Projectnr.: 417.0000
Ontwikkeling van snelle microscopische screeningsmethoden voor de bepaling van de identiteit, zuiverheid, samenstelling van agrarische produkten en/of aanwezigheid van schadelijke bestanddelen hierin
Rapport 94.1 0
MICROSCOPISCHE IDENTIFICATIE VAN MAïSBIJPRODUKTEN
drs. W.J.H.J. de Jong, V.G.Z. Pinckaers en J.J.M. Vliege
Afdeling: Microbiologie & Biotechniek
OlA~~
fc(l
u.j
,_fo
C)
~0 , eN-_-
•
-DLO-Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land-en tuinbouwprodukten (RIKILT-DLO) Bornsesteeg 45, 6708 PD Wageningen
Postbus 230, 6700 AE Wageningen Telefoon 08370-75400
Copyright 1 994, DLO-Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten. Overname van de inhoud is toegestaan mits met duidelijke bronvermelding.
VERZENDLIJST
INTERN: directeur auteur(s)
programmaleiders
public relations en secretariaat (2x) bibliotheek (4x)
leesplanken (2x)
EXTERN:
Dienst Landbouwkundig Onderzoek Directie Wetenschap en Technologie
Directie Internationale Agrarische Aangelegenheden (Ir. W.J.G. Laan) Belastingdienst, Laboratorium (Drs. G.J. Sluis, Drs. T. Knol)
Ministerie van Financiën, Directie Douane (Dhr. C.E. de Jong) Produktschap Veevoeder (Ing. J. den Hartog)
LABCO (Dhr. H.J. Bokhorst) Hendrix' Voeders (Dhr. J. Zegers)
ABSTRACT
Microscopische identificatie van maïsbijprodukten
Microscopical identification of corn by-products (in Dutch)
Report 94.1
o
W.J.H.J. de Jong, V.G.Z. Pinckaers and J.J.M. Vliege
State lnstitute tor Quality Control of Agricultural Products (RI KIL T-DLO) P.O. Box 230, 6700 AE Wageningen, the Netherlands
6 figures, 0 tables, 2 annexes, 22 pages, 14 raferences
April 1994
Microscopical techniques are useful tor the identification of animal feed stuffs. In this report a survey is given of microscopical identification of widely used corn by-products as corn gluten feed, corn germ meal and corn distillers dried grains. Relevant information is given of the origin, structure and characteristic features of these products. Based on the results of the microscopical examinations an identification method is presented.
Keywords: corn by-products, corn gluten feed, corn germ meal, corn distillers dried grains, microscopical identification.
INHOUD
SAMENVATIING
1 INLEIDING
2 OVERZICHT MAïSBIJPRODUKTEN (DEFINITIES) 2.1 Maïsglutenvoer
2.2 Maïskiemschroot
2.3 Maïsbostel (brouwerijafval) en afvallen van de branderijen 2.4 Maisbijprodukt verkregen bij de winning van ethanol
3 MATERIAAL EN METHODEN 3.1 Monstermateriaal
3.2 Methoden van onderzoek 3.2.1 Monstervoorbereiding 3.2.2 Microscopisch onderzoek
4 RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1 Maïsglutenvoer
4.2 Maïskiemschroot
4.3 Maïsbostel (brouwerijafval} en afvallen van de branderijen 4.4 Maïsbijprodukt verkregen bij de winning van ethanol
5 CONCLUSIE
LITERATUUR
BIJLAGEN
I. DIAGRAMMEN VAN DE PRODUKTIE VAN MAÏSBIJPRODUKTEN
3 4 4 5 7 8 9 9 10 10 10 11 11 14 17 19 20 20
11.
CORN BY-PRODUCTS- DETERMINATION OF THE IDENTITY, ESTIMATION OF THE COMPOSITION OF MIXTURES - MICROSCOPICAL METHODSAMENVATIING
Maïsbijprodukt en zoals maïsglutenvoer, maïskiemschroot en maïsbostel zijn belangrijkeveevoedergrondstof -fen. Op grond van wettelijke regelingen worden aan deze produkten met name bij import eisen gesteld ten aanzien van de identiteit, zuiverheid, botanische en chemische samenstelling. De samenstelling van maisbijprodukten heeft namelijk consequenties voor de heffing bij invoer in het kader van de EG-heffingsregelingen. De eisen waaraan de produkt en moeten voldoen staan vermeld in EEG-Verordeningen en Richtlijnen, in het Tarief van Invoerrechten en in de Toelichting hierop. In het rapport worden deze eisen voor ieder maïsbijprodukt afzonderlijk gegeven zodat ieder produkt duidelijk gedefiniëerd is.
Door middel van microscopisch onderzoek kunnen maïsbijprodukten geïdentificeerd worden en kan worden vastgesteld of ze aan de gestelde eisen (definities) voldoen. Deze identificatie wordt zowel stereomicroscopisch (vergroting 8* tot 40*) als microscopisch (vergroting 160* en 400*) uitgevoerd. Bij het microscopisch onderzoek wordt gebruik gemaakt van verschillende insluitmiddelen en reagentia. Aan de hand van specifieke morfologische, anatomische en histologische kenmerken vindt de determinatie van karakteristieke bestanddelen plaats. Een beschrijving van deze waarnemingen gecombineerd met botanische gegevens uit de literatuur wordt per produkt weergegeven.
Maïsbijprodukten bestaan uit verschillende botanische bestanddelen, zodat een onderscheid tussen de produktendoor middel van microscopisch onderzoek mogelijk is. Hoofdelement van maïsglutenvoer is de aanwezigheid van maïszemelen met gluten, van maïskiemschroot die van de ontvette kiembestanddelen, van maïsbostel de aanwezigheid van gistcellen en van het bijprodukt van de ethanolbereiding die van de zemelen met gluten en gistcellen.
Op grond van de beschrijving van de botanische samenstelling van maïsbijprodukten is een methode opgesteld voor de identificatie hiervan. Het betreft hier de semikwantitatieve bepaling (schatting) van de samenstelling van mengsels van verschillende maïsbijprodukten.
1 INLEIDING
Maïsbijprodukten zijn afvalprodukten die overblijven bij de verwerking van maïs zoals bij de bereiding van zetmeel (maïsglutenvoer), bij de bereiding van maïskiemolie (maïskiemschroot) of bij de bereiding van alcohol uit maïs (maïsbostel). Alcohol wordt ook bereid uit maïszetmeel waarbij het residu wordt toegevoegd aan maïsglutenvoer (maïsglutenvoer met gist) (Bijlage 1).
Deze bijprodukten worden in de veevoederindustrie toegepast als graanvervangende grondstoffen. Van oudsher worden maïsbijprodukten heffingvrij geïmporteerd uit de Verenigde Staten maar ook uit Zuid Afrika en Brazilië.
In april1991 trad Verordening (EEG) 315/91 in werking waarbij aan afvallen van de winning van maïskiemolie (maïskiemschroot) strengere eisen ten aanzien van de identiteit en zuiverheid gesteld werden [1]. Op basis van deze eisen omvat maïskiemschroot dan nog uitsluitend produkten, die bestaan uit bestanddelen van maïs die aan het oliewinningsproces hebben deelgenomen. Maïskiemschroot waaraan bestanddelen zoals gebroken maïs en/ of maïszemelen zijn toegevoegd moeten worden aangemerkt als bereid diervoeder waarop invoerheffing van toepassing is. Deze Verordening heeft geleid tot een toename van het monsteronderzoek van door de Douane bemonsterde partijen maïsbijprodukten bij invoer met name van maïskiemschroot maar vooral van maïsglutenvoer.
Bij het microscopisch identiteitsonderzoek van monsters maïsglutenvoer werd bij een aantal hiervan vastgesteld, dat deze voor een belangrijk deel uit maïskiemafvallen bestonden ( > 50% ontvette maïskiemen). Het produkt veranderde daardoor van karakter van maïsglutenvoer tot een mengsel van verschillende maïsbijprodukten en werd onderhevig aan een importheffing. Gezien deze financiële consequenties is het zinvol om een goede beschrijving van het microscopisch onderzoek van maïsbijprodukten vast te leggen in een rapport.
Om binnen de EEG te komen tot een uniforme microscopische identificatie van maïsbijprodukten is verder een methode beschreven die als bijlage is toegevoegd (Bijlage 11).
Bij de identificatie van maïsbijprodukten is het van belang dat ze zowel wat betreft botanische samenstelling als morfologisch van elkaar te onderscheiden zijn. Ze dienen bovendien te voldoen aan de wettelijke definities en omschrijvingen, zoals die ondermeer worden vermeld in de door de EEG vastgestelde Richtlijnen [1 0) en in de Toelichting op de Indeling in het Tarief van Invoerrechten [11]. Bij de microscopische identificatie wordt daarbij nagegaan of de monsters van maïsbijprodukten voldoen aan de gestelde criteria (definities).
Ten aanzien van de eisen die gesteld worden aan de chemische gehalten waaraan de bijprodukten moeten voldoen, wordt het onderzoek uitgevoerd door het Laboratorium van de Belastingdienst te Amsterdam. Het Laboratorium is tevens belast met de advisering van de Tariefpostindeling in de Gecombineerde Nomenclatuur (GN-code). Maïsbijprodukten dienen bij invoer te voldoen aan de bepalingen die bij deze indeling van toepassing zijn. De heffing bij invoer wordt hierop gebaseerd.
2 OVERZICHT MAïSBIJPRODUKTEN (DEFINITIES)
2.1 Maïsglutenvoer
In de EEG-lijst met de belangrijkste ingrediënten die voor de bereiding van mengvoeders worden gebruikt, wordt maïsglutenvoer als volgt gedefinieerd:
Maïsglutenvoer is het gedroogde bijprodukt van de bereiding van maïszetmeel dat bestaat uit zemelen en gluten, waaraan bestanddelen van het weekwater, en eventueel de kiem, waaraan olie kan zijn onttrokken, mogen zijn toegevoegd {10}.
In de GN-Toelichting (EG) bij Tariefpost 23.03 "Afvallen van de zetmeelbereiding• wordt over het produkt maïsglutenvoer {punt 3} [11) het volgende vermeld:
Deze onderverdeling omvat de als maïsglutenvoer (corn gluten feed) aangeduide produkten, die in het algemeen een proteïnegehalte (stikstof x 6,25) hebben van ten minste 20 gewichtsprocenten en voornamelijk bestaan uit deeltjes van de zaadhuid en van het endosperm, alsmede uit maïsgluten en eventueel uit ingedikt zwelwater van maïs; al deze bestanddelen zijn bijprodukten van de winning van zetmeel uit maïs. Deze produkten kunnen afvallen bevatten die zijn ontstaan bij de winning van olie uit maïskiemen verkregen door middel van de natte methode.
Deze onderverdelingen omvatten eveneens bovenomschreven produkten die zijn samengeperst in de vorm van pellets.
Deze onderverdelingen omvatten uitsluitend de produkten waarvan het zetmeelgehalte, berekend op de droge stof, niet meer dan 28 gewichtsprocenten bedraagt, overeenkomstig de met110de opgenomen in Bijlage I, onder nummer 1, van Richtlijn 72/199/EEG (PB nr. L 123, p.6) en waarvan het vetgehalte, berekend op de droge stof, niet meer dan 4,5 gewichtsprocenten bedraagt, overeenkomstig werkwijze A opgenomen in Bijlage I van Richtlijn 84/4/EEG (PB nr. L 15, p.28).
Produkten met een hoger zetmeelgehalte of vetgehalte dienen, naar gelang van het geval, in het algemeen te worden ingedeeld onder hoofdstuk 11 of onder post 23.02 of 23.09. Dit geldt eveneens voor goederen
die produkten bevatten die zijn verkregen uit maïs met gebruikmaking van een andere methode dan die gebruikt bij de vervaardiging van zetmeel door middel van de natte methode (afvallen verkregen bij het zeven van maïskorrels; gemalen hele maïskorrels; afvallen ontstaan bij de winning van de olie uit maïskiemen, verkregen door middel van de droge methode; enz.).
Ingedikt zwelwater van maïs wordt, ongeacht het proteïnegehalte, onder onderverdeling 2303 1090 ingedeeld [11 ).
Voor de microscopische identificatie van maïsglutenvoer is het dus van belang dat het produkt hoofdzakelijk bestaat uit zemelen, endosperm en gluten, eventueel met ingedikt zwelwater. Alle bestanddelen moeten afvallen zijn van de produktie van zetmeel met de natte methode. Het produkt mag geen maïsvreemde bestanddelen bevatten of maïsprodukten die niet afkomstig zijn van de bereiding van maïszetmeel volgens de natte methode. Het produkt mag maximaal 50% ontvette maïskiemen bevatten.
2.2 Maïskiemschroot
Maïskiemschroot en ook maïskiemschilfers zijn beide bijprodukten van de bereiding van maïsolie uit maïskiemen. Het verschil tussen schroot en schilfers berust op de bereidingswijze van de olie. Als de olie is verkregen door een chemische bewerking (extractie) van de maïskiemen spreekt men van schroot en als de olie is verkregen door een mechanische bewerking van de maïskiemen (persen of wringen) spreekt men van schilfers. In geëxtraheerde produkten is het vetgehalte meestallager (ruw vet < 4% in de droge staD dan in geperste produkten (ruw vet
> 4% in de droge
staD. Overigens worden aan beide produkten dezelfde eisen gesteld zodat een onderscheid bij de identificatie niet gemaakt hoeft te worden. Daarnaast is er nog een onderscheid voor wat betreft de bereidingswijze van de maïskiemen. De maïskiemen kunnen zijn verkregen door het natte procédé bij de bereiding van maïszetmeel of door het droge procédé bij de bereiding van maïsgries. Ook hier worden aan beide produkten dezelfde eisen gesteld. In het vervolg wordt onder maïskiemschroot ook verstaan maïskiemschilfers, zowel van het droge als natte procédé.In de EEG-Lijst met de belangrijkste ingrediënten voor de mengvoederbereiding [1 0) worden voor maïskiemschroot en voor maïskiemschilfers de volgende definities gegeven:
Maïskiemschroot is het bijprodukt van de winning van olie door extractie uit de droge of natte verwerking verkregen maïskiemen, en waaraan eventueel nog delen van het endosperm en de zaadhuid hechten. Malskiemschilfers is het bijprodukt van de winning van olie door persing uit de droge of natte verwerking verkregen malskiemen, en waaraan eventueel nog delen van het endosperm en de zaadhuid hechten [10).
In de GN-Toelichting (EG) [11) wordt bij post 23.06 het volgende vermeld:
De onderverdeling 2306 9091 omvat de afvallen die overblijven bij de winning van maïskiemolie (door middel van extractie met oplosmiddelen of door persen) van - langs de natte weg (zetmeelfabricage)
of langs de droge weg (griesmeelfabricage) verkregen- maïskiemen.
Voor de indeling onder deze onderverdeling moeten deze produkten de volgende gehaltes hebben, berekend in gewichtsprocenten op de droge stof:
1. Voor de produkten met een vetgehalte van minder dan 3 gewichtsprocenten:
-zetmeelgehalte: minder dan 45 gewichtsprocenten
-proteïnegehalte (stikstof x 6,25): 11,5 of meer gewichtsprocenten;
2. Voor de produkten met een vetgehalte van 3 of meer, doch niet meer dan 8 gewichtsprocenten:
-zetmeelgehalte: minder dan 45 gewichtsprocenten
- proteïnegehalte (stikstof x 6,25): 13 of meer gewichtsprocenten.
Deze afvallen mogen voorts geen bestanddelen bevatten die niet van de maïskorrel afkomstig zijn. Voor de bepaling van het zetmeel- en proteïnegehalte zijn de methodes van toepassing die zijn omschreven in Richtlijn 72/199/EEG (PB nr. L 123, p. 6) en voor de bepaling van het vetgehalte en het vochtgehalte de methodes omschreven in Richtlijn 71 /393/EEG (PB nr. L 279, p. 7).
De produkten die niet aan bovengenoemde criteria voldoen, worden al naar gelang het geval, in het algemeen ingedeeld onder hoofdstuk 11 of onder post 23.02 of 23.09.
Van belang is hierbij ook nog de aanvullende aantekening op hoofdstuk 23 onder 2:
Onderverdeling 2306 9091 omvat uitsluitend de afvallen verkregen bij de winning van maïskiemolie,
met uitzondering van produkten waaraan bestanddelen afkomstig van de maïskorrel die het
o/iewinningsproces niet hebben ondergaan, zijn toegevoegd {2}.
Voor de microscopische identificatie is het van belang dat het maïskiemschroot uitsluitend bestaat uit residuën die zijn verkregen bij de produktie van maïskiemolie. Produkten waaraan bestanddelen van maïs zijn toegevoegd die niet hebben deelgenomen aan het oliewinningsproces zijn uitgesloten. Maïskiemschroot bestaat uit afvallen van de produktie van maïskiemolie uit maïskiemen (door extractie of persing), maïskiemen verkregen bij het natte proces (zetmeelfabricage) of bij het droge proces (maïsgriesfabricage). Het bestaat hoofdzakelijk uit ontvette maïskiemen en zemelen. De zemelen bevatten geen aanhechtende gluten. Een minimale hoeveelheid kiemen die aanwezig moet zijn is (nog) niet vastgesteld. Uit bovenstaande omschrijvingen blijkt dat zowel maïskiemschroot als maïskiemschilfers uit het natte proces zowel als uit het droge proces aan de zelfde eisen moeten voldoen zodat een onderscheid tussen die produkten niet noodzakelijk is.
2.3 Maïsbostel (brouwerijafval) en afvallen van branderijen
De definities van gedroogde bierbostel en gedroogde spoeling (afvallen van de branderijen) in de EEG-Lijst met de belangrijkste ingrediënten voor de mengvoederbereiding luiden:
Gedroogde bierbostel is het bijprodukt van de brouwerij verkregen door het drogen van de residuen
van gemoute en ongemoute granen en andere zetmeelhoudende produkten.
Gedroogde (graan)spoeling is het bijprodukt van de alcoholdistilleerderij, verkregen door het drogen van de vaste residuen van gegiste granen.
Donkere gedroogde (graan)spoeling is het bijprodukt van de distilleerderij, verkregen door het drogen van de vaste residuen van gegiste granen, waaraan een deel van de spoelingsiroop of geëvaporeerde draf is toegevoegd [10}.
In de Amerikaanse literatuur spreekt men van corn distil/ers dried grains,distillers dried grains en van distil/ers dried grains with solubles [ 12].
In de GS-Toelichting (IDA) onder post 23.03 wordt ten aanzien van maïsbostel vermeld:
Post 23.03 (onder E) omvat ondermeer afval van brouwerijen en van branderijen (stokerijen). Hiervan
kunnen in het bijzonder worden genoemd:
1. Bostel, ook wel draf genoemd, bestaande uit het residu van het moutbeslag, dat overblijft nadat het
wort is afgetrokken; 2.
-1-3.
-1-4. Spoeling en dergelijke afvallen van het distilleren van alcohol uit graan, zaden, aardappelen, enz.
s.
-I-Zowel nat als gedroogd blijven deze produkten onder deze post ingedeeld.
Deze post omvat eveneens de vorenomschreven produkten in de vorm van pellets [11}.
Bij bovengenoemde produkten gaat het dus om afvallen die verkregen worden door drogen bij een
matige temperatuur van resten van het graan, zoals deze achterblijven bij de alcohol, gist of bierbeiding.
Door de Association of American Feed Control Officials (AAFCO) wordt het bijprodukt van de bereiding van alcohol uit granen als volgt omschreven (12]:
Gedroogde graanspoeling ( distil/ers dried grains) wordt verkregen na de verwijdering van ethylalcohol door distillatie uit met gist gefermenteerd graan of een graanmengsel, door scheiding van de overblijvende graanfractie van de hele spoeling (stillage) en door het drogen met methoden die in de distilleerindustrie
van granen worden toegepast. Het meest voorkomende graan b.v. ma i's geeft zijn naam aan het produkt.
Donkere gedroogde graanspoeling ( distil/ers dried grains with solubles) wordt verkregen na de verwijdering van ethylalcohol door distillatie uit met gist gefermenteerd graan of graanmengsel door condensatie
en drogen van tenminste 3/4 van de vaste stoffen van de overblijvende hele spoeling met methoden
die in de distilleerindustrie van granen worden toegepast. Het meest voorkomend graan bijvoorbeeld rnai's geeft zijn naam aan het produkt {12].
Maïsbostel en afvallen van branderijen zijn dus bijprodukten van een fermentatieproces waarbij gist is gebruikt. Ze bevatten naast gefermenteerde bestanddelen van granen dan ook veel gistcellen.
2.4 Maïsafbijprodukt verkregen bij de produktie van ethanol
Naast de zogenaamde "distillers dried grains• die uit diverse granen kunnen bestaan zoals mengsels van maïs, tarwe en sorghum komt ook een afvalprodukt voor dat bestaat uit maïsglutenvoer en gistcellen.
Dit afvalprodukt kan het beste omschreven worden als maïsbijprodukt verkregen bij de produktie van
ethanol. Het betreft hier maïsglutenvoer met resten van het zwelwater dat afkomstig is van de
ethanolbereiding. Gezuiverd zetmeel - verkregen uit het natte proces waarbij maïsglutenvoer als bijprodukt
ontstaat -wordt door koken en vervolgens toevoegen van enzymen {a-amylase en glucoamylase) omgezet
tot glucose. Aan de glucose-oplossing wordt gist {Saccharomyces) toegevoegd en vergist tot alcohol. Bij dit vergisten wordt maïszwelwater toegevoegd als noodzakelijk groeimedium. Na distillatie van de alcohol wordt het residu bestaande uit water, opgeloste stoffen uit het zwelwater en gistcellen {zogenaamde
fermented corn extractives) over het maïsglutenvoer gesproeid. Het mengsel wordt vervolgens ingedampt
en gedroogd.
Dit verklaart waarom maïsglutenvoer bereid in zetmeelfabrieken - die ook alcohol produceren als een van hun belangrijkste produkten - kan worden onderscheiden van maïsglutenvoer uit een niet -alcoholproducerende fabriek en wel door de aanwezigheid van "minimale" hoeveelheden dode gistcellen (13).
Het produkt wordt door de Amerikaanse producenten hetzelfde gedefiniëerd als maïsglutenvoer: Gom gluten feed is that part of commercial shelled corn that remains after the extraction of the larger
portion of the starch, gluten, and germ by processes employed in the wet milling manufacture of corn
starch or syrop. ft mayor may not contain one or more of the fol/owing: fermented corn extractives,
Vooruitlopend op een wettelijke regeling voor de indeling van dit produkt in het Tarief van Invoerrechten (2] is er door de EEG (DG XXI) een regeling getroffen met betrekking tot de invoer van maïsglutenvoermeel. Deze regeling houdt het volgende in:
Maïsglutenvoer als bedoeld in aanvullende aantekening GN1 op hoofdstuk 23 van de gecombineerde
nomenclatuur mag mede zijn samengesteld uit:
- resten van het zeven van mars tot een hoeveelheid van 15 gewichtsprocenten, en/of
- resten van zwelwater van mars van de natte methode en gebruikt bij de produktie van alcohol of andere
derivaten van zetmeel, door fermentatie van glucose.
Van belang is verder dat de kwantitatieve microscopische bepaling van maïskiemafvallen en van de
resten van het zeven van mars voorlopig niet zal worden toegepast tot dat onderzoek heeft plaats gevonden
naar de geschiktheid van deze methode [14}.
De regeling is slechts bedoeld om problemen bij de invoer van het maïsbijprodukt van de ethanolbereiding
te voorkomen. Een definitieve uitspraak of het produkt gerekend moet worden tot een bijprodukt van
de zetmeelbereiding (maïsglutenvoer), een bijprodukt van de alcoholbereiding of mogelijk een mengsel
van beide produkten is nog niet gedaan. Het onderzoek naar de geschiktheid van de microscopische
methode houdt in dat aan de hand van een ringtest zal worden nagegaan of deze methode (zie Bijlage)
als referentiemethode binnen de EEG kan worden toegepast.
Voor de microscopische identificatie van het maïsbijprodukt van de ethanolbereiding is de aanwezigheid
van dode gistcellen kenmerkend (13). Als het produkt wordt beschouwd als maïsglutenvoer, is het van belang dat het bestaat uit maïszemelen, endosperm en gluten met eventueel ingedikt zwelwater. Alle
bestanddelen moeten afvallen zijn van de produktie van zetmeel volgens het natte procédé. Het produkt mag geen maïsvreemde bestanddelen bevatten of maïsprodukten die niet afkomstig zijn van de bereiding
van zetmeel volgens het natte procédé. Het produkt mag maximaal 50% ontvette maïskiemen bevatten
(zie ook 3.1. 1 ). De aanwezigheid van gistcellen is in dit geval van ondergeschikt belang.
3 MONSTERMATERIAAL EN METHODEN
3.1 Monstermateriaal
Bij het ontwikkelen van microscopische methoden voor de identificatie van maïsbijprodukten is gebruik
gemaakt van praktijkmonsters afkomstig van het Laboratorium van de Belastingdienst te Amsterdam.
Deze monsters werden aan het RIKILT-DLO aangeboden in het kader van de wettelijke controle van
diverse landbouwregelingen zoals het Tarief van Invoerrechten (2] en de Voorschriften die verband
3.2 Methoden van onderzoek
3.2.1 Monstervoorbereiding
Het laboratoriummonster wordt na zorgvuldig mengen verkleind tot een deelmonster van ongeveer 50 g. Dit deelmonsterwordt uitgespreid op een gladde droge ondergrond in een dunne laag en beoordeeld
op geur, kleur, vorm van de pellets, e.d. Hiervan wordt een analysemonstervan ongeveer 10 g genomen
volgens de uitkruismethode (4). Als het monster geheel of gedeeltelijk uit pellets bestaat moeten deze pellets eerst verkleind worden. Dit wordt uitgevoerd door in een mortier de pellets voorzichtig fijn te wrijven tot kleinere deeltjes. Deze methode van verkleinen van de pellets geeft minder fijne deeltjes of bloem dan het malen van de pellets met een molen. Zeer kleine deeltjes zijn namelijk moeilijker te identificeren met een stereomicroscoop.
Het analysemonster wordt vervolgens gezeefd in drie fracties: een grove fractie (> 355
pm,
een middelfijne fractie ( < 355.um,
> 250 .um) en een fijne of bloemfractie ( < 250 .um) (5).3.2.2 Microscopisch onderzoek
A Stereomicroscopisch onderzoek
De grove en middelfijne fractie van het monster worden onder de stereomicroscoop met geschikte vergrotingen (8* tot 50*) onderzocht. De deeltjes worden daarbij op hun uiterlijke fysische kenmerken (vorm, kleur, textuur, etc.) geïdentificeerd als deeltjes van maïsglutenvoer, maïskiemschroot of maïsbosteL De beschrijving van de karakteristieke kenmerken van deze deeltjes is te vinden in een aantal publikaties over dit onderwerp [6,7,8). In het geval er bestanddelen van verschillende maïsbijprodukten aanwezig
zijn, wordt er een semikwantitatieve schatting gemaakt in termen van hoofdbestanddeel >50%),
nevenbestanddeel (<50%), weinig (ca. 5%) en sporen (1 tot 3%) (zie bijlage 11).
Er wordt tevens vastgesteld of er onzuiverheden c.q. bestanddelen aanwezig zijn die niet van de maïskorrel
afkomstig zijn (maïsvreemde bestanddelen). Ook hiervan wordt een semikwantitatieve schatting gemaakt.
Indien er naar schatting meer dan 5% vreemde bestanddelen aanwezig zijn dient dit kwantitatief te worden vastgesteld door deze uit te zoeken en te wegen.
B. Microscopisch onderzoek
Onderzoek met de microscoop voor de bevestiging van de stereomicroscopische identificatie is meestal noodzakelijk. Een zeer geringe hoeveelheid monstermateriaal van de fijne fractie of deeltjes die men nader wil onderzoeken, worden op een aantal voorwerpglaasjes gebracht. Vervolgens wordt hieraan een paar druppels van een beperkt aantal reagentia of inbedmiddelen toegevoegd, voorzichtig gemengd
en na het aanbrengen van een dekglas onder de microscoop onderzocht met vergrotingen van 160*
en 400*. Toegepast worden ondermeer de volgende reagentia of inbedmiddelen:
Jood/kaliumjodide-oplossing (Lugoloplossing):
2 g kaliumjodide, 1 g jodium in 300 mi water. Dit reagens kleurt zetmeel donkerblauw of blauwviolet, eiwitten en gistcellen geel.
Kaliumhydroxide-oplossing:
25 g in 100 mi water. Hierin lost zetmeel grotendeels op (ophelderingsmiddel) zodat andere bestanddelen (celwanden, weefsels, gist) beter te herkennen zijn.
Oi! Red 0 -oplossing:
0,5 g Oil Red
o
in 1oo
mi 2-propanol. Hiermee kunnen vet en olie gekleurd worden.Chloraalhydraat-oplossing:
80 g chloraalhydraat in 50 mi water. Ook hierin lost zetmeel op zodat de cellelulaire structuren duidelijker
kunnen worden waargenomen. Een kleine hoeveelheid materiaal wordt hierbij gesuspendeerd in enkele
druppels chloraalhydraat en vervolgens voorzichtig verhit tot kookpunt. Na afkoelen worden enkele
druppels chloraalhydraat als inbedmiddel aan het preparaat toegevoegd.
Het microscopisch onderzoek van maïsbijprodukten begint met een onderzoek bij een vergroting van 160* naar diagnostisch bruikbare elementen. Bij de identificatie kan relevante literatuur geraadpleegd
worden [6, 7,8,9]. Verder kan bij de identificatie gebruik worden gemaakt van preparaten van produkten
waarvan de identiteit is vastgesteld (standaardmonsters).
4 RESULTATEN EN DISCUSSIE
4.1 Maïsglutenvoer
Stereomicroscopisch onderzoek:
Maïsglutenvoer is een licht tot donker bruin produkt dat meestal in de vorm van vrij brosse pellets voorkomt. Karakteristiek is de aromatische gluten-achtige geur. Soms is de geur enigszins gebrand en zuur, maar
niet muf of anderszins onfris.
Stereomicroscopisch zijn de volgende kenmerken van maïsglutenvoer vast te stellen. Het produkt bestaat grotendeels uit zemelen, waaraan maïseiwitten (gluten) kleven [Fig.1). Mogelijk is dat naast deze gluten
ook gedroogd zwelwater aanwezig is. Deze deeltjes zijn lichtgeel tot bruin van kleur. Verder bevindt
zich op de zemelen vaak nog een laagje wit tot grijs poederachtig stof. Dit zijn kluitjes maïszetmeeL
Door het weken bij de bereiding van zetmeel zijn de zemelen gezwollen en door het drogen zijn ze
soms donker bruin tot zwart verkleurd, vooral aan de randen. Ook in mengsels zijn deze zemelen goed
te herkennen.
Soms komen ook losse glutendeeltjes voor. Dit zijn kleine ronde goudgele ondoorzichtige korreltjes
met een knobbelig oppervlak. De carotenoïden uit de maïskorrels hebben zich opgehoopt in de gluten
waardoor de intensieve gele kleur wordt veroorzaakt.
Verder kunnen nog endospermdeeltjes voorkomen. Deze zijn gedeeltelijk helder geel (hoornendosperm)
en gedeeltelijk wit (meelendosperm). Indien het vrij hoekige deeltjes zijn, betreft het zeer waarschijnlijk
maïsgries (uit screenings of schoningsafvallen) dat aan het maïsglutenvoer is toegevoegd. Volgens
de omschrijving van maïsglutenvoer is het toevoegen van deze screenings volgens de omschrijvingen
van het produkt niet toegestaan [ 10, 11). Het is echter bijzonder moeilijk om met zekerheid vast stellen
of deze deeltjes wel of niet aan het bereidingsproces van zetmeel volgens het natte procédé hebben
deelgenomen. Zijn de endospermdeeltjes sterk afgerond en minder glanzend dan is dit maïsendosperm
dat zeer waarschijnlijk aan het bereidingsproces van de maïsglutenvoer heeft deelgenomen.
Als gemalen geëxtraheerde kiemen zijn toegevoegd, dan zijn deze onder de stereomicroscoop waar te nemen. Deze kiemen zijn licht tot donkerbruin gekleurd, vrij mat, afgeplat aan de boven en onderzijde, afgerond aan de zijkanten en meestal in enkele stukken gebroken. Aan de vorm en kleur zijn deze kiembestanddelen goed te herkennen. Ze lijken enigszins op kleine knopen. Maïsglutenvoer mag tot 50% van deze kiembestanddelen bevatten [Fig.2].
Fig.2 Maïsglutenvoer: geëxtraheerde gebroken kiemdelen (20*).
Andere bestanddelen die in geringe mate voor kunnen komen zijn zogenaamde tip-caps. Dit zijn trechtervormige verhoute deeltjes afkomstig van de maïskolf op de plaats waar de korrel aan de spil gehecht is geweest. Andere delen van de kolf kunnen eveneens voorkomen. Het zijn harde verhoute gele onregelmatige deeltjes maar soms ook sponsachtige deeltjes uit de kern van de maïsspiL Het is mogelijk dat ongeschoonde maïs is gebruikt bij de bereiding van het maïsglutenvoer.
Verder bevinden zich soms dunne rode bliezen (schutblaadjes of bracteeën) in het produkt eveneens afkomstig van screenings.
Microscopisch onderzoek:
In het jood/kaliumjodide-preparaat kleuren de maïszetmeelkorrels donkerblauw. Ze zijn poly-edrisch met een doorsnede van 15 tot 20 Jlm. Ze bezitten kernspleten, die in een jodiumpreparaat niet goed
zichtbaar zijn. Een deel van de korrels is gezwollen tot ca. 25 11m of meer.
Zowel aan de maïszemelen gekleefd als los komen kleine bruine eiwitdeeltjes voor. Het betreft hier
eiwit dat vermoedelijk voor een deel uit gluten bestaat en voor een deel afkomstig is van het gedroogde
maizwelwater.
In het loog-preparaat en in het chloraalhydraat-preparaat tossen de maïszetmeelkorrels grotendeels
op zodat de celstruktuur van de diverse fragmenten beter zichtbaar wordt. De maïszemeldeeltjes zijn
onregelmatig van vorm en hebben scherpe randen. Ze zijn dubbelbrekend in gepolariseerd licht. De maïszemel is ca. 100 11m dik en bestaat uit meerdere lagen. De buitenste laag (epicarp) bestaat uit langwerpige cellen van ca. 250 11m lang en ca. 30 11m breed met veel stippels. Daaronder bevinden
zich ongeveer twaalf lagen overeenkomstige cellen met sterk verdikte wanden met stippels (mesocarp).
Het binnenste gedeelte van het mesocarp bestaat uit twee tot vier lagen dwarscellen. Deze langwerpige
cellen zijn dwars op de lengterichting van de andere cellagen georiênteerd. De dwarscellen zijn vertakt
en niet gestippeld. Daaronder bevindt zich een enkele laag buiscellen (endocarp). Deze cellen zijn onvertakt, niet gestippeld en hebben een kleine diameter (2 tot 9 11m). De daaronder liggende zaadhuid (testa) is een membraan zonder cellulaire struktuur. Ook het perisperm is indien aanwezig niet cellulair. Aan de zemel bevindt zich vaak nog een deel van de aleuronlaag, die niet tot de zaadhuid maar tot het endosperm behoort. Deze laag bestaat uit bijna vierkante cellen met een doorsnede van ongeveer
25 11m met een sterk verdikte gladde celwand. In een chloralhydraat-preparaat komen soms steencellen voor die afkomstig zijn van de tip-caps en de verhoute delen van de spil.
Belangrijkste kenmerk van maïsglutenvoer:
Maïszemelen met de aangehechte gluten en eitwitdeeltjes die mogelijk afkomstig zijn van het gedroogde maïszwelwater en de maïszetmeelkorrels zijn karakteristiek voor maïsglutenvoer.
De gedroogde ontvette kiemen die mogelijk aanwezig zijn worden onder 3.2.2 beschreven
4.2 Maïskiemschroot
Stereomicroscopisch onderzoek:
Maïskiemschroot afkomstig van de natte verwerking van maïskiemen is lichtgeel tot geelbruin van kleur. De geur is karakteristiek fris, licht graanachtig, niet zuur muf of ranzig of anderszins onfris. Zij bevatten slechts kleine hoeveelheden van de andere bestanddelen van de maïskorrel zoals zemelen en endospermdelen. Maïskiemschroot van de droge verwerking kan zeer verschillend van kleur zijn. Stereomicroscopisch zijn de volgende bestanddelen in maïskiemschroot vast te stellen. Het produkt bestaat uit ontvette kiemdeeltjes. Deze zijn lichtgeel tot donkerbruin. Vooral de donkere deeltjes zijn
sterk vervormd zodat macroscopisch moeilijk is vast te stellen of het om kiemdeeltjes gaat. Het zijn
Fig. 3 Maïskiemschroot donkere en lichte geêxtraheerde kiemdelen (20*).
Meestal is een groot aantal zemelen aanwezig. Deze zijn mat witgrijs en semitransparant Er ontbreken aanhechtende glutendeeltjes. Het produkt bevat soms weinig hoornendosperm (maïsgries) en meelendosperm en verder weinig tip-caps, rode bliezen (bracteeên) en gedeeltelijk ontvette kiemen. Doordat in EEG-verband is vastgelegd dat het produkt maximaal 8% ruw vet, maximaal 45% zetmeel en minimaal13% ruw eiwit moet bevatten (zie 3.1.2) behoeven op grond van deze criteria niet alle produkten die als maïskiemschroot zijn aangegeven, volledig uit ontvette maïskiemen te bestaan. Microscopisch onderzoek van met name Braziliaanse maïskiemafvallen toont aan dat niet alle kiemen volledig ontvet zijn. In sommige kiemdelen kan nog relatief veel vet worden aangetoond. Door met een pincet op deze kiemdelen te drukken is dit stereomicroscopisch waar te nemen als glanzende kleine vetdruppeljes. Hoewel het produkt gemalen is bestaat toch de indruk dat verschillende maïsprodukten samen gevoegd zijn waaronder gedeeltelijk ontvette kiemen. Door het betrekkelijk lage eiwitgehalte dat is toegestaan is ook het gehalte aan eiwitrijke kiembestanddelen niet hoog.
Microscopisch onderzoek:
De maïskiem bestaat uit het scutellum (schildje) en de eigenlijke kiem. De kiem (radicula, hypocotyl en plumula) bestaat uit rijen dunwandige rechthoekige kleine cellen met een embryonaal karakter [Fig.4].
Voor de microscopische identificatie van kiembestanddelen is vooral het scutellum belangrijk. In een
loog-preparaat of chloraalhydraat-preparaat zijn de weefsels hiervan duidelijk waarneembaar. De buitenste
laag van het scutellum bestaat uit cylindrische palissadeachliga epidermiscellen tot 60 f..lm lang en waarvan de buitenste tangentiale wand duidelijk verdikt is. De rest bestaat uit grote isodiametrische cellen van
15 tot 80 f..lm doorsnede met verdikte en duidelijk gestippelde wanden. Ze bevatten bij niet ontvette
produkten olie en verder aleuronkorrels en verschillende hoeveelheden zetmeelkorrels. De zetmeelkorrels
zijn in een jood/kaliumjodide-preparaat of in gepolariseerd licht duidelijk waar te nemen. Ze zijn maar
circa 8 f../m in doorsnede en dus kleiner dan de zetmeelkorrels uit het meel-of hoornendosperm waarvan
de doorsnede in het algemeen bij 15 tot 20 f..lm ligt (6]. Met behulp van een Oil Red 0 -preparaat is vast te stellen of in het kiemweefsel nog olie aanwezig is in de vorm van oliedruppeltjes. De weefsels
waaruit de zemelen bestaan, de zetmeelkorrels, tip-caps en bliezen zijn al beschreven bij maïsglutenvoer (3.2.1). In een jood/kaliumjodide-preparaat is een groot aantal zetmeelkorrels waarneembaar. Deze korrels zijn meestal niet gezwollen of verstijfseld.
Belangrijkste kenmerk van maïskiemschroot
Maïskiemschroot bevat een groot aantal ontvette kiembestanddelen geel tot donkerbruin van kleur.Aan de witte matte semitransparante zemelen hechten geen glutendeeltjes.
4.3 Maïsbostel {brouwerijafval) en afvallen van de branderijen
Stereomicroscopisch onderzoek:
De kleur van maïsbostel is bruin tot donkerbruin. De geur is vaak scherp en karakteristiek voor gefermenteerd graan. Het ruikt enigszins verbrand en moutachtig. De samenstelling van gedroogde
bostel kan sterk variëren afhankelijk van de toegepaste graansoorten en van de hoeveelheid spoeling of geëvaporeerde draf (distillers solubles) die is toegevoegd. Met veel gedroogde spoeling is het produkt
donkerbruin en bevat het veel roodbruine en zwarte vaak afgeronde deeltjes en bolletjes (donkere
graanspoeling). Bij weinig gedroogde spoeling overheerst het vezelachtig materiaal (maïsendosperm,
zemelen) en is het produkt lichter van kleur. Een deel van de zemelen is licht gekruld of opgerold. Sommige zemelen hebben een typische metaalachtige glans. Aan de zemelen kleven vaak zwarte tot roodbruine
deeltjes. Deze deeltjes komen ook los voor. Ze zijn meestal vrij zacht en gemakkelijk fijn te drukken.
Behalve echte maïsbostel, die uitsluitend uit maïs bestaat, zijn er ook produkten die bestaan uit mengsels
van maïs, sorghum (milocorn), tarwe of gerst. Macroscopisch kan een onderscheid gemaakt worden aan de hand van de zemelstruktuur van deze granen (6-9).
Microscopisch onderzoek:
Voor de microscopische identificatie van maïsbostel is vooral het onderzoek van de gedroogde spoeling van belang. In het jood/kaliumjodide-preparaat van de roodbruine of zwarte spoelingdeeltjes zijn naast eiwitrijke bestanddelen vaak gistcellen waar te nemen. Het betreft hier zowel kluitjes gistcellen als losse
cellen. Deze zijn ovaal, circa 5 pm lang en vertonen soms knopvorming. Het betreft hier dode gist, wat met een vitaalkleuring bijvoorbeeld met een 0,1% methyleenblauwoplossing is vast te stellen. De gistcellen zijn afkomstig van het fermentatieproces. De zetmeelkorrels zijn vaak gezwollen. Er is in het algemeen
betrekkelijk weinig zetmeel aanwezig. Op de zemelen kleven vaak grote aantallen gistcellen die in het jood/kaliumjodide-preparaat geelbruin kleuren. Het onderscheid met de glutendeeltjes die in maïsglutenvoer aan de zemelen kleven is zeer duidelijk.
In het Oil Red 0-preparaat blijken de gedroogde spoeling deeltjes veel vet of olie te bevatten [Fig.5).
De structuur van de zemelen, aleuronweefsels, en de zetmeelkorrels kan worden gebruikt als diagnostisch
Fig.S Gedroogde bostel (Distillers dried grains): tarweharen met oliedruppeltjes {160*, Oil Red 0).
Vooral aan de hand van de morfologische kenmerken van de zemelen zijn de verschillende graansoorten te identificeren. Zo is tarwebostel met name door de aanwezigheid van de tarweharen (het baardje)
en aan de vorm en grootte van de zetmeelkorrels in gedroogde spoeling vast te stellen [Fig.S). Voor de overige morfologische kenmerken van de verschillende granen kan worden verwezen naar de bestaande vakliteratuur (6-9).
Belangrijkste kenmerken van maïsbostel:
Naast de typische scherpe geur en de roodbruine tot zwarte vethoudende bolletjes de aanwezigheid
4.4 Maïsbijprodukt verkregen bij de winning van ethanol
Stereomicroscopisch onderzoek
Zoals onder 3.1.4 reeds is vermeld bestaat dit produkt uit maïsglutenvoer met resten van het zwelwater dat afkomstig is van de ethanol bereiding. Het produkt heeft dezelfde geur en kleur als maïsglutenvoer. Stereomicroscopisch is het produkt niet te onderscheiden van maïsglutenvoer.
Microscopisch onderzoek
De zetmeelkorrels en zemelen met aanhechtende glutendeeltjes komen overeen met die van maïsglutenvoer (3.2.1}. Kenmerkend voor dit produkt is alleen de aanwezigheid van veel gistcellen. Vooral in een jood/kaliumjodide-preparaat waarin deze gistcellen bruin kleuren, zijn ze duidelijk waar te nemen [Fig.6]. De hoeveelheid gistcellen die bijvoorbeeld aan de zemelen vast zit, varieert nog al per deeltje.
Fig.6 Maïsbijprodukt van de ethanolbereiding: gistcellen (licht en klein) en maïszetmeelkorrels (donker en groot) (jood/kaliumjodide, 160*).
Belangrijkste kenmerk van het maïsbijprodukt verkregen bij de ethanolbereiding:
Microscopisch zijn maïszemelen met aanhechtende gluten en veel gistcellen vast te stellen.
5 CONCLUSIE
Uit het morfologisch, anatomisch en histologisch onderzoek van maïsbijprodukten i. c. maïsglutenvoer, maïskiemschroot, maïsbostel en het bijprodukt van de ethanolbereiding kan worden vastgesteld dat deze produkten uit verschillende botanische bestanddelen bestaan. Door microscopisch onderzoek is de identiteit van maïsbijprodukten vast te stellen.
Gebaseerd op de belangrijkste hoofdelementen is het volgende onderscheid te maken:
*
maïsglutenvoer wordt gekenmerkt door de gezwollen maïszemelen met de aanhechtende gluten;*
maïskiemschroot bevat een relatief groot aantal ontvette kiembestanddelen, aan de semitransparante zemelen hechten geen glutendeeltjes;*
maïsbostel wordt gekenmerkt door de typische scherpe geur en door de aanwezigheid van roodbruine tot zwarte vethoudende bolletjes en grote hoeveelheden gistcellen;*
voor het maïsbijprodukt verkregen bij de ethanolbereiding zijn de maïszemelen met gluten (maïsglutenvoer) en gistcellen het meest karakteristiek.Voor het vaststellen van de samenstelling van mengsels van bovengenoemde maïsbijprodukten is een semikwantitatieve methode opgesteld (zie Bijlage 11) die nog in EEG-verband door een ringtest met een aantal Douanelaboratoria zal worden gevalideerd.
LITERATUUR
1. Verordening (EEG) Nr. 315/91 van de Commissie tot wijziging van Verordening (EEG)
nr.
2658/91van de Raad met betrekking tot de tarief- en statistieknomenclatuur en het gemeenschappelijk douanetarief.
PB Nr. L 37 (1991) 24.
2. Boekwerk Heffingen bij Invoer, Deel IJ. Naamlijsten en Tarieven. Uitgave Ministerie van Financiën (1994) Hoofdstuk 23.
3. Boekwerk Heffingen bij Invoer, Deel IV.
Voorschriften verband houdende met landbouwheffingen en -restituties.
Uitgave Ministerie van Financiën {1993}.
4. RSV A0678: Diervoeders - Reductie van het laboratoriummonster tot analysemonster ten behoeve van het microscopisch onderzoek. RIKILT-DLO, 28
editie (1994}.
5. RSV A0679: Diervoeders -Monstervoorbereiding voor het microscopisch onderzoek. RIKILT-DLO,
28
editie (1994}.
6. Mészáros, L., F. Deutschmann (eds.) Methodenbuch Band XI
Atlas für die Mikroskopie von Nahrungsgrundstoffen und Futtermitteln; Teil I: Ölsaaten und deren Verarbeitungsrückstände.
Verlag J. Neumann-Neudamm, Melsungen-Berlin {1975} 50,117.
7. Mészaros, L., E. Bihler (eds.) Methodenbuch Band XI
Atlas für die Mikroskopie von Nahrungsgrundstoffen und Futtermitteln: Teil 11: Stärkereiche Nahrungsgrundstoffe und deren Verarbeitungsprodukte, Grünmehle, Obsttrester, Braunalgen u.a.
Verlag J. Neumann-Neudamm, Melsungen-Berlin (1983} 16-22,136 -144.
8. Manual of microscopical analysis of feedstuffs.
The American Association of Feed Microscopists (eds.) Second edition, (1978} 5-27.
9. Gassner, G.
Mikroskopische Untersuchung pflanzlicher Lebensmittel. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, (1989) 40-43.
10. Richtlijn 92/87/EEG tot vaststelling van een niet-exclusieve lijst van de belangrijkste ingrediënten die voor de bereiding van mengvoeders voor andere dieren dan huisdieren gewoonlijk worden
gebruikt en in de handel gebracht.
11. Boekwerk Heffingen bij Invoer Deel 111.
Toelichtingen en Beslissingen.
Uitgave Ministerie van Financiën (1 994) Hoofdstuk 23.
12. Association of American Feed Control Officials (AAFCO). Official PubHeation (1 981) 114, 121.
13. Corn Refiners Association, lnc., Washington.
Background Paper: Feed Coproducts of corn-based Alcohol Production, altachment 2 (1992).
14. Haverkamp, H.C.
Shelled corn
I
CLEANERSSTElPTANKS---~S~Ie~e~p~v~,a
~
le
~
r
---
---~~STEEPWATER
I
EVAPORATORS Germ GEiSEPARATORS---~~~:~CTORS
~~~rn
GRINDING MILLSI
Bran (fiber) WASHING SCREEN S---r-__:_-..:,\.~I
CENTRIFUGAL Gluten SEPARATORS~ STA}CH WASHING!
Slarch and Corn
nulrlllve gluten sweelenert meal Dletary fiber Corn germ me al Corn gluten leed Condensed Iermenled corn extracllves (sleep llquor)
Fig. 1: BEREIDING VAN MAïSZETMEEL MET ALS BIJPRODUKTEN MAïSGLUTENVOER EN MAïSKIEM
-SCHROOT.
CORN
l
tStoopwaterlSTEEP T A N K S - - - + - - - . - - - -- - - } EVAPORA TION f - - - - .
l
{Fiber and Gorm FlakelI
MILLING'STAACH WASHING---41 SWEETENER ----~ FEAMENTATION
1 ClNVERSION
l
REFINING DISTILLA TION----~---____J
C RN GLUTEN FEED
STARCH SlEETENERS ALOHOL
Fig. 2: GLUCOSE-PRODUKTIE EN FERMENTATIEPROCES METALS BIJPRODUKT MAïSGLUTENVOER
MET GIST.
BIJLAGE 11:
CORN BY-PRODUCTS-DETERMINATION OF THE IDENTITY, ESTIMATION OF THE COMPOSITION OF MIXTURES - MICROSCOPICAL METHOD
1 Scope and field of application
This methad specifies a microscopical methad tor the determination of the identity and composition of animal feeding stuffsin particular corn by-products. The methad requires microscopical identification of the isolated corn particles and therefore requires a specialist who has sufficient experience in this type of identification and who is experienced in microscopical techniques.
2 Definitions of corn by-products
2.1 Corn gluten feed: dried by-product of the manufacture of corn starch. lt is composed of bran and gluten to which components of the steeping liquor, and possibly the germ, trom which the oil may have been removed, may be added [1].
2.2 Corn germ meal: by-product of oil manufacture, obtained by pressing (expeller) or by extraction (extracted) of dry or wet processed corn germ to which parts of the endosperm and testa may still adhere (1 ).
2.3 Distillers' dried grains: by-product of alcohol distilling obtained by drying solid residues offermented grain (i.c. corn) [ 1].
2.4 Corn gluten feed with steepwater: by-product ofthe manufacture of corn starch with residues coming
trom the glucose termentalion consisting of steepwater, solubles and spent yeast (2].
3 Principle
Crush and sieve a test portion. ldentify the plant fragments with a stereomicroscope. Confirm the identification using microscopical techniques. Estimate the amount of fragments typical tor corn gluten feed, corn germ meal, corn disUilers and others.
4 Reagents
All reagents shall be of analytica! quality.
4.1 lodine/potassium iodide solution: 2 g potassium _jodide, 1 g iodine in 300 mi distilled water. 4.2 Sodium hydroxide solution: 25 g/1 .
4.3 Sudan glycerin: 1 g sudan 111 in 50 mi ethanol 96% and 50 mi glycerin.
4.4 Oil red 0: 0,5 g oil red 0 in 100 mi 2-propanol.
4.5 Chloralhydrate solution: 80 g chloralhydrate in 50 mi distilled water.
5 Apparatus
Usual Iabaratory equipment.
5.1 Stereomicroscope, with magnification 1 0* to 50*.
5.2 Microscope, and accessories.
6 Sampling and general observations
Mix the Iabaratory sample thoroughly. Reduce the sample to a workable size of about 50 g. ldentify the appearance of the product(s), odour, colour and shape of the pellets, etc. Make a test sample by spreading out the sample on a flat plate, quartering and taking diametrically opposed quarters until the required amount (5 to 1 0 g) is obtained.
Samples in pellet farm must be crushed coarsely in a medium sized mort ar with a pestle. Th is methad of crushing produces less fine particles than grinding. Fine particles can hardly be recognised with a stereomicroscope.
7 Procedure
7.1 Sisving the test sample
Sieve the test sample through a set of sieves (5.3) into three fractions: coarse, middle and fine or flour fraction. Brush gently the coarse and middle fractions through the meshes of the sieves. The separation of the fine particles is necessary because they mostly cover the greater particles and make them unrecognisable.
Bring each of the three fractions (coarse, middle and fine) separate on a preparatien dishor petri-dish.
7.2 Delerminatien
7.2.1 Stereo-microscopical identification
Examina the coarse fraction and middle fraction of the sample under the stereomicroscope with appropriate magnifications. ldentify the particles by their outward physical characteristics (shape, colour, partiele size, texture, etc.) (3,4,5] as corn gluten feed, corn germ meal or distillers' dried grains.
Examine the sample also on screenings/cleanings of corn, impurities and/or non corn particles ( adulteranis and contaminants).
In case of mixed produels record the name(s) of the ingredient(s) and make an semi-quantitative estimation of their quantity in terms of main ingredient (more than 50%), secondary ingredient (lesser than 50%) or impurities (little, about 1 0%; very little, about 5%; traces, about 1 - 3%).
7.2.2 Microscopical confirmatien
Examinatien with the microscope for confirmatien of the stereomicroscopical identification is mostly necessary. Place a smal! amount of the fine fraction on a glass slide, and a
tew
drops of mounting medium, mix wel! by stirring with a smal! spatula and spread the material over the slide. Aft er a treatment with a reagent the mount is examined with a microscope by magnifications of 160* and 400*. lodine/potassium iodide salution (4.1) turns starch into deep blue or blue violet colour, proteins and yeast cells yellow.Sodium hydroxide salution (4.2) dissolves starch (clearing agent).
Sudan glycerin (4.3) and Oil Red
0
salution (4.4) turns fat in a red colour.Chloral hydrate salution (4.5) dissolves starch so that cellular structures may be seen clearly. A smal! amount of the material is heated gently in chloral hydrate salution on a slide. The material is mounted in the chloral hydrate salution in which it is prepared.
Microscopical identification of corn by-products could be started by studying under low and high magnification the diagnostic useful elements. The analist must be acquainted with the general morphology of cereals and with the essentials of plant histology. lf there is any doubt about the identity of the elements relevant literature could be consulled (3,4,5,6] and preparations of known ingredients could be made.
The following schedule is designed as an aid to the identification of corn by-products by diagnostic useful elements.
I
lngredientI
Product nameBran with gluten particles Corn gluten feed
Reddish-brown globules with glossy bran, yeast Distillers' dried grains
cells
Defatted germs, Corn germ meal
bran without gluten
Bran with gluten, Corn gluten feed
bran without gluten,
defatted germs < 50%
Defatted germs > 50%, Mixture of corn germ meal and corn
bran with gluten, gluten feed
bran without gluten
Defatted germs > 50%, Mixture of corn germ meal and distillers'
bran with yeast cells
Bran with gluten, Corn gluten feed and sleepwater of
bran without gluten, ethanol production
yeast cells
Bran with gluten, Corn gluten feed and
bran without gluten, sleepwater of ethanol
defatted germs <50%, production
yeast cells
Defatted germs > 50%, Corn germ meal, corn gluten feed and
bran with gluten, sleepwater of ethanol production
bran without gluten, yeast cells
6.3 Number of determinations
Two different test portions trom the same test sample should be examined by different microscopists. Both results should correspond. By disagreement make then new estimations.
7 Test report
The test report of straight corn products shall mention the name of the product in according to the definitions of the Harmonized System (7): corn gluten feed, corn germ meal or corn distillers. The test report tor compound corn produels shall mention the narnes of the individual produels and an estimation of their individu al quantities in termsof main ingredient (more than 50%}, secondary ingredient (lesser than 50%} and/or impurities (little, about 1 0%; very little, about 5%; traces, about 1-3%}.
Raferences
1. Commission Directive 92/87 /EEC establishing a non-exclusive list of the main ingredients normally
used and marketed tor the preparatien of compound feedingstuffs intended tor animals other than
pets. (NoL 319/19/1992).
2. Background paper: Feed coproducts of corn-based alcohol production. Publ. by Corn Refiners Association, Washington D.C. {1992).
3. Methodenbuch Band XI.
Atlas für die Mikroskopie
von
Nahrungsgrundstoffen und Futtermitteln;Teil
1:
Ölsaaten und deren Verarbeitungsrückstände.Bearbeitet
von
L.
Mészáros und F. Deutschmann. Verlag J. Neumann-Neudamm, Melsungen, Berlin{1975).
4. Methodenbuch Band XI.
Atlas für die Mikroskopie von Nahrungsgrundstoffen und Futtermitteln;
Teilll: Stärkereiche Nahrungsgrundstoffe und deren Verarbeitungsprodukte, Grünmehle., Obsttrester,
Braunalgen u.a.
Bearbeitet van
L.
Mészáros und E. Bihler. Verlag J. Neumann-Neudamm, Melsungen, Berlin {1983).5. Manual of microscopical analysis of feedstuffs. Second edition. The American Association of Feed
Microscopists {1978).
6. Gassner, G. Mikroskopische Untersuchung pflanzlicher Lebensmittel.
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart {1989).
