld worden in verstikkende middelen, blaartrekkende middelen, bloedvergiftigende middelen en zenuwgassen[8, 9]. Verstikkende middelen veroorzaken hoofdpijn, hoest, verstikking en in het ergste geval vochtopeenhoping in de longen dat tot de dood kan leiden. Blaartrekkende middelen veroorzaken huidbeschadiging zoals brandwonden en blaren en in het ergste geval vochtopeenhoping in de longen. Bloedvergiftigende middelen veroorzaken een zuurstof tekort in het lichaam wat uiteindelijk kan leiden tot braken, spiertrekkingen, ademhalingsproblemen en de dood. Als laatste zijn er nog de zenuwgassen. De juiste terminologie is eigenlijk niet zenuwgassen maar “zenuw agentia”, doordat ze eigenlijk geen gassen zijn maar vloeistoffen gedispergeerd als fijne aërosolen[9]. In de volksmond worden “zenuw agentia” zenuwgassen genoemd, daarom zal deze term ook in dit eindverslag worden gebruikt. Zenuwgassen zijn middelen die de overdracht van zenuwprikkels in het centrale zenuwstelsel (CZS) verstoren.
2.3 Zenuwgassen
Zoals eerder vermeld, zijn zenuwgassen chemische wapens die tot de categorie letale middelen behoren. Vele zenuwgassen zijn ontdekt tijdens het ontwikkelen en verbeteren van pesticiden[5, 9]. 2.3.1 Historie
In het verre begin van de Tweede Wereldoorlog ontdekten de Duitsers het eerste organofosfaat bevattende zenuwgas. In 1936 werkte de Duitse chemicus, Gerhard Schrader, aan de ontwikkeling van insecticiden. Hij ontwikkelde een zeer giftig organofosfaat verbinding die hij de naam “Tabun” gaf. Tabun was de eerst ontdekte stof uit een reeks van verbindingen die “zenuwgassen” worden genoemd. De Duitse wet schreef voor dat alle ontdekkingen die militaire toepassingen hadden gemeld moesten worden aan militaire ambtenaren. De Duitsers plaatsten Schrader in een geheime militaire onderzoeksfaciliteit met de opdracht om zenuwgassen te produceren en nieuwe zenuwgassen te ontdekken. Vervolgens ontdekten Schrader en zijn team van onderzoekers een nog dodelijker organofosfaat bevattend zenuwgas. Schrader noemde het Sarin ter ere van zijn teamleden. Na de ontdekking van Tabun en Sarin volgde de ontdekking van Soman door Richard Kuhn en Konrad Henkel in 1944. Gevolgd door de ontdekking van cyclohexyl Sarin. Al deze zenuwgassen vallen onder dezelfde klasse, de “G” agentia. Gedurende de Tweede Wereld oorlog werden deze zenuwgassen massaal geproduceerd door de Duitsers, maar zijn nooit gebruikt. In de jaren 50 werd er door een chemicus bij het Britse Imperial Chemical Industries, een nieuwe organofosfaat verbinding ontdekt als potentieel insecticide. Net als bij Schrader bleek deze verbinding te toxisch te zijn voor gebruik in het veld als pesticide. De verbinding werd naar onderzoekers in Porton Down, Engeland, gestuurd waar het werd gesynthetiseerd en ontwikkeld als de eerste van een nieuwe klasse van zenuwgassen, de “V” agentia[5].
Daarnaast is er nog het gebruik van zenuwgassen bij terroristische aanslagen. In 1994 is er door een sekte geprobeerd drie rechters om te brengen met een dosis Sarin. Nadat dit mislukte pleegde ze een nieuwe aanslag met Sarin in 1995 in het metrosysteem van Tokyo[6].
Pagina | 5 2.3.2 Typen zenuwgas
Zoals in de historie beschreven staat, zijn er verschillende soorten zenuwgassen en verschillende klassen waar toe ze kunnen behoren. Één van de vele soorten zenuwgassen zijn de organofosfaten. Organofosfaten (organophosphates, OP’s) zijn organische fosforverbindingen met een centraal fosforatoom dat omgeven is door vier verschillende groepen. In het geval van deze OP’s zijn drie van de vier groepen heteroatomen. OP’s kunnen onderverdeeld worden in twee klassen, de “G”- en “V”-agentia[6].
Onder de “G”-agentia vallen Tabun (GA), Sarin (GB), Soman (GD) en cyclohexyl Sarin (GF). De “G” staat voor German, Duitsland, omdat Duitse wetenschappers deze klasse van verbindingen hebben ontdekt. De tweede letter is toegevoegd als identificatiecode voor elke verbinding[5]. De “V”-agentia (“V” van “venom”) werd later geïntroduceerd. VE, VG, VM, VR en VX zijn zenuwgassen die vallen onder de “V”-agentia. Het zenuwgas VX werd in 1950 gesynthetiseerd en ten opzichte van de andere “V”-agentia het meest geproduceerd[10].
Het verschil tussen de twee klassen zit in de verbinding, vluchtigheid en in de toxiciteit. Bij de zenuwgassen uit de “G”-agentia zijn twee zuurstofatomen gebonden aan het fosforatoom. Bij de zenuwgassen uit de “V”-agentia zijn twee zuurstofatomen en één zwavelatoom gebonden aan de fosfor[6]. Daarnaast zijn “V”-agentia toxischer en minder vluchtig dan de “G”-agentia[5, 6].
Hieronder zullen enkele aspecten van de volgende OP’s worden toegelicht: Sarin, Soman en VX. Bij TNO wordt het meeste onderzoek gedaan naar deze zenuwgassen.
Sarin
Chemische eigenschappen: Sarin, ook wel GB genoemd, heeft als IUPAC-naam (RS)-2-(fluormethylfosforyl)oxypropaan. Zie figuur 1 voor de structuurformule van Sarin. GB is een kleur- en geurloze vloeistof met een molmassa van 140,1 Da. Met een dampdruk van 2.9 mm Hg bij 25 °C is Sarin het vluchtigst van alle “G” agentia. GB is mengbaar met water. Daarnaast is GB ook hygroscopische (wateraantrekkend)[6]. Zie bijlage II voor meer chemische eigenschappen zoals molmassa, kookpunt, smeltpunt, etc. van Sarin.
Toxiciteit1: Er wordt geschat dat bij een inhaleringsconcentratie van 100 mg∙min/m3 Sarin 50% van de blootgestelde populatie zal sterven aan de verwondingen (de LCt50). Bij een blootstelling via de huid wordt geschat dat een dosis van 1700 mg/individu dodelijk is voor de helft van de blootgestelde populatie[7]. Het grote verschil tussen deze waarden zit hem in de vluchtigheid van de stof, het zenuwgas verdampt op de blote huid.
Soman
Chemische eigenschappen: Een andere naam voor Soman is GD. De IUPAC-naam is 3-(fluor-methyl-fosforyl)oxy-2,2-dimethylbutaan. Zie figuur 2 voor de structuurformule van Soman. Pure GD is een kleurloze vloeistof met een fruitige geur[6]. Zie bijlage II voor meer chemische eigenschappen zoals molmassa, kookpunt, smeltpunt, etc. van Soman.
Toxiciteit1: Er wordt geschat dat bij een inhaleringsconcentratie van 100 mg∙min/m3 Soman 50% van de blootgestelde populatie zal sterven aan de verwondingen (de LCt50). Bij een blootstelling via de huid wordt geschat dat een dosis van 300 mg/individu dodelijk is voor de helft van de blootgestelde populatie[7]. Het verschil tussen deze waarden zit hem in de vluchtigheid van de stof, het zenuwgas verdampt op de blote huid.
1 De waarden van toxiciteit zijn schattingen van de dosis die letale effecten heeft op de mens. Figuur 1: Structuurformule Sarin,
C4H10FO2P.
Figuur 2: Structuurformule Soman, C7H16FO2P.
Pagina | 6 VX
Chemische eigenschappen: De IUPAC-naam voor VX is O-ethyl S-[2-(diisopropylamino)ethyl] methylfosfonothiolaat. Zie figuur 3 voor de structuurformule van VX. VX is een kleur- en geurloze vloeistof met een molmassa van 267,4 Da. De dichtheid van VX is vergelijkbaar met water en is enigszins oplosbaar in water[6]. Zie bijlage II voor meer chemische eigenschappen zoals molmassa, kookpunt, smeltpunt, etc. van VX.
Toxiciteit1: Er wordt geschat dat bij een inhaleringsconcentratie van 50 mg∙min/m3 VX 50% van de blootgestelde populatie zal sterven aan de verwondingen (de LCt50). Bij een blootstelling via de huid wordt geschat dat een dosis van 10 mg/individu dodelijk is voor de helft van de blootgestelde populatie[7]. Doordat VX minder vluchtig is dan bovenstaande “G”-agentia is het verschil tussen de inhaleringsconcentratie en de lethale dosis via de huid kleiner.
2.3.3 Effecten
Bij blootstelling aan een lage dosis treden symptomen als toename van de speekselproductie, een loopneus, druk op de borst, hoesten, hoofdpijn, overmatig zweten, moeite met ademhalen, braken, duizeligheid en verstrooidheid. Daarnaast vernauwen de pupillen waardoor het zicht vermindert en ontstaat er pijn bij het concentreren op één voorwerp[7].
Bij blootstelling aan een hogere dosis treden symptomen op als vernauwing van de luchtwegen en excretie van slijm in de luchtwegen. Dit leidt tot moeite met ademhalen en hoesten. Irritatie in het maagdarmkanaal kunnen leiden tot krampen en braken. Andere symptomen zijn tranende ogen, hevige speekselproductie, zweten en incontinentie. Daarnaast kan het zijn dat spieren verzwakken, gaan trillen of samentrekken[7].
Bij blootstelling aan een hoge dosis zenuwgas zijn de symptomen sterker. Het slachtoffer raakt buiten bewustzijn en ondergaat hevige stuiptrekkingen. Bij een hoge dosis kunnen zenuwgassen ook spierverlamming veroorzaken en het ademhalingscentrum in het CZS beïnvloeden. Door verlamming van de ademhalingsspieren en het beïnvloeden van het ademhalingscentrum treedt uiteindelijk dood door verstikking op[7].
2.3.4 Metabolisme
Een klein gedeelte van het binnengekregen zenuwgas bindt zich covalent aan cholinesterasen (neurotransmitters in het CZS), de rest van de stof wordt afgebroken en geëlimineerd uit het lichaam. Zenuwgassen worden voornamelijk geëlimineerd door enzym gemedieerde hydrolyse en chemische hydrolyse[11].
Sarin, Soman en VX worden gemakkelijk gehydrolyseerd tot alkyl methylfosfonzuren (alkyl methylphosphonic acids, AMPA’s). In figuur 4 is schematisch het metabolisme van Sarin, Soman en VX weergegeven. De grootste metaboliet van Sarin is isopropyl MPA, IMPA. Soman wordt in de eerste fase geëlimineerd tot pinacolyl MPA (PMPA). VX kan op dezelfde manier als Sarin en Soman worden geëlimineerd tot ethyl MPA (EMPA), maar kan ook op een andere manier worden gemetaboliseerd waarbij de toxische metaboliet EA 2192 (S,2-(diisopropylaminoethyl) methylphosphonothioic acid) vrijkomt[11]. Uiteindelijk worden alle drie de zenuwgassen langzaam gehydrolyseerd tot dezelfde metaboliet, methylfosfonzuur(methylphosphonic acid, MPA). [12].
Pagina | 7 Er is vastgesteld dat Sarin een halfwaardetijd heeft van 1,5 minuut bij een pH van 11[6]. Dit betekent dat na 1.5 minuut, bij een pH van 11, nog maar de helft van de oorspronkelijke hoeveelheid Sarin over is, de rest is afgebroken/uiteengevallen. Er is vastgesteld dat VX een halfwaardetijd heeft van ongeveer 30 dagen bij een temperatuur van 25⁰C en een pH van 7[6]. De halfwaardetijd van Soman is 80 uur bij een temperatuur van 20⁰C en een pH van 7 en een halfwaardetijd van 45 uur bij een pH van 6.65 en een temperatuur van 25⁰C [5, 6].
Figuur 4: Schematische weergave van het metabolisme van de zenuwgassen VX, Sarin en Soman. VX, Sarin en Soman worden door middel van enzym gemedieerde hydrolyse en chemische hydrolyse omgezet in alkyl methylfosfonzuren (EMPA, IMPA en PMPA). De uiteindelijke metaboliet is voor alle drie de zenuwgassen hetzelfde: methylfosfonzuur
(MPA)[12].
2.4 Werking van zenuwgassen
Zenuwgassen hebben een remmende werking op de activiteit van het enzym Acetylcholinesterase. Wanneer het enzym geremd wordt treden er allerlei complicaties op. Naast Acetylcholinesterase kunnen zenuwgassen, zoals organofosfaten, ook binden aan het enzym Butyrylcholinesterase. Butyrylcholinesterase speelt een belangrijke rol binnen het onderzoek.
2.4.1 Acetylcholinesterase
Acetylcholinesterase (AChE, EC 3.1.1.7) is een enzym dat aanwezig is in de neuronen en gliacellen van het menselijk lichaam[13]. Daarnaast is AChE ook aanwezig op de rode bloedcelmembranen. AChE heeft als belangrijkste functie het beëindigen van de impulsoverdracht bij cholinerge synapsen door snelle hydrolyse van de neurotransmitter acetylcholine (ACh)[14].
Zenuwcellen (of bijvoorbeeld een zenuwcel en een spiercel) kunnen signalen aan elkaar doorgeven door middel van neurotransmitters. De signaaloverdracht vindt plaats in een synaps, een ruimte tussen twee zenuwcellen. Een zenuwimpuls die het einde van een axon (uitloper van een zenuwcel) bereikt veroorzaakt de afgifte van een chemische stof (neurotransmitter), die vervolgens de ruimte tussen de cellen oversteekt en de doelcel (bijvoorbeeld een andere zenuwcel of spiercel) activeert. De eerste bekende neurotransmitter is acetylcholine. ACh verzorgt (o.a.) de overdracht tussen zenuwcellen en spiercellen. Zodra ACh vrijkomt in de intercellulaire ruimte wordt de neurotransmitter aan de andere kant van de synaps opgevangen door gespecialiseerde eiwitten, receptoren genoemd, die ingebed liggen in de doelcel. Nadat de neurotransmitter zijn opdracht heeft volbracht, het overbrengen van de zenuwimpuls over de synaps naar de volgende cel, moet hij worden uitgeschakeld. In het geval van acetylcholine is Acetylcholinesterase het enzym dat de neurotransmitter verwerkt. AChE splitst ACh in zijn samenstellende delen, azijnzuur en choline, zie
Pagina | 8 figuur 5 voor de reactievergelijking. Dit doet het enzym met een ongewoon hoge omzettingsgraad van 25000 gekatalyseerde reacties per seconde. Met andere woorden AChE kan één ACh-molecuul splitsen in 40 microseconden. Dit zorgt ervoor dat het neurotransmittersignaal tijdig gestopt wordt en de cellen snel hun rustpositie kunnen aannemen tot het ontvangst van de volgende impuls. Door deze eigenschap zorgt AChE er ook voor dat spieren na het samentrekken weer ontspannen[15].
Figuur 5: Hydrolyse van acetylcholine door het enzym Acetylcholinesterase. Acetylcholine wordt gesplitst in azijnzuur en choline[14].
Naast Acetylcholinesterase bestaat er ook nog Butyrylcholinesterase. Samen behoren ze tot de cholinesterasen-groep[13].
2.4.2 Butyrylcholinesterase
Butyrylcholinesterase (BuChE, EC 3.1.1.8) is een enzym dat in bijna alle weefsels van het lichaam aanwezig is, behalve in rode bloedcellen[13]. De hoogste concentraties BuChE zijn te vinden in humaan plasma[16]. De fysiologische functie van BuChE is nog onbekend, maar het enzym kan fungeren als een “back-up” voor AChE en als afvangmiddel voor giftige stoffen die de AChE activiteit remmen[17]. Daarnaast zijn er aanwijzingen dat BuChE deelneemt aan de eerste fase van de ontwikkeling van het zenuwstelsel[13]. BuChE wordt in verschillende populatie van neuronen tot expressie gebracht, sommige van deze neuronen kunnen ook AChE bevatten[18]. Terwijl AChE de neurotransmitter ACh snel en efficiënt hydrolyseert, katalyseert BuChE deze hydrolyse met een veel lagere reactiesnelheid[5].
2.4.3 Inhibitie van AChE en BuChE
Zenuwgassen zijn een uiterst barbaarse manier om mensen te doden, ze ontregelen het zenuwstelsel door te interfereren met enzymen. Organofosfatische zenuwgassen komen in het lichaam terecht door inademing (voornamelijk de “G”-agentia) of absorptie via de huid (voornamelijk de “V”-agentia”) en blokkeren de werking van Acetylcholinesterase[5, 15].
AChE behoort tot de serineproteasen. Serineproteasen zijn enzymen die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van drie cruciale aminozuren histidine, asparaginezuur of glutaminezuur en serine in het katalytische (actieve) centrum. In het geval van AChE zijn de drie cruciale aminozuren: histidine, glutaminezuur en serine[13]. Door de gunstige ligging van deze drie aminozuren, ook wel het actieve centrum genoemd, kunnen zenuwgassen zich door middel van vanderwaalskrachten, waterstofbruggen, Coulombkrachten en ladingoverdracht binden aan het eiwit[19]. De zenuwgassen reageren snel met de hydroxylgroep van serine in het actieve centrum van AChE en vormen een fosfaat of een fosfonaatester. Gefosfonyleerd AChE kan ACh niet meer hydrolyseren waardoor er allerlei complicaties kunnen optreden. Wanneer een zenuwgas het enzym blokkeert, blijft dit zo totdat het enzym wordt geregenereerd door hydrolyse of door een enzym re-activator (oxime)[20]. In figuur 6 staat een schematische weergave van de reactie tussen het enzym Acetylcholinesterase en een organofosfaat. De OP valt de OH-binding van serine aan doordat de zuurstof licht negatief geladen is (doordat het stikstofatoom van histidine een waterstofbrug vormt met het waterstofatoom van serine). De X (verlatende groep, kan bijvoorbeeld fluoride zijn in het geval van Soman) wordt hierdoor geëlimineerd, de rest van het molecuul blijft covalent gebonden met serine[15]. Na deze stap kan er nog een dealkylering reactie plaats, deze stap wordt ook wel “aging” (of te wel “veroudering”) genoemd. De reactie wordt gekatalyseerd door het enzym zelf en kan zeer snel plaats vinden. Na deze stap is het adduct nog beter bestand tegen hydrolyse en heeft
Pagina | 9 reactivering met een oxime geen effect meer. Per zenuwgas verschilt de tijd van “veroudering”. Soman bijvoorbeeld is een zenuwgas met een snel “verouderingsproces”. [7].
Figuur 6: Schematische weergave van de reactie tussen Acetylcholinesterase en een organofosfaat[13]. Legenda: X=verlatende groep. R=rest (verschilt per zenuwgas).
Zenuwgassen zijn gevaarlijker dan andere stoffen (bijvoorbeeld DPF, een insecticide) die de werking van AChE blokkeren, omdat ze reactiever zijn en veel stabieler wanneer ze eenmaal aan het serine gebonden zijn. Wanneer het zenuwgas “verouderd is” is de binding tussen het zenuwgas en het enzym is onomkeerbaar[15].
Zenuwgassen hechten zich op dezelfde manier aan Butyrylcholinesterase als aan Acetylcholinesterase. Het verschil zit hem vooral in de positie van het belangrijke aminozuur serine in het actieve centrum. Bij BuChE zit serine op positie 198 in het enzym. De effecten die de inhibitie van het enzym BuChE door zenuwgassen met zich meebrengt is op dit moment nog onbekend doordat ook de functie van het enzym nog niet duidelijk is.
2.4.4 Toepassing AChE en BuChE in het onderzoek
Over het algemeen draagt Butyrylcholinesterase weinig tot helemaal niet bij aan de hydrolyse van Acetylcholine. Daarom geeft de aanhechting van het zenuwgas aan het enzym BuChE weinig complicaties in het lichaam. Toch is BuChE voor dit onderzoek van groot belang. Het menselijk lichaam bevat 10x meer BuChE dan AChE: ongeveer 680 nmol BuChE en 62 nmol AChE[17]. Daarnaast is BuChE gemakkelijker te isoleren uit bloed doordat het (in grote concentraties) aanwezig is in het plasma. Door al deze eigenschappen vormt BuChE de beste biomarker om de blootstelling aan zenuwgassen aan te tonen.
2.5 Verificatie van blootstelling aan zenuwgassen
Op dit moment zijn er een aantal methoden beschikbaar om de blootstelling aan zenuwgassen aan te tonen. Er zijn methoden die de vrije metabolieten in bijvoorbeeld urine kunnen detecteren en analyseren, maar er zijn ook methoden die adducten van een zenuwgas aan eiwitten in het lichaam kunnen analyseren. De methoden die in deze paragraaf behandeld worden zijn gebaseerd op het analyseren van adducten van zenuwgassen die gevormd worden met eiwitten in het lichaam. Het voordeel van het gebruiken van eiwitadducten als biomarker (in vergelijking met vrije metabolieten) is de levensduur van de macromoleculen. Eiwitten worden veel langzamer uit het lichaam
Pagina | 10 BuChE
geëlimineerd waardoor de identificatie van het zenuwgasadduct nog weken na blootstelling kan plaatsvinden. Het nadeel van het analyseren van adducten (met macromoleculen) ten opzichte van de analyse van vrije metabolieten is dat de methode meestal complexer en veeleisender is[19]. 2.5.1 Ellman methode
De oudste methoden om vast te stellen of iemand is blootgesteld aan een zenuwgas is het meten van de afname van Acetylcholinesterase activiteit in het bloed door middel van de colorimetrische Ellman procedure (of variaties op deze methode). Deze meting is snel, gevoelig en toepasbaar in het veld, maar het heeft ook een aantal tekortkomingen. De methode identificeert het zenuwgas niet en de specificiteit is erg laag, er zijn namelijk verschillende andere chemische stoffen die bijdragen aan de remming van AChE. Daarnaast levert de Ellman methode (of variaties hierop) geen betrouwbaar bewijs van zenuwgas blootstelling wanneer het niveau van remming minder is dan 20%[19, 21]. Het principe van de methode berust op het meten van de mate van thiocholine productie wanneer acetylthiocholine gehydrolyseerd wordt door het enzym AChE. Een variatie op de originele Ellman methode is het testen van de BuChE activiteit. De methode berust op hetzelfde principe alleen wordt er butyrylthiocholine gebruikt in plaats van acetylthiocholine.
De volgende reactie vindt er plaats:
Butyrylthiocholine iodide (BuSChI) thiocholine + acetaat Thiocholine + dithiobisnitrobenzoaat (DTNB) gele kleur
De mate van kleurverandering kan worden gemeten met de spectrofotometer bij 412nm[21]. Deze methode kan gebruikt worden om plasmamonsters te testen op BuChE activiteit, om te controleren of de isolatiemethode gelukt is en om te bepalen of de BuChE activiteit afneemt naarmate plasma blootgesteld wordt aan een zenuwgas. Daarnaast geeft de mate en snelheid van kleurverandering ook een ruwe indicatie van de concentratie van het geïsoleerde enzym.
2.5.4 Massaspectrometrische bepaling van BuChE-adducten
Deze methode is in 2001 ontwikkeld bij TNO Defensie en Veiligheid en is de basismethode voor dit onderzoek[22]. Zoals eerder beschreven staat, reageert een zenuwgas snel met de serine-198 residugroep (de OH-groep) van butyrylcholinesterase tot een fosfaat of fosfonaat ester. Uit eerder onderzoek is gebleken dat BuChE affiniteit heeft met procainamide. Hierbij wordt BuChE met adduct geïsoleerd uit humaan plasma door middel van affiniteitschromatografie met een procainamide kolom. Na de isolatie wordt het gefosfonyleerd BuChE enzymatisch geknipt (digestie). Tijdens het ontwikkelen van deze methoden werden verschillende enzymen zoals trypsine, thermolysine, pronase en pepsine getest op het knippen van gefosfonyleerd BuChE. Uit het onderzoek bleek dat voor de digestie het beste pepsine kan worden gebruikt. Bij pepsine digestie is namelijk geen voorbewerking van het BuChE enzym nodig. Afhankelijk van de hoeveelheid toegevoegde pepsine knipt het enzym BuChE tot verschillende peptiden. In het geval van deze methode is er gekozen voor een grote hoeveelheid pepsine waarbij voornamelijk nonapeptiden worden gevormd met hierin de gefosfonyleerde serine. Het nonapeptide ziet er als volgt uit: FGES(x)AGAAS waarbij “x” voor het zenuwgasadduct staat. Pepsine werkt het beste bij een pH tussen de 1,8 en 2,2. Hierom wordt de digestie uitgevoerd in (5%) mierenzuur. Na digestie wordt het monster geanalyseerd met behulp van LC-TSQ-MS/MS of LC-QTOF-MS/MS[19, 22].
Omdat de concentraties van de biomarkers zo laag zijn worden de massaspectrometrische analyses vaak in “single reaction monitoring” (SRM) mode uitgevoerd, zodat de hoogste gevoeligheid wordt verkregen. Dit betekent wel dat de identiteit van het zenuwgas vooraf bekend moet zijn om het instrument op de juiste manier in te stellen. In de praktijk zal de identiteit van de cholinesterase remmer niet altijd bekend zijn, dit betekent dat de massaspectrometer in de scan modes (full scan) moet worden ingesteld om te screenen op cholinesterase-remmers[23]. In figuur 7 staat een
Pagina | 11 chromatogram weergegeven van een full scan analyse (met LC-TSQ-MS/MS) van Sarin gebonden aan BuChE na digestie met pepsine.
De gedetecteerde (totaal)massa van het (geprotoneerde) gefosfonyleerd nonapeptide is een indicatie van de identiteit van het zenuwgas. Bij een blootstelling aan Sarin wordt het gefosfonyleerd nonapeptide binnen TNO aangeduid als FGESAGAAS-IMPA. FGESAGAAS staat voor het nonapeptide en IMPA staat voor het gebonden Sarin. Geprotoneerd FGESAGAAS-IMPA heeft een massa van 916.4, dit is ook te zien in figuur 7. Bij blootstelling aan Soman wordt het (geprotoneerde) gefosfonyleerd nonapeptide aangeduid als FGESAGAAS-PMPA en heeft een massa van 958. FGESAGAAS-PMPA wordt na veroudering aangeduid als FGESAGAAS-PA en heeft een (geprotoneerde) massa van 874. Bij blootstelling aan VX wordt het (geprotoneerde) gefosfonyleerd nonapeptide aangeduid als FGESAGAAS-EMPA en heeft een massa van 902.
Daarnaast zijn in figuur 7 nog drie andere (duidelijke) pieken aanwezig bij de massa’s 778.4, 673.4 en 602.4. Deze 3 massa-overgangen zijn specifiek voor het nonapeptide. Bij de overgang van de totaalmassa naar 778.4 valt het zenuwgasadduct af, daarna volgt één voor één de aminozuren van het nonapeptide. In figuur 8 is de structuur weergegeven van FGESAGAAS-IMPA. Daarnaast is te zien waar de fragmentatie plaatsen zijn die het specifieke pieken patroon geeft (zie figuur 7). Wanneer bij alle vier de massa’s (de totaalmassa en de drie overgangen) een piek, met dezelfde retentietijd, aanwezig is kan er met zekerheid gezegd worden dat plasma (of een persoon) blootgesteld is aan een zenuwgas.
Figuur 8: Structuur van het nonapeptide met sarin-adduct (FGESAGAAS-IMPA). De stippellijnen geven de fragmentatie plaatsen weer. Legenda: Fen=fenylalanine, Gly=glycine, Glu=glutaminezuur, Ser=serine, Ala=alanine
Figuur 7: Chromatogram van een full scan analyse met LC-TSQ-MS/MS van een gefosfonyleerd nonapeptide (FGESAGAAS-IMPA). De m/z (massa/ladingverhouding) waarde is uitgezet tegen de relatieve abundantie.
Pagina | 12 De massaspectrometrische methode heeft grote voordelen. Met deze methode kan veel gevoeliger worden gemeten in vergelijking met de Ellman methode. Ten tweede kan een “verouderd” zenuwgas gebonden aan BuChE ook worden gedetecteerd met deze methode. Ten derde is deze methode ook toepasbaar voor andere stoffen die AChE remmen, waardoor biomonitoring kan worden toegepast bij blootstelling aan verschillende OP pesticiden[19]. Ten slotte het is met deze methode mogelijk om een blootstelling aan te tonen lang nadat de blootstelling heeft plaatsgevonden, omdat gefosfonyleerd BuChE een halfwaardetijd heeft van 5-16 dagen[11].
Eén groot nadeel aan de opwerkingsmethode (isolatiemethode) vóór de massaspectrometrische bepaling zijn de vele uit te voeren stappen. Deze stappen kunnen niet worden geautomatiseerd wat de methode erg arbeidsintensief maakt.
2.5.5 Immuno-Magnetic Separation en analyse van BuChE-adducten
Recent is er een nieuwe methode ontwikkeld die gebruik maakt van commerciële antilichamen[19, 24]. De methode vindt plaats in twee stappen. In figuur 9 wordt de Immuno-Magnetic Separation (IMS) methode schematisch weergegeven. Allereerst worden magnetic beads gecoat met monoklonale antilichamen, in dit geval anti-AChE of anti-BuChE. De antilichamen worden gebonden op de speciale coating (proteïne G) die als een schil om de beads heen zit. De antilichamen kunnen worden gecrosslinked (het binden van twee polymeerketens) aan de beads om te voorkomen dat de antilichamen loskomen van de beads tijdens het wassen/elueren. Na het coaten van de antilichamen aan de beads wordt het serum toegevoegd. BuChE zal zich gaan binden aan de antilichamen. Met de antilichamen en het gebonden BuChE nog op de beads kan het enzym gedigesteerd worden door pepsine. Het nadeel hiervan is dat de beads hierdoor mogelijk niet meer bruikbaar zijn omdat pepsine een agressief digestiemiddel is dat niet alleen het gebonden eiwit digesteert, maar ook het gecoate antilichaam en de proteïne G waardoor de matrix vervuild raakt met peptiden afkomstig van de geknipte antilichamen en proteïne G. Na het digesteren kan het gefosfonyleerd nonapeptide geanalyseerd worden door middel van de LC-TSQ-MS/MS en/of de LC-QTOF-MS/MS.
Figuur 9: Schematische weergaven van de Immuno-Magnetic Separation methode. Allereerst worden de antilichamen aan de magnetic beads geconjugeerd. Wanneer het BuChE bevattend plasma wordt toegevoegd, zal de BuChE zich gaan
hechten aan de antilichamen. Door het toevoegen van pepsine wordt het enzym geknipt tot peptiden en kan het geanalyseerd worden met de LC-MS/MS[23].
In enkele wetenschappelijke artikelen wordt aangegeven dat deze methode van isolatie robuust, snel en efficiënt is. Daarnaast geven ze aan dat er een hoge zuiverheid van het geïsoleerde enzym verkregen wordt door middel van IMS[24, 25]. De specificiteit van de methode wordt verkregen door de monoklonale antilichamen die gebruikt worden. Anti-BuChE bindt alleen BuChE en anti-AChE bindt alleen anti-AChE. Ongewenste (storende) eiwitten zullen niet kunnen binden aan het antilichaam en worden weggewassen tijdens de isolatie.
Pagina | 13
3 Materialen & Methoden
In dit hoofdstuk worden alle methoden beschreven die tijdens de experimenten veelvuldig zijn gebruikt. Voor een volledig overzicht van de gebruikte chemicaliën en materialen zie bijlage III.
3.1 Basismethode isolatie BuChE uit humaan plasma
BuChE werd met behulp van procainamide affinity gel uit humaan plasma geïsoleerd. Tijdens het experiment werden drie buffers gebruikt, zie tabel 1 voor de gebruikte buffers.
Tabel 1: Gebruikte buffers. Buffer Naam
Buffer A 20mM natriumfosfaatbuffer pH 6,9
Buffer B 1000mM NaCl in 20mM natriumfosfaatbuffer pH 6,9 Buffer C 150mM NaCl in 20mM natriumfosfaatbuffer pH 6,9
De procainamide gel (4ml) werd, na te zijn opgenomen in een spuit met frit (10ml), twee keer voorgespoeld met buffer A (10ml), één keer gespoeld met buffer B (10ml) en opnieuw twee keer gespoeld met buffer A (10ml). Na het spoelen werd of een blanco of 100% GB geremd plasmamonster (1ml) op de gel aangebracht. Het gel-plasma mengsel werd, na afsluiten van de spuit, 30 minuten rustig geschud en vervolgens gespoeld met buffer A (5ml) en buffer C (24ml). Hierna werd BuChE van de gel geëlueerd met behulp van buffer B (15ml), het eluaat werd opgevangen. Het opgevangen eluaat werd geconcentreerd met behulp van een Amicon Ultra 100kD cut off filter door 45 minuten te centrifugeren bij 3750rpm. Hierna werd het filter drie keer gespoeld met ammoniumbicarbonaat (50mM; 5ml) en na elke stap gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 3750rpm. Het residu (ca. 0,2ml) werd overgebracht in een schone glazen vial. Het filter werd gewassen met 5% mierenzuuroplossing (0,2ml). De wasvloeistof werd gecombineerd met het residu. Het geïsoleerde en geconcentreerde BuChE werd vervolgens gedigesteerd met behulp van pepsine. Aan het geconcentreerde BuChE monster werd pepsine oplossing (2mg pepsine/1ml 5% mierenzuur; 50l) en nogmaals 5% mierenzuur (50l) toegevoegd. Hierna werd het monster 2 uur geïncubeerd in een waterbad van 37⁰C. Na het incuberen werd het monster overgebracht in een Microcon Ultra 10kD cut off filter en gecentrifugeerd gedurende 45 minuten bij 11000rpm. Het filtraat werd naar de LC-MS afdeling gebracht voor verdere analyse.
3.2 Optimalisatie basismethode
Tijdens het optimalisatie onderzoek van de basismethode werden twee stappen gevarieerd: het percentage mierenzuur bij de pepsine digestie en de incubatietijd van de monsters met pepsine. Het percentage mierenzuur werd gevarieerd om zo het achtergrondsignaal bij de LC-MS/MS mogelijk te verlagen/verkleinen. Door het verlengen van de incubatietijd kan het zijn dat er een hogere opbrengst nonapeptide met zenuwgasadduct wordt verkregen.
3.2.1 Percentage mierenzuur
De basismethode werd uitgevoerd met zes plasmamonsters: drie blanco plasmamonster en drie 100% GB geremde plasmamonsters. Echter, voor elk monster werd een verschillend mierenzuur percentage gebruikt bij de pepsine digestie. In tabel 2 staat per plasma monster weergegeven welk percentage mierenzuur werd gebruikt. In de basismethode werd 5% mierenzuur gebruikt bij de pepsine digestie, nu werd ter vergelijking 5; 2,5 of 0,3% mierenzuur gebruikt. De monsters werden naar de LC-MS afdeling gebracht voor verdere analyse met LC-TSQ-MS/MS.
Pagina | 14 Tabel 2: Pepsine digestie met verschillende percentages mierenzuur. Per plasmamonster staat het gebruikte percentage mierenzuur weergegeven. Legenda: BM= blanco plasmamonster, GM = geremd plasmamonster.
Blanco plasma Geremd plasma Mierenzuur (%)
BM 1 GM 4 5
BM 2 GM 5 2,5
BM 3 GM 6 0,3
De methode werd opnieuw uitgevoerd met zes nieuwe plasmamonsters, drie blanco plasmamonsters en 3 100% GB geremde plasmamonsters, met ook dit keer drie verschillende percentages mierenzuur bij de pepsine digestie: 1,4; 0,6 en 0,3%. Zie tabel 3 voor de gebruikte percentages per plasmamonster. De monsters werden naar de LC-MS afdeling gebracht voor verdere analyse met LC-TSQ-MS/MS.
Tabel 3: Pepsine digestie met verschillende percentages mierenzuur. Per plasmamonster staat het gebruikte percentage mierenzuur weergegeven. Legenda: BM= blanco plasmamonster, GM = geremd plasmamonster.
Blanco plasma Geremd plasma Mierenzuur (%)
BM 7 GM 10 1,4
BM 8 GM 11 0,6
BM 9 GM 12 0,3
3.2.2 Incubatietijd met pepsine
Naast het optimaliseren van het percentage mierenzuur werd ook de incubatietijd van de plasmamonsters met pepsine geoptimaliseerd. Het isoleren en concentreren van BuChE werd volgens de basismethode uitgevoerd. De methode werd uitgevoerd met zes plasmamonsters: drie blanco plasmamonster en drie 100% GB geremde plasmamonsters. Bij het digesteren van BuChE werd 0,6% mierenzuur gebruikt om de filter mee te wassen, pepsine opgelost in 0,6% mierenzuur en 0,6% mierenzuur gebruikt om aan te vullen. Hierna werd elk plasmamonster voor een bepaalde tijd geïncubeerd met pepsine in een waterbad van 37⁰C. In tabel 4 staat voor elk plasmamonster de incubatietijd met pepsine gegeven. De incubatietijden varieerden van 2 tot 6 uur. De monsters werden naar de LC-MS afdeling gebracht voor verdere analyse met LC-TSQ-MS/MS.
Tabel 4: Verschillende incubatietijden bij de pepsine digestie met 0,6% mierenzuur. Per plasmamonster staat de incubatietijd weergegeven. Legenda: BM= blanco plasmamonster, GM = geremd plasmamonster.
Blanco plasma Geremd plasma Incubatietijd (uur)
BM 13 GM 16 2
BM 14 GM 17 4
BM 15 GM 18 6
3.3 Isolatiemethoden vergelijken
Er werd getracht om BuChE uit plasma te isoleren door middel van verschillende isolatiemethoden en combinaties hiervan. Met behulp van de HiTrap isolatie werd getracht het grootste gedeelte van albumine (het meest voorkomende plasma-eiwit) te verwijderen uit het plasmamonster. Door HiTrap isolatie te combineren met procainamide isolatie werd getracht een zuiverdere matrix te verkrijgen met daarin het te meten (gefosfonyleerd) BuChE. Met de verkregen eindoplossingen werd een SDS-PAGE uitgevoerd om de isolatiemethoden onderling te vergelijken in zuiverheid.
3.3.1 HiTrap isolatie
De HiTrap isolatie werd uitgevoerd met behulp van een HiTrap Blue HP kolom. De kolom werd voorgespoeld met kaliumfosfaatbuffer (buffer D; 20mM; pH 7,0; 10ml). Een blanco plasmamonster (1ml) werd verdund met buffer D (4ml) en gefiltreerd over een Acrodisc filter. Het verdunde plasma
Pagina | 15 (5ml) werd in twee delen (2x 2,5ml) over de HiTrap kolom gehaald. Tussen de twee stappen werd de kolom geregenereerd met KCl (2000mM) in kaliumfosfaatbuffer (buffer E; 10ml), om de verontreiniging uit de kolom te spoelen, en vervolgens met buffer D (10ml) om het zout uit de kolom te spoelen. Na het opbrengen van het verdunde monster (2,5ml) werd de doorloop opgevangen, de kolom werd geëlueerd met buffer D (2,5ml) en het eluaat werd opgevangen. De doorloop en het eluaat werden gecombineerd. Na het spoelen van de kolom met buffer E (10ml) en buffer D (10ml) om de kolom te regenereren, werd het resterende monster volume (2,5ml) over de kolom gehaald. De kolom werd opnieuw geëlueerd met buffer D. De doorloop en het eluaat werden gecombineerd met het eerder verkregen product. Het gepoolde monster (ca. 10ml) werd overgebracht in een Amicon Ultra 100kD cut off filter en 45 minuten gecentrifugeerd bij 3750rpm. Hierna werd het residu (ca. 0,2ml) overgebracht in een glazen vial. Het residu werd op de balans gewogen en aangevuld tot 1ml met DPBS.
3.3.2 Procainamide isolatie
De isolatie van BuChE met behulp van procainamide gel werd op dezelfde manier uitgevoerd als beschreven staat in de basismethode. Er werd gebruik gemaakt van een blanco plasmamonster (1ml). Na de isolatie werd het eluaat overgebracht in een Amicon Ultra 100kD cut off filter en 45 minuten gecentrifugeerd bij 3750rpm. Hierna werd het residu overgebracht in een glazen vial. Het residu werd op de balans gewogen en aangevuld tot 1ml met DPBS.
3.3.3 HiTrap + Procainamide isolatie
Met een blanco plasmamonster (1ml) werd eerst een HiTrap isolatie uitgevoerd. Hierna werd met het isolaat (1ml) een procainamide isolatie uitgevoerd. Het eluaat van de procainamide isolatie werd opgevangen, geconcentreerd, gewogen en opnieuw aangevuld tot 1ml met DPBS.
3.3.4 Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Alle drie de isolaten en een plasma controle (blanco plasma) werden op gel gebracht om onderling te kunnen vergelijken in zuiverheid. Voordat SDS-PAGE werd toegepast, werd eerst de totale eiwitconcentratie per monster bepaald met de BCA-methode door middel van de bicinchoninic acid protein assay kit. Er werd een SDS-PAGE gel gegoten met een 7,5% separatinggel en een 4,0% stackinggel, zie tabel 5 voor de samenstelling van de gel. De monsters werden verdund met 1x sample buffer (MiliQ; 0,5M tris buffer pH 6,8; 10% natriumdodecylsulfaat; 2-mercaptoethanol; glycerol; 0,5% BFB) tot een concentratie van 50g/25l en 25g/l. Na het klaarmaken van het elektroforese systeem, mini protean II elektroforese systeem, werd van elk verdund monster 20l in de slotjes gepipetteerd. Precision plus protein dual color standards werd als molmarker gebruikt (5l in 20l 1x sample buffer). De gel werd 1 uur gerund bij 100V en 20 minuten bij 120V. Na het runnen werd de gel gekleurd met behulp van EZBlue gel staining reagent. Nadat de gel gekleurd was werd er een scan van de gel gemaakt met behulp van de Typhoon 9400 variable mode imager.
Tabel 5: Samenstelling van de SDS-PAGE gel. Er werd een 7,5% separatinggel en een 4,0% stackinggel gegoten.
7,5% Separatinggel 4,0% Stackinggel MiliQ (ml) 4,9 6,1 0,5M Trizma Base pH 6,8 (ml) - 2,5 1,5M Trizma Base pH 8,8 (ml) 2,5 - 10% Natriumdodecylsulfaat (ml) 0,1 0,1 Acrylamide/bis (ml) 2,5 1,3 Ammoniumpersulfaat (ml) 0,064 0,096 Tetramethylethylenediamine (ml) 0,010 0,012
Pagina | 16
3.4 Immuno-Magnetic Separation
Om BuChE uit blanco en geremde plasmamonsters te isoleren werden magnetic beads (protein G Dynabeads) gebruikt. Er werden verschillende testen met de beads gedaan.
3.4.1 Coating van de beads met BuChE antilichaam
De coating vond plaats in verschillende hoeveelheden beads. Er werd uitgegaan van 100l bead-oplossing per coating. De bead-bead-oplossing (100L) werd drie keer gewassen met Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS; 200l). Hierna werd antilichaam bevattende oplossing (50g/ml anti-BuChE in 1xDPBST; 400l) aan de beads toegevoegd en geïncubeerd voor 18uur bij kamertemperatuur in een Eppendorf thermomixer (450rpm). Na de incubatie werden de beads twee keer gewassen met triethanolamine buffer (0.2 mol/L; pH 8.0; 200l). Daarna werden de antilichamen gecrosslinked aan de beads door ze 30 minuten te incuberen met Dimethyl Pimelimidate Dihydrochloride (DMP) in triethanolamine buffer (54mg DMP in 100ml; 200l) in een Eppendorf thermomixer (450rpm). De beads werden hierna 15 minuten geïncubeerd met 1x Tris Bufferd Saline (TBS; 200l) bij kamertemperatuur. Ten slotte werden de beads drie keer gewassen met Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline met 0,05% Tween 20 (DPBST; 100l).
3.4.2 Basismethode isolatie BuChE met beads
De DPBST werd verwijderd en MQ (100l) werd toegevoegd aan de beads (=stock van beads). De incubatie van de beads in plasma vond geautomatiseerd plaats door middel van de KingFisher mL system magnetic particle processor. Nadat het programma in de KingFisher was geïnstalleerd werd het programma gestart: Eerst worden de beads (0,025ml) overgebracht in plasma (0,2ml) en gedurende 2 uur geïncubeerd. Hierna worden de beads overgebracht in DPBS (1ml) en 2 minuten gewassen. De beads worden opnieuw overgebracht in DPBS (1ml) en 2 minuten gewassen. Ten slotte worden de beads overgebracht in miliQ. In figuur 10 staat het programma van de kingfisher schematisch weergegeven. Nadat het programma is afgerond werden de beads uit de KingFisher opstelling gehaald en in een schoon epje overgebracht.
Figuur 10: Schematische weergave van de KingFisher opstelling en het programma met de incubatiestappen. Aan de beads werd pepsine oplossing (251,4g pepsine in 1 ml 0,63% mierenzuur; 75l) toegevoegd en 1,5 uur geïncubeerd in een waterbad van 37⁰C. Het supernatant werd overgebracht in een Microcon Ultra 10kD cut off filter en 20 minuten gecentrifugeerd bij 11000rpm. Hierna werd er 0,6% mierenzuur (100l) op het filter gebracht en opnieuw 20 minuten gecentrifugeerd bij 11000rpm. Het monster werd naar de LC-MS afdeling gebracht voor verdere analyse.
Pagina | 17 3.4.3 Bepaling detectiegrens geremd plasma
Met behulp van IMS werd er getracht een zo laag mogelijke blootstelling aan een zenuwgas aan te tonen. Dit werd gedaan door eerst een 100% GB remming aan te tonen en daarna het remmingspercentage te verlagen tot uiteindelijk 1%.
100L beads werden gecoat met anti-BuChE en uiteindelijk over gebracht in MQ (100l), batch 1. Van batch 1 werd 25l beads door middel van het KingFisher programma overgebracht in 200l blanco plasma, 25l beads overgebracht in 100% GB geremd plasma en 50l beads overgebracht in 100% GB geremd plasma. Hierna werd een pepsine digestie uitgevoerd op dezelfde manier als bij de basismethode. De monsters werden naar de MS afdeling gebracht voor verder analyse met LC-TSQ-MS/MS en LC-QTOF-MS/MS.
De test werd nogmaals herhaald, alleen werd nu 300l beads gecoat met anti-BuChE en uiteindelijk overgebracht in MQ (300l), batch 2. Van batch 2 werd 50l door middel van het KingFisher programma overgebracht in 200l blanco plasma, in 50% GB geremd plasma, in 25% GB geremd plasma, in 10% GB geremd plasma, in 1% GB geremd plasma en in 0,5% GB geremd plasma. De verschillende percentages van remming werd verkregen door 100% GB geremd plasma in de juiste verhoudingen te verdunnen met blanco plasma. Hierna werd een pepsine digestie uitgevoerd op dezelfde manier als de bij basismethode. De monsters werden naar de LC-MS afdeling gebracht voor verder analyse met LC-TSQ-MS/MS.
3.4.4 BuChE bindingscapaciteit aan met antilichamen gecoate beads
Om erachter te komen hoeveel BuChE gebonden wordt aan met antilichaam gecoate beads werd een bindingscapaciteitstest gedaan. Hiervoor werden nieuw gecoate beads gebruikt en “oude” beads. Deze beads zijn al eerder gebruikt en zijn al in contact geweest met pepsine. Er werd getest of deze beads opnieuw BuChE kunnen isoleren uit plasma en hoeveel dit dan is. Door het plasma te testen op BuChE activiteit afname kan bepaald worden hoeveel BuChE de beads binden.
Er werd opnieuw 100l beads gecoat met anti-BuChE en uiteindelijk overgebracht in MQ (100l), batch 3. Van batch 3 werd 25l beads gebruikt voor de bindingscapaciteitstest. Naast de beads van batch 3 werd ook 25l “oude” beads van batch 1 gebruikt. De beads van batch 3 en de “oude” beads van batch 1 (25l) werden door middel van het KingFisher programma overgebracht in blanco plasma (200l). Na afloop van het programma werden de beads uit de KingFisher opstelling gehaald en opgeslagen in DPBST in de koelkast. Daarnaast werd het plasma, uit de KingFisher opstelling, overgebracht in een schoon epje. Van de twee plasmamonsters (1. Plasma na incubatie beads van batch 3; 2. Plasma na incubatie “oude” beads van batch 1) en één plasma controle (blanco plasma) werd 10l verdund met 90l DPBS. Uit deze verdunning werd 5l gebruikt voor de Ellman methode. De Ellman methode werd uitgevoerd in een 96 wells plaat door bij het monster BuSChI (800mM in MQ; 100l) en DTNB (800mM in 20mM kalium-natriumfosfaatbuffer; 100l) toe te voegen. De monsters werden 20 minuten lang om de minuut gemeten met de spectrofotometer. De ruwe data werd uitgewerkt met behulp van Microsoft Excel.
3.4.5 Regenereren van de met antilichamen gecoate beads
Uit de bindingscapaciteitstest is niet duidelijk naar voren gekomen of de beads die in contact zijn geweest met pepsine nog BuChE kunnen opnemen. Er werd verwacht van niet. Daarom werd er getracht de beads te regenereren door BuChE op een milde manier van de beads af te spoelen zonder dat de antilichamen en proteïne G coating van de beads meekomt. Door de beads met drie verschillende elutiemiddelen te incuberen wordt er gekeken welk elutiemiddel alleen BuChE van de beads afspoelt. Hierna wordt er getest of de beads nogmaals BuChE kunnen opnemen. Dit zou betekenen dat de beads hergebruikt kunnen worden.
Pagina | 18 Van batch 3 werd 75l beads gebruikt. Per 50% GB geremd plasmamonster (200l) werd 25l beads geïncubeerd middels het KingFisher programma. Na afloop van het programma werden de beads overgebracht in een schoon epje. Het plasma uit de KingFisher opstelling werd bewaard in de koelkast. Uit de bindingscapaciteitstest is gebleken dat niet alle BuChE uit het plasma wordt geïsoleerd, hierdoor kan het plasma later nogmaals gebruikt worden. De drie porties van 25l beads werden op drie verschillende manieren behandeld om de gebonden BuChE van de beads af te elueren. De drie portie beads werden 1,5 uur geïncubeerd met pepsine oplossing (251,4mg/ml 0,63% mierenzuur; 75l), glycine oplossing (50mM; pH 2,8; 75l) en met NaCl (1000mM) in DPBS (75l) in een waterbad van 37⁰C. Na de incubatie werd het supernatant overgebracht in een schoon epje en opgeslagen in de koelkast (1e isolaat). De beads werden driemaal gewassen met DPBS (100l). Na het wassen werd er opnieuw MQ (25l) aan de beads toegevoegd. De 25l beads (van alle drie de samples) werden opnieuw in de KingFisher opstelling gepipetteerd. Ook werden de drie 50% geremde plasmamonsters, die opgeslagen waren in de koelkast, opnieuw in de KingFisher opstelling gepipetteerd. Nadat het programma afgelopen was werden de beads overgebracht in een schoon epje en opnieuw 1,5 uur geïncubeerd in een waterbad met pepsine oplossing, glycine oplossing en NaCl in DPBS (75l). Het supernatant werd na incubatie overgebracht in een schoon epje en opgeslagen in de koelkast (2e isolaat).
De volgende dag werden de 6 monsters klaargemaakt voor de LC-MS analyse:
1e Pepsine isolaat van BuChE
1e Glycine isolaat van BuChE
1e NaCl in DPBS isolaat van BuChE
2e Pepsine isolaat van BuChE
2e Glycine isolaat van BuChE
2e NaCl in DPBS isolaat van BuChE
Alleen uitgevoerd voor de isolaten van glycine en NaCl in DPBS:
De isolaten werd overgebracht in Microcon Ultra 10kD cut off filters en 10 minuten gecentrifugeerd bij 11000rpm. De filters werden driemaal gespoeld met 0,6% mierenzuur (500l) met tussen elke spoeling een centrifugestap van 10 minuten bij 11000rpm. Na het spoelen werd het residu overgebracht in een schoon epje. Aan het residu werd pepsine oplossing (251,4mg/ml 0,63% mierenzuur; 75l) toegevoegd en 1,5 uur geïncubeerd in een waterbad van 37⁰C.
Hierna werden alle monsters (inclusief de isolaten van pepsine) over gebracht in Microcon Ultra 10kD cut off filters en 20 minuten gecentrifugeerd bij 11000rpm. De monsters werden naar de LC-MS afdeling gebracht voor verder analyse met LC-TSQ-LC-MS/LC-MS.
