Opzetten en optimaliseren moleculaire
diagnostiek thalassemieën
Versie: 4.0
Inlever datum: 12-10-2012
Uitvoeringsgegevens:
Periode: 02-04-2012 t/m 02-10-2012
Naam: Laurens de Haas l.d.haas@elisabeth.nl
St. Elisabeth Ziekenhuis
Projectbegeleider: Mevr. Dr. B. Jakobs b.jakobs@elisabeth.nl
Opdrachtbegeleider: Mevr. Drs. J. Roijers j.roijers@elisabeth.nl
Stagementor: Dhr. B. Wieggers b.wieggers@elisabeth.nl
Stagebegeleider: Dhr. A. Lazaar a.lazaar@elisabeth.nl
Organisatie: Klinisch Chemisch en Hematologisch Laboratorium
Afdeling: Moleculaire Diagnostiek
Plaats: Tilburg
Instelling: St. Elisabeth Ziekenhuis Hilvarenbeekseweg 60 5022 GC Tilburg 013 - 539 13 13
Avans hogeschool
Stagebegeleider: Peter van den Broek pjm.vandenbroek@avans.nl
Opleiding: Biologie & Medische Laboratorium onderzoek
Voorwoord
Het Klinisch Chemisch en Hematologisch Laboratorium en Trombosedienst (kortweg KCHL) van het St. Elisabeth Ziekenhuis bestaat uit de laboratoria in het St. Elisabeth Ziekenhuis, het TweeSteden ziekenhuis Tilburg en het TweeSteden ziekenhuis Waalwijk. Naast materiaal geprikt in de verschillende ziekenhuizen, ontvangt het KCHL materiaal van ruim dertig prikposten in de regio Tilburg en Waalwijk. Van alle klinisch chemische laboratoriumaanvragen van de huisartsen uit de regio wordt negentig procent door het KCHL verwerkt.
Het belangrijkste onderzoeksmateriaal bij het KCHL is bloed. In het KCHL worden meer dan 400 verschillende testen uitgevoerd. Naast veelvoorkomende testen zoals de bepaling van bloedsuiker en cholesterol worden er screening gedaan naar ziektebeelden zoals hartfalen, leverziekten en tumoren. Veel chemische testen worden uitgevoerd op de robotstraat. De werkplek hematologie specialiseert zich in de cellen van het bloed. Voor diepgaander onderzoek zijn er de speciële werkplekken. Hier wordt o.a. moleculaire diagnostiek gedaan. Ook is het KCHL één van de vijf laboratoria in Nederland waar de hielprikjes van pasgeboren baby’s worden gescreend (neonatale screening). Zoals vele laboratoria heeft dit laboratorium verschillende specialismen waardoor zelfs patiëntenmateriaal van andere laboratoria in het land naar dit laboratorium wordt gestuurd.
De kwaliteit van de laboratiumtesten wordt bewaakt door de klinisch chemicus. Naast kwaliteitsbewaking verricht de klinisch chemicus wetenschappelijk onderzoek en adviseert in speciale gevallen een aanvragend arts bij de interpretatie van laboratoriumuitslagen.
De vraag naar moleculaire diagnostiek stijgt. Het genotype is namelijk de bouwtekening van het lichaam. Ziektes en afwijkingen die te verhalen zijn op genen, kunnen door middel van moleculaire diagnostiek vastgesteld worden. Verder kan met behulp van moleculaire technieken de kans op een genetische afwijking bij eventuele zwangerschappen vastgesteld worden. Een zogenaamd voorspellend DNA onderzoek. Farmacogenetica is het onderzoek van variaties in het DNA in relatie tot respons op geneesmiddelen. Met deze toepassing kan de reactie op bepaalde medicijnen voorspeld worden. Binnen de afdeling DNA-diagnostiek van het KCHL wordt DNA-onderzoek gedaan op 13 genen. Bij sommige genen wordt naar één enkele mutatie gekeken, terwijl bij andere genen de uitslagen van meerdere mutatieanalyses worden gecombineerd tot één totaal uitslag.
Dank gaat uit naar het KCHL waar dit project tot stand is gekomen. Met name de volgende personen zijn dank verschuldigd voor de realisatie en begeleiding van dit project: B. Jakobs, J. Roijers, B. Wieggers en A. Lazaar. Ook dank aan P. van den Broek voor de begeleiding vanuit Avans Hogeschool.
Inhoudsopgave
Voorwoord...1
Inhoudsopgave...2
Samenvatting...3
1 Inleiding...4
1.1 Diagnostiek van α-thalassemieën...4
1.2 Diagnostiek van β-thalassemieën...5
2 Theoretische achtergrond thalassemieën...6
2.1 α-thalassemieën...7
2.1.1 Demografie en frequentie...7
2.2 β-thalassemieën...10
2.2.1 Demografie en frequentie...12
3 Theoretische achtergrond technieken...14
3.1 DNA-isolatie...14
3.2 De Polymerase Chain Reaction...15
3.3 Gelelektroforese...16 3.4 Strip assay...17 4 Materiaal en methode...19 4.1 Multiplex-PCR...19 4.2 α-Globin StripAssay...19 4.3 β-Globin StripAssay...20 5 Resultaten...22 5.1 α-thalassemieën...22 5.2 β-thalassemieën...27 6 Kosten-batenanalyse...31 7 Conclusie en discussie...33 8 Aanbevelingen...35 Literatuurlijst...37 Bijlage 1...39 Bijlage 2...42
Samenvatting
Tot op heden wordt de moleculaire diagnostiek van α-thalassemieën uitgevoerd door afzonderlijke PCR’s in te zetten. Deze methode kost relatief veel tijd en materialen. Een efficiëntere methode voor deze assay is een multiplex-PCR. Een mutiplex-PCR is opgezet volgens het artikel Arnold S. -C. Tan et al. (2001) [1] en geoptimaliseerd. Om de werkwijze te optimaliseren is getest met het combineren van controles en het maken van een primerstock-oplossing. Het combineren van controles heeft als voordeel dat dit minder pipetteerwerk is en minder materiaal kost. De primerstock-oplossing heeft als voordeel dat de verschillende primers in één oplossing worden bewaard en deze kan worden gebruikt in de wekelijkse assay. Een andere mogelijkheid die ook is getest, is de primerstock-oplossing te verdelen over epjes waarbij één epje gebruikt kan worden voor een reactiemix en dit wordt dan maar eenmalig ingevroren en ontdooit. Het voordeel van een primerstock-oplossing is het reduceren van pipetteerwerk bij het inzetten van de analyses. Er wordt ook met minder kleine volumina gewerkt waardoor er minder variatie tussen de analyses zal zijn.
Naast de multiplex-PCR voor α-thalassemieën is de α-Globin StripAssay van ViennaLab getest. Deze strip assay zou een alternatief kunnen zijn voor de multiplex-PCR of voor aanvullend onderzoek kunnen worden gebruikt. Het resultaat laat zien dat de voorkeur naar de multiplex-PCR gaat. De strip assay kan als aanvullend onderzoek worden gebruikt als er geen afwijking wordt gedetecteerd in de multiplex-PCR. Echter bestaat de kans dat er mutaties zijn die de strip assay ook niet detecteert. De strip assay detecteert namelijk 21 van de 83 veel voorkomende α-globine mutaties, zie tabel 1. Het opsturen naar een ander laboratorium voor uitgebreid onderzoek blijft daarom een optie.
Naast het optimaliseren van de diagnostiek voor α-thalassemieën is ook een assay voor β-thalassemieën opgezet. Hierbij is gebruik gemaakt van de β-Globin StripAssay. Deze strip assay kent drie varianten namelijk: MED (voor het Mediterrane gebied), IME (voor India en het Midden-Oosten) en SEA (voor Zuid-Oost Azië). In West-Europa komen van origine nauwelijks thalassemieën voor. Er is geen kit gemaakt die zich richt op het deel van Europa waar Nederland toe behoort. Er zijn enkele onderzoeken gedaan [11,12] waarbij samples van patiënten met een β-thalassemie uit Nederland zijn geanalyseerd. Procentueel gezien detecteert de IME kit de meeste mutaties die gevonden zijn bij deze twee onderzoeken. Er zijn 29 samples met een mogelijke β-thalassemie geanalyseerd waarbij in 27 samples één of meer mutaties zijn gevonden. 26 van de 27 zijn met de MED kit gedetecteerd. Één sample werd niet gedetecteerd met de MED kit maar wel met de IME kit. Tevens is er één sample die met de MED kit is gedetecteerd maar niet zou worden gedetecteerd met de IME kit. In deze onderzoeksgroep ondervangen zowel de MED als de IME kit evenveel mutaties.
1 Inleiding
Op de afdeling moleculaire diagnostiek is de vraag of er een efficiëntere methode voor de moleculaire diagnostiek van α-thalassemieën mogelijk is en of een nieuwe methode geïmplementeerd kan worden die β-thalassemieën diagnosticeert op DNA-niveau.
Een thalassemie is een vorm van erfelijke bloedarmoede die ontstaat door een genetisch defect in het α- of β-gen van het hemoglobine. Het gevolg van dit defect is dat er te weinig hemoglobine wordt aangemaakt (hemoglobinopathie). Een belangrijke functie van het hemoglobine is het opnemen en loslaten van zuurstof. Een thalassemie heeft chronische bloedarmoede tot gevolg. Er zijn meerdere vormen van thalassemieën waarvan α-thalassemie en β-thalassemie de meest voorkomende zijn.
Thalassemieën zijn autosomaal recessieve aandoeningen. Patiënten worden met de ziekte geboren en kunnen niet genezen. Wereldwijd lijden miljoenen mensen aan thalassemieën. α-thalassemieën komen vooral voor in families die hun oorsprong hebben in Zuidoost-Azïe, India, China of de Filippijnen. β-thalassemie wordt vooral gevonden bij patiënten afkomstig uit gebieden rond de Middellandse Zee (Griekenland, Italïe en het Midden-Oosten) of die afkomstig zijn van Aziatische of Afrikaanse oorsprong.
Moleculaire diagnostiek maakt het mogelijk om bepaalde genetische defecten of eigenschappen aan te tonen. De term moleculaire diagnostiek is een verzamelnaam voor een aantal laboratoriumtechnieken die gebruik maken van nucleïnezuren (DNA of RNA). In de diagnostiek is steeds meer vraag naar een verklaring op DNA niveau.
Indien er een verdenking is van een α-thalassemie wordt met moleculaire technieken gericht gezocht naar grote deleties, terwijl bij verdenking van een β-thalassemie wordt gekeken naar kleine afwijkingen zoals puntmutaties, kleine inserties en kleine deleties in de genen die coderen voor het hemoglobine. Het genotype dat bekend wordt helpt bij het vaststellen van de diagnose van een patiënt.
De opbouw van dit rapport is als volgt. Hoofdstuk 2 beschrijft de theoretische achtergrond over thalassemieën waarbij in de paragrafen de demografie en frequentie van thalassemieën te vinden zijn. In hoofdstuk 3 is de theoretische achtergrond van de moleculaire technieken beschreven. In hoofdstuk 4 zijn de materialen en methoden te vinden die gebruikt zijn. In hoofdstuk 5 zijn de resultaten te vinden en in hoofdstuk 6 een kosten en batenanalyse. Hoofdstuk 7 bevat de conclusie en discussie waarna in hoofdstuk 8 de aanbevelingen zijn te vinden.
1.1 Diagnostiek van -thalassemieën
α
Het doel is het opzetten van een multiplex-PCR voor de diagnostiek van α-thalassemieën. Op dit moment wordt voor de diagnostiek van α-thalassemieën met 5 verschillende analyses gekeken naar de meest voorkomende deleties: -α3.7, -(α)20.5, -α4.2, --SEA, en --MED. Dit kan in één analyse door de primers te combineren in een multiplex-PCR. De assay moet beschikken over controle samples en een amplificatie controle.
In het artikel van Arnold S. -C. Tan et al. (2001) [1] is een multiplex PCR beschreven waarin naar 7 α-thalassemie deleties wordt gezocht. Deze methode wordt geoptimaliseerd voor het gebruik binnen het KCHL. Hierbij worden twee deleties buiten beschouwing gelaten omdat naar verwachting deze zelden voorkomen.
Naast het opzetten van deze multiplex-PCR wordt ook een strip assay van ViennaLab getest. Deze α-Globin StripAssay detecteert 21 α-globuline gen mutaties, waaronder de 5 deleties van de multiplex PCR.
1.2 Diagnostiek van -thalassemieën
β
Momenteel wordt aan de hand van het percentage HbA2 en het percentage HbF gekeken of er
aanwijzingen zijn voor een eventuele β-thalassemie. DNA-onderzoek naar β-thalassemieën wordt gedaan door het LUMC. Er wordt gekeken of dit onderzoek op de afdeling DNA-diagnostiek van het KCHL kan worden uitgevoerd. β-thalassemie omvat meer mutaties daarom is voor een strip assay gekozen.
Bij personen met verschillende etnische achtergronden komen andere mutaties voor. Het merk ViennaLab beschikt over vier verschillende strip assays voor β-thalassemieën. Op de verschillende strips zijn veelvoorkomende mutaties van een bepaalde bevolkingsgroep samengevoegd. Om de juiste strip te kiezen is het nodig door middel van literatuuronderzoek te bepalen welke etnische achtergronden er in Nederland veel voorkomen. Op deze manier kan de globale dekking van de strip assay worden bepaald.
2 Theoretische achtergrond thalassemieën
Een thalassemie is een erfelijke bloedziekte waarbij het lichaam onvoldoende en/of afwijkend hemoglobine aanmaakt. Normaal hemoglobine bevat vier eiwit ketens: twee α- en twee β-globines, zie figuur 1. Hemoglobine is een ijzerrijk eiwit in rode bloedcellen. Het vervoert zuurstof naar alle delen van het lichaam en voert koolstofdioxide af naar de longen, waar het wordt uitgeademd. De twee belangrijkste soorten thalassemieën, α- en β-thalassemieën, zijn vernoemd naar gebreken in deze eiwitketens.
Figuur 1: Een juiste balans tussen α-ketens en β-ketens
Thalassemie is een autosomaal recessieve aandoening. Patiënten worden met de ziekte geboren en kunnen alleen genezen door beenmergtransplantatie of stamceltherapie. Wereldwijd lijden miljoenen mensen aan thalassemieën.
In tegenstelling tot sikkelcelanemie is een thalassemie een kwantitatieve hemoglobinopathie. Sikkelcelanemie is een kwalitatieve hemoglobinopathie omdat het de structuur van het hemoglobine betreft. Bij een kwantitatieve hemoglobinopathie betreft het vooral het achterblijven van de productie van de hemoglobineketens. Er worden dan minder hemoglobinemoleculen van het type HbA0 (α2β2) aangemaakt met als gevolg een anemie.
Door een verminderde aanmaak van HbA0 zijn procentueel gezien andere Hb-typen verhoogd
zoals het HbF en HbA2. Alle vormen van thalassemieën kenmerken zich door:
Anemie (verlaagde Hb-concentratie);
Microcytaire (verlaagd MCV) en hypochromatische erytrocyten (verlaagd MCH en MCHC);
Morfologisch afwijkende erytrocyten (vaak targetcellen/schietschijfcellen);
Als compensatie worden er extra erytrocyten aangemaakt (verhoogd RBC en verhoogd aantal reticulocyten). [2]
In Nederland worden alle pasgeborenen getest op thalassemieën door het programma neonatale hielprikscreening. De landelijke coördinatie van het programma neonatale hielprikscreening is in handen van het Centrum voor Bevolkingsonderzoek (CvB) van het RIVM. In Nederland zijn in 2009 en 2010 gemiddeld 54 kinderen met een α-thalassemie en 8 kinderen met een β-thalassemie geboren. Ouders met een kinderwens kunnen laten onderzoeken in een laboratorium hoe groot de kans is dat ze een kind krijgen met een thalassemie. [2]
Van de snel groeiende, niet-westerse bevolkingsgroepen in Nederland is het merendeel afkomstig uit gebieden waar relatief veel thalassemieën voorkomen. In deze tropische en
subtropische gebieden heerst malaria of heeft malaria geheerst. Door verschillende onderzoeken is aangetoond dat er een verband is tussen malaria en thalassemieën. [3,4]
De samenstelling van de Nederlandse bevolking is de laatste 50 jaar sterk veranderd. Het aandeel niet-westerse 1e en 2e generatie allochtonen vertegenwoordigt in 2010 minstens 11%
van de Nederlandse bevolking. Deze bevolkingsgroepen zorgen voor een toenemende vraag naar diagnostiek op thalassemieën. [5]
2.1 -thalassemieën
α
Bij een α-thalassemie is er een verminderde synthese van de α-ketens. Hierdoor blijven er in verhouding meer β-ketens over en zullen minder en onvolledige hemoglobinemoleculen worden samengesteld.
De genen van de α-ketens liggen op chromosoom 16. Per chromosoom zijn twee genen aanwezig. In totaal zijn er dus vier genen (αα/αα), waarvan 2 van elke ouder, die zorgen voor de aanmaak van voldoende α-ketens. Indien één α-gen niet meer functioneert, wordt dat door een streepje weergegeven (-α/αα) met de naam α+-trait. Dit is een zeer milde vorm van een α-thalassemie. Wanneer van elke keten één gen defect is, wordt dit een homozygote α+-trait genoemd (-α/-α). De α0-trait heeft de combinatie --/αα. Deze twee vormen zijn mild en
resulteren in een lichte vorm van anemie. Bij een --/-α genotype is er een sterke overmaat aan β-ketens. Deze ketens kunnen precipiteren (Heinz-bodies) en er kunnen β4-type-hemoglobineketens (HbH) worden gevormd. Dit is een zeer ernstige vorm van α-thalassemie. Indien alle vier de α-genen niet meer functioneel zijn (--/--), wordt er geen functioneel hemoglobinemolecuul meer gevormd. Alle vier de α-genen ontbreken. Dit is niet met het leven verenigbaar en een kind overlijdt vlak voor of na de geboorte. [6]
De aanwezigheid van deleties kan door middel DNA-diagnostiek met behulp van primerparen worden aangetoond. Veel voorkomende deleties zijn: -α3.7, -α4.2, --SEA (South East Asian), -(α)20.5 en --MED (Mediteranian). De 83 meest voorkomende deleties/mutaties wereldwijd met betrekking tot de α-ketens zijn te vinden in bijlage 1.
2.1.1 Demografie en frequentie
α-thalassemieën hebben hun oorsprong voornamelijk in Azië. Maar ook in het Mediterrane gebied, in Afrika, in het Caribische gebied en in de Verenigde Staten komen α-thalassemieën voor. Gezien de huidige migratie van de wereldbevolking wordt men in toenemende mate ook in Nederland met deze ziekte geconfronteerd. Spit et al. (1992) [7], die de incidentie in Nederland voor thalassemie en hemoglobinopathieën beschrijft, concludeert dat deze ziekten hier meer voorkomen dan men voorheen vermoedde.
Nederland telde 1 januari 2010 16,6 miljoen inwoners. Een op de vijf inwoners behoort tot de allochtone bevolking. Onder allochtone bevolking worden hierbij ook kinderen verstaan waarvan één van beide ouders allochtoon is: de zogenoemde tweede generatie allochtonen. Nicolaas et al. (2010) [5]
Turken vormen de grootste allochtone herkomstgroep in Nederland, gevolgd door Indonesiërs en Duitsers. De helft van de anderhalf miljoen westerse allochtonen is van Indonesische of Duitse afkomst. In tabel 1 is de verdeling van de allochtone Nederlandse bevolking te zien. Tabel 1: Bevolking en bevolkingsgroei, 1 januari 2010 [5]
Aantal personen x 1 000 Groei sinds 1 januari 2000 x 1 000
Autochtonen 13 125 127
w.v. Polen 77 48 Roemenen 14 9 Bulgaren 15 13 Overig westers 1 395 65 Niet-westerse allochtonen 1 858 450 w.v. Turken 384 75 Marokkanen 349 87 Surinamers 342 40 Antillianen/Arubanen 138 31 Afghanen 32 9 Irakezen 52 19 Iraniers 39 17 Somaliers 27 -2 Overig niet-westers 495 174 Totaal 16 575 711
In de onderstaande kaart (figuur 2), is het gebied in Eurazië en Afrika te zien waar α-thalassemieën voorkomen.
Figuur 2: De verspreiding van α-thalassemieën over de continenten Eurazië en Afrika
Van Neerbos et al. (1996) [9] heeft onderzoek gedaan bij 42 patiënten met een microcytaire anemie waarbij geen aannemelijke oorzaak gevonden kon worden voor deze anemie. In het onderzoek uit het genoemde artikel is bij 21 patiënten een afwijking in het α-globine-gencluster gevonden waarbij in 19 gevallen met een PCR (Polymerase Chain Reaction) methode.
Ook Harteveld et al. (1997) [10] heeft een onderzoek gedaan bij 110 patiënten. Bij dit onderzoek is onderscheid gemaakt tussen populaties waarbij in tabel 2 de populatie uit Nederland en de totalen van de populaties (wereld) zijn meegenomen. De resultaten van deze
twee onderzoeken zijn samengevoegd in tabel 2 om een indruk te krijgen van hoe frequent bepaalde deleties en/of mutaties voorkomen.
Tabel 2: Demografie van α-thalassemieën in Nederland en de wereld Mutatie Aantal in % populatie: Ned. ** Aantal in % populatie: Ned. *** Aantal in % populatie: wereld *** Dekking strip assay **** Dekking m-PCR --SEA 70 * 20,5 ja ja --MED I * * * ja ja --MED II * * 1,5 - --(α)20.5 * * 2,3 ja ja -α3.7 30 33,3 61,4 ja ja -α4.2 * * 3,8 ja ja --DutchI * 8,3 0,8 - ---DutchII * 16,6 1,5 - --α3.7HbEvanston * * 0,8 - ---THAI * * * ja ---FIL * * * ja -HphI * 8,3 2,3 - -HbUtrecht cd 129 T>C * * 0,8 - -SacII * 16,6 0,8 - -PolyA(-AA) * * 0,8 -
-Constant Spring TAA>CAA * * 0,8 ja
-HbKurdistan * * 0,8 -
-HbGouda * 8,3 0,8 -
-Cd137pol * 8,3 0,8 -
-Cd14 G>A * * * ja
-HbAdana Cd59 G>A * * * ja
-anti-3.7 gene triplication * * * ja
-α2 ini cd [T>C] * * * ja -α2 cd 19 [-G] * * * ja -α2 IVS 1 -5nt * * * ja -α2 cd 59 [G>A] * * * ja -α2 cd 125 [T>C] (Hb Quong Sze) * * * ja -α2 cd 142 [T>A] (Hb Icaria) * * * ja -α2 cd 142 [A>T] (Hb Pakse) * * * ja -α2 cd 142 [A>C] (Hb Koya Dora) * * * ja -α2 poly A-1 [AATAAA>AATAAG] * * * ja -α2 poly A-2 [AATAAA>AATGAA] * * * ja -Procentuele dekking strip
assay 100 33,3 90,3 -
-Procentuele dekking m-PCR 100 33,3 88 -
-* Niet gevonden of niet op gezocht
** B.R. van Neerbos et al. (1996) α-Thalassemie, een vergelijkend onderzoek op DNA niveau [9] *** K.L. Harteveld et al. (1997) α-Thalassemia in The Netherlands: a heterogeneous spectrum of both
deletions and point mutations [10]
**** Dekking van deleties en mutaties door α-Globin StripAssay van ViennaLab [17]
In de tabel 2 is de dekking van de strip assay en de multiplex-PCR meegenomen. Deze technieken worden beschreven in hoofdstuk 3.
De informatie uit deze tabel welke uit artikelen komt wordt meegenomen in de conclusie en aanbevelingen. Bij het onderzoek van Van Neerbos zijn van de patiënten met een microcytaire anemie bij 40% geen deleties of mutaties gevonden. Het zou kunnen zijn dat een groot deel van deze mutaties niet gedetecteerd is aangezien bij dit onderzoek op relatief weinig deleties en mutaties is gescreend.
2.2 -thalassemieën
β
Bij β-thalassemieën is er sprake van een mutatie in het gen dat codeert voor de β-keten. De genen voor de β-ketens liggen op chromosoom 11. Twee genen (een van elke ouder) zijn verantwoordelijk voor de aanmaak van voldoende β-ketens. De mutaties zijn onderverdeeld in 3 groepen. Hierbij worden β-globine gen zonder een mutatie gecategoriseerd in ‘β’. Mutaties worden gecategoriseerd met ‘β+’ wanneer er een verminderde aantal β-ketens wordt aangemaakt. Mutaties worden gecategoriseerd als ‘βo’ wanneer geen functionele β-ketens worden aangemaakt.
De β-thalassemie wordt aan de hand van de klinische verschijnselen ook in drie groepen verdeeld namelijk: β-thalassemie-minor, β-thalassemie-intermediate en β-thalassemie-major. Zie tabel 3 voor een overzicht. De onderverdeling wordt veroorzaakt doordat de gevolgen per mutatie verschillend kunnen zijn en dus andere symptomen kunnen veroorzaken.
Tabel 3: Classificatie van β-thalassemieën
Thalassemie-minor
Alleen één van de allelen bevat een mutatie. De patient lijdt aan microcytaire anemie. Vaak wordt een lager MCV gedetecteerd van kleiner dan 80 fl en een verhoogde fractie van het HbA2 (>3.5%)
en een verlaging van de fractie HbA (<97.5%).
β+/β of
βo/β
Thalassemie-intermediate
Een intermediair tussen de major en minor vormen. De patiënt kan vaak een normaal leven leiden, maar hebben incidenteel
transfusies nodig bijvoorbeeld in tijden van ziekte of zwangerschap, afhankelijk van de ernst van de anemie.
β+/β+ of
βo/β
Thalassemie-major
Wanneer beide allelen thalassemie mutaties bevatten is er een ernstige microcytaire, hypochrome bloedarmoede. Onbehandeld veroorzaakt dit anemie, splenomegalie en ernstige
bot-misvormingen. Het vordert tot de dood voor de leeftijd van 20 jaar. De behandeling bestaat uit periodieke bloedtransfusies.
β+/βo of
βo/βo of
β+/β+
De minor variant heeft nog één functioneel β-gen (β+/β of βo/β). Intermediate heeft
verminderde functionele β-genen waardoor minder β-ketens worden gesynthetiseerd. Soms zijn dan beide genen gemuteerd maar is de verminderde hoeveelheid gesynthetiseerde β-ketens toch nog functioneel. De major variant heeft geen functionele β-genen waardoor geen eiwitketens geproduceerd worden. De patiënt is afhankelijk van bloedtransfusies. In tabel 3 is te zien dat de symptomen geen directe relatie hebben met de mutaties in de genen.
Bij verminderde β-keten synthese ontstaat relatief meer hemoglobine dat is samengesteld uit α-ketens en δ-ketens (type α2δ2 HbA2). Het percentage HbA2 stijgt tot boven de 3,5%
Aanwijzingen voor een β-thalassemie worden verkregen door een verhoogde HbA2 waarde.
Een AA-typering van het Hb in combinatie met een verhoogd percentage HbA2 pleit voor de
diagnose β-thalassemie. Dit kan bevestigd worden door middel van DNA-diagnostiek.
Bij een AS-typering is vaak het HbA2 verhoogd. Dit kan ten gevolge zijn van de sikkelceltrait.
Er is echter niet uit te sluiten of er dan ook nog een β-thalassemie aanwezig is. Ook wanneer er sprake is van een AE-typering is niet aan te tonen of er een β-thalassemie aanwezig is. HbE interfereert met HbA2 waardoor niet vastgesteld kan worden of deze verhoogd is.
In tabel 4 zijn 59 in Nederland veelvoorkomende genmutaties met betrekking tot de β-ketens te vinden.
Tabel 4: Frequentie van β-thalassemieën in Nederland met de dekking van de verschillende strips van ViennaLab
volgens Shirly Henderson et al.
(2009) ** volgens P.C. Giordano et al. (1998) *** Mutatie percentage MED IME SEA percentage MED IME SEA
-101 C -> T 0,5 0,5 * -90 C -> T 0,7 * -88 C -> A 0,7 * -88 C -> T 4,9 4,5 -87 C -> T 1,5 0,5 -87 C -> G 1,7 1,7 0,5 0,5 -31 A -> G * 0,5 -30 T -> A 0,2 0,2 * -29 A -> G 2,9 2,9 1,3 1,3 -28 A -> G * 0,9 +22 G -> A * 0,5 CD 5 -CT 1,9 1,9 1,9 3,6 3,6 3,6 CD 8 -AA 8,5 8,5 8,5 4 4 4 CD 8/9 +G 6,8 6,8 6,8 6,8 0,9 0,9 0,9 0,9 CD 8-9 +G * 0,5 CD 15 -T 0,2 * CD 15 -G 0,2 * CD 15 TGG ->TAG 0,2 0,2 0,2 1,8 1,8 1,8 CD 16 -C * 0,5 CD 17 AAG -> TAG 1,2 0,9 CD 19 A -> G * 0,5 IVS I-1 G -> A 3,6 3,6 3,6 3,6 3,6 3,6 IVS I-1 G -> T 1 1 1 1,8 1,8 1,8 IVS I,-1 G -> C (cd30) * 1,8 IVS I-2 T -> C * 0,5 IVS I-2 T -> G * 0,5 IVS I-2 T -> A * 0,5 IVS I-5 G -> A * 1,8 IVS I-5 G -> C 9,2 9,2 9,2 9,2 10,1 10,1 10,1 10,1 IVS I-5 G -> T 0,2 * IVS I-6 T -> C 1,9 1,9 1,9 2,7 2,7 2,7 IVS I-110 G -> A 11,2 11,2 11,2 9,8 9,8 9,8 CD 35 -C 0,4 2,2 CD 36/37 -T 0,4 0,4 0,9 0,9 CD 37/38/39 -7 nt 1 * CD 39 C -> T 15,3 15,3 15,3 17 17 17
CD 41/42 -TCTT 7,5 7,5 7,5 4,9 4,9 4,9 CD 47 +A * 1,3 CD 71/72 (+A) * 0,5 CD 76 -C 0,2 * CD 95 +A 0,2 0,2 * CD 123-125 (-ACCCCACC) * 0,5 IVS II-1 G -> A 9,4 9,4 9,4 9,4 2,2 2,2 2,2 2,2 IVS II-654 C -> T 2,7 2,7 4,1 4,1 IVS II-745 C -> G 1 1 1 3,6 3,6 3,6 IVS II-848 C -> A 0,2 0,2 * IVS II-849 A -> G * 0,5 IVS II-849 A -> C 0,2 * IVS II-850 G -> A * 0,5 CD 121 G -> T 0,2 0,2 1,8 1,8 Poly A (AATAAA -> AATGAA) 0,4 0,5 Poly A (AATAAA -> AATAGA) 0,2 0,9 619 bp deletion * 1,3 Dutch β0 deletion * 0,9 Gγ(Aγδβ) deletion * 0,5 εγδβ deletion * 0,5 14 -kb deletion * 0,5
ICD (ATG -> AGG) * 0,5
Totaal percentage 98,5 71,4 77,9 40,1 100,1 58 66,9 28,9 * niet gevonden of niet op gezocht
** Shirley Hendeson et al. (2009) Incidence of haemoglobinopathies in various populations – The impact of immigration
*** P.C. Giordano et al. (1998) The Moleculair Spectrum of Beta-Thalassemia and Abnormal Hemoglobins in the Allochtonous and Autochtonous Dutch Population
2.2.1 Demografie en frequentie
De oorsprong van β-thalassemieën bevindt zich vooral in het Mediterrane gebied. De volgende landen behoren tot het Mediterrane gebied: Spanje, Gibraltar, Frankrijk, Monaco, Italië, Malta, San Marino, het Vaticaan, Slovenië, Kroatië, Montenegro, Albanië, Bosnië en Herzegovina, Griekenland, Turkije, Cyprus, Syrië, Libanon, Israël, Palestina, Egypte, Libië, Tunesië, Algerije en Marokko. In figuur 3 is een kaart te zien van het Mediterrane gebied.
Figuur 3: Het Mediterrane gebeid
Met de β-Globin StripAssay MED™ (MED van Mediterraans), welke 22 β-globine gen mutaties detecteert, ondervangt meer dan 90% van de mutaties in Mediterrane landen [8]. Hieronder vallen Turkije en Marokko welke samen goed zijn voor 733.000 mensen [5]. Overige westerse allochtonen zijn er in Nederland 1.395.000, zie tabel 1. De grootste groepen westerse allochtonen zijn Polen, Bulgaren en Roemenen. Deze behoren niet tot de overige westerse allochtonen. Tot de overige westerse allochtonen behoren wel Europeanen die uit het Mediterrane gebied komen. Omdat de grootste groepen westerse allochtonen niet bij de overige westerse allochtonen behoren en niet uit het Mediterrane gebied komen, is de kans groter dat het percentage westerse allochtonen welke wel uit het Mediterrane gebied komen zoals Spanjaarden, Italianen, Grieken, Kroaten toeneemt. Hierdoor kan aangenomen worden dat van de 1.395.000 overige westerse allochtonen een groot deel uit het Mediterrane gebied komt.
Echter, wanneer gekeken wordt naar de mutaties die in Nederland voorkomen volgens Shirley Henderson (2009) [11] en Giordano (1998) [12], zijn er minder overeenkomsten met betrekking tot de Nederlandse bevolking dan de β-Globin StripAssay MED in verhouding met tabel 1 doet vermoeden. Sterker nog, de β-Globin StripAssay IME heeft zelfs een hogere procentuele dekking dan de β-Globin StripAssay MED, zie tabel 4.
Verschillende mutaties welke in tabel 4 voorkomen, komen ook voor op de kaart in figuur 7. Op deze kaart zijn de meest voorkomende mutaties van het betreffende gebied weergegeven. Er zijn geen grenzen aangegeven omdat er in de gebieden een overlap zit door migraties van bevolkingsgroepen. Migraties zorgen ervoor dat mutaties in meerdere gebieden voorkomen. Een voorbeeld hiervan is de IVS 1-5 G -> C.
Figuur 7: Kaart van continent Eurazië waarop wordt aangegeven waar welke β-thalassemieën voorkomen. Elke
3 Theoretische achtergrond technieken
De moleculaire diagnostiek maakt het mogelijk genetische afwijkingen zoals mutaties of deleties aan te tonen. Het DNA is namelijk de bouwtekening van het lichaam. Symptomen van een hemoglobinopathie zijn een te laag hemoglobine en eventueel afwijkende cellen. Door middel van HPLC (High Performance Liquid Chromatography) en/of Hb-elektroforese kan worden nagegaan welke vormen van hemoglobine aanwezig zijn en in welke verhouding. Met de moleculaire diagnostiek kan exact worden nagegaan welke mutaties en/of deleties aanwezig zijn in de genen die coderen voor de hemoglobineketens.
3.1 DNA-isolatie
Voor een PCR (Polymerase Chain Reaction) is template DNA nodig. Het DNA wordt geïsoleerd uit EDTA bloed met behulp van de MagNa Pure Compact. De MagNa Pure Compact is een apparaat dat geheel geautomatiseerd nucleïnezuren kan isoleren uit verschillende materialen op basis van magnetische glaspartikels.
A B C D E F G
Figuur 8: De 7 stappen waarin DNA geïsoleerd wordt door de MagNa Pure Compact
Nadat het materiaal in de sample well van de cartridge is gepipetteerd (figuur 1: A) wordt de binding/lysis buffer en proteïnase K toegevoegd aan het volbloed. De cellen lyseren en de eiwitten worden afgebroken (figuur 1: B). Magnetische glas partikels worden aan het gelyseerde monster toegevoegd (figuur 1: C). Deze partikels hebben een magnetische werking aan de binnenkant. Het DNA bindt aan het oppervlak van de partikels door toevoeging van het zout guanidinium-HCl met een pH>7.0. Hierdoor worden waterstofbruggen rondom het partikel afgebroken. Tevens verandert door de hoge zoutconcentratie de conformatie van het DNA waardoor het oppervlak aan de partikels gaat hechten. De partikels met daaraan het DNA worden gescheiden van het lysaat door een magneet tegen de tip te houden. Het lysaat wordt terug de well in gepipetteerd, terwijl de partikels in de tip blijven door de magnetische werking (figuur 1: D). Vervolgens wordt er een wasbuffer bij de partikels met het DNA gepipetteerd. De MagNa Pure Compact resuspendeert de wasbuffer samen met de partikels in de pipettip (figuur 1: E). Hierna wordt de magneet tegen de pipettip gehouden, waardoor de magnetische deeltjes tegen de wand van de tip blijven zitten (figuur 1: F). De wasbuffer wordt weer teruggepipetteerd in de well. Dit proces wordt enkele malen herhaald. Na het wassen wordt elutiebuffer aan de aan de partikels toegevoegd. Doordat de elutiebuffer een andere zoutconcentratie en pH heeft, laat het DNA los van de partikels en wordt het samen met de buffer geëlueerd. De magnetische glas partikels worden weggevangen door de magneet zodat er een schoon eluaat met daarin het DNA overblijft (figuur 1: G). [13]
3.2 De Polymerase Chain Reaction
De introductie van de PCR gaf de moleculaire biologie de mogelijkheid om in een relatief korte tijd een specifieke nucleïnezuursequentie (DNA) te vermeerderen. De Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek waarin een target sequentie (doelsequentie) genomisch DNA of cDNA (copy DNA, wat door reverse transcriptie uit mRNA is verkregen) betrouwbaar exponentieel kan worden vermenigvuldigd. Het is een reactie die voldoende materiaal oplevert om de aanwezigheid van DNA aan te tonen en om verder mee te werken.
PCR is een gevoelige techniek. Theoretisch heeft een PCR maar één template nodig om verschillende kopieën te maken. Zolang er geen contaminatie plaatsvindt en er voldoende inputmateriaal aanwezig is, is het resultaat betrouwbaar. Dit maakt de techniek geschikt voor bijvoorbeeld de detectie van micro-organismen, genetische afwijkingen, research en forensisch onderzoek. Een reactiemix bevat:
inputmateriaal oftewel het template; een forward en een reversed primer; een thermostabiel DNA polymerase; dNTP’s (dATP, dTTP, dGTP, en dCTP); een PCR buffer;
magnesiumchloride.
Alle componenten worden samengevoegd in een reactievaatje en in een thermocycler geplaatst. De thermocycler wordt zo ingesteld dat binnen een cyclus, drie temperaturen een korte tijd wordt gehandhaafd. Deze drie temperaturen zorgen voor de: denaturatie annealing en elongatie (figuur 9). Door deze cyclus meerder malen te herhalen wordt het target DNA exponentieel vermenigvuldigd.
Figuur 9: De denaturatie vindt meestal plaats bij 94oC, de annealing van de primers aan de targetsequentie bij 55-65oC en de elongatie (synthese) bij 72oC
In theorie moet elke cyclus het materiaal een keer verdubbelen en na 20 cycli is het inputmateriaal, binnen enkele uren, met zo’n 1.000.000x toegenomen (2n (n = aantal cycli))
waardoor het product zoveel aanwezig is dat het door bijvoorbeeld gelelektroforese zichtbaar gemaakt kan worden.
In een realtime-PCR wordt de vermeerdering van het DNA live gevolgd en is in een goedlopende PCR een efficiëntie te halen van 1,98n. [14]
3.3 Gelelektroforese
Elektroforese van PCR producten in agarose en polyacrylamide gelen is een standaard methode om DNA-fragmenten met verschillende grootte van elkaar te scheiden. De techniek is relatief eenvoudig en snel toe te passen. Wanneer gebruik wordt gemaakt van de fluorescerende kleurstoffen ethidiumbromide of sybergreen zijn de fragmenten direct zichtbaar te maken onder een UV lamp. Het is ook mogelijk de fragmenten uit de gel te isoleren voor verdere doeleinden.
Agarose en polyacrylamide gelen kunnen in vele concentraties, grootte en vormen gegoten worden. Polyacrylamide gelen zijn zeer gevoelig en hebben een groot oplossend vermogen. Kleine fragmenten van 5 tot 500 bp kunnen tot op één base nauwkeurig van elkaar worden gescheiden. Agarose gelen hebben een minder groot oplossend vermogen maar de scheidingsrange is veel groter. DNA fragmenten van 100 bp tot 50 kbp kunnen afhankelijk van de concentratie van elkaar gescheiden worden. Agarose gelen hebben veelal de voorkeur. Het gieten van agarose is eenvoudiger en niet neurotoxisch zoals polyacrylamide.
Figuur 10: Agarose stuctuurformule
Agarose is een polymeer van disachariden (zie figuur 10) en wordt geëxtraheerd vanuit zeewier. Agarose wordt door koken opgelost in de te gebruiken elektroforese buffer. Wanneer de oplossing helder is en geen zichtbare stukjes meer bevat, wordt deze afgekoeld tot circa 60oC. Na toevoeging van eventuele kleurstoffen (bijv. ethidiumbromide) voor de
visualisatie van de fragmenten wordt de gel gegoten in een mal waarin een kam wordt geplaatst voor de slotjes. De slotjes zijn de uitsparingen in de gel waarin het monster kan worden geladen. Gelen met hogere concentraties worden bij 70oC gegoten en gelen met een
laag smeltpunt bij temperaturen tot 4oC. Als de gel is uitgehard wordt de kam verwijderd en
de gel in de elektroforesebak geplaatst. De gel komt net onder de buffer te liggen waardoor de slotjes vollopen. Nu kan het monster met de toegevoegde loadingbuffer in de slotjes worden geladen. De loadingbuffer bevat sucrose wat het DNA verzwaart waardoor het in de slotjes zakt en een kleurstof welke door de gel zal migreren. Deze kleurstof is een indicatie voor hoever de DNA fragmenten door de gel gemigreerd zijn.
Nucleïnezuren zijn sterk negatief geladen moleculen. In een elektrisch veld bewegen ze richting de positieve elektrode. De hoeveelheid lading van een nucleïnezuur is altijd gelijk, namelijk één negatieve lading per nucleotide. Alle nucleïnezuren, groot of klein hebben dezelfde lading/massa verhouding en bewegen in een elektrisch veld hierdoor even snel. De
scheiding van fragmenten van verschillende grootte vindt plaats door de zevende werking van agarose. Door de zevende werking migreren kleine fragmenten sneller dan grote.
Bij een laag voltage geldt dat de migratiesnelheid van linaire DNA fragmenten evenredig is aan de gebruikte spanning. Naarmate de sterkte van het elektrisch veld wordt opgevoerd, geldt voor grotere fragmenten dat de migratiesnelheid niet meer evenredig hoger wordt. Voor een optimale scheiding van 2 kbp en groter wordt 5 Volt/cm gerekend. Het aantal centimeter is dan de afstand tussen de positieve en negatieve elektrode. Wanneer de spanning te hoog wordt en er teveel warmte vrij komt kan dat de gel doen smelten.
Wanneer de fragmenten in de gel zijn gescheiden, kunnen de fragmenten door middel van UV-licht worden bekeken. Het ethidiumbromide wat tussen het DNA gaat zitten licht door middel van UV-straling op [15].
3.4 Strip assay
Door de toenemende vraag naar moleculaire diagnostiek zijn er fabrikanten die verschillende strips op de markt hebben gebracht voor het aantonen van genmutaties. Met de introductie van strip assays wordt het detecteren van meerdere mutaties binnen één analyse vereenvoudigd. In de PCR wordt het target DNA geamplificeerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een biotine-gelabelde primer. Na de PCR wordt het product gehybridiseerd aan allel-specifieke oligonucleotiden (wildtype en mutant). Deze oligonucleotiden zijn als parallelle lijnen op een nitrocellulose membraan geplaatst. PCR-fragmenten die gebonden zijn kunnen worden gedetecteerd doordat aan het biotine-label van de PCR-fragmenten streptavidine-alkalische fosfatase wordt gebonden, waarna een kleurreactie wordt uitgevoerd. De bovengenoemde reacties worden in een schudwaterbad met nauwkeurige temperatuurcontrole uitgevoerd, zie figuur 11.
Figuur 11: Het principe van de strip assay.
Het merk ViennaLab heeft voor de α-thalassemie één assay en voor de β-thalassemie 4 verschillende assays. De PCR-fragementen die voor het gebruik van de strips geamplificeerd moeten worden gebruiken 25-200 ng DNA als template. Dit template DNA kan op de reguliere manier geïsoleerd te worden. [16]
Het protocol en juiste interpretatie van de uitslagen voor de α-thalassemia zijn te vinden in het document α-Globin StripAssay van ViennaLab (document 4-160). [17]
De 4 kits voor β-thalassemieën behoren tot de categorie β-Globin StripAssay. In de verschillende kits zijn specifieke genmutaties gecombineerd. De vier verschillende kits zijn:
β-Globin StripAssay cat.no. 4-120
β-Globin StripAssay MED cat.no. 4-130 (voor het Mediterrane gebied) β-Globin StripAssay IME cat.no. 4-140 (voor India en het Midden-Oosten) β-Globin StripAssay SEA cat.no. 4-150 (voor Zuid-Oost Azië)
Het protocol en juiste interpretatie van de uitslagen voor de β-thalassemieën zijn te vinden in het document β-Globin StripAssay van ViennaLab (document 4-130, 4-140 of 4-150). [18, 19, 20]
4 Materiaal en methode
Er is gebruik gemaakt van aanwezig materiaal (DNA of bloed) van patiënten waarbij diagnostiek voor Hb-pathie is aangevraagd. Van alle patiënten is gecontroleerd of ze toestemming hebben gegeven voor het gebruik van materiaal voor onderzoek.
Indien er alleen bloed aanwezig is wordt hieruit DNA geïsoleerd met behulp van de MagNA Pure Compact. In de SOP (Standard Operation Procedure) van het KCHL ‘DNA-isolatie m.b.v. de MagNa Pure Compact TT-DP-A-0650’ staat de werkwijze beschreven [2].
4.1 Multiplex-PCR
De multiplex-PCR (vanaf nu m-PCR) zijn uitgevoerd met de in tabel 5 weergegeven primers. Per primer paar kan één specifieke deletie worden aangetoond.
Tabel 5: De primers met hun sequentie en concentratie
Primers 5' --> 3' sequentie Conc. in reactie Fragment grootte Forward α2/3.7 CCCCTCGCCAAGTCCACCC 0,1 pmol/μl α2 gen 1800 bp
Reversed α2 AGACCAGGAAGGGCCGGTG 0,1 pmol/μl
Reversed 3.7/20.5
AAAGCACTCTAGGGTCCAGCG 0,12 pmol/μl -α3.7 fragment 2022/2029 bp
Forward 20.5 GCCCAACATCCGGAGTACATG 0,12 pmol/μl -(α)20.5 fragment 1007 bp
Forward 4.2 GGTTTACCCATGTGGTGCCTC 0,3 pmol/μl -α4.2 fragment 1628 bp Reversed 4.2 CCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC 0,3 pmol/μl
Forward SEA CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC 0,2 pmol/μl --SEA fragment 1349 bp Reversed SEA AGCCCACGTTGTGTTCATGGC 0,2 pmol/μl
Forward MED TACCCTTTGCAAGCACACGTAC 0,2 pmol/μl --MED fragment 807 bp Reversed MED TCAATCTCCGACAGCTCCGAC 0,2 pmol/μl
Forward LIS ATACCATGGTTACCCCATTGAG
C
0,2 pmol/μl LIS1 3’UTR fragment 2350 bp
Reversed LIS AGGGCTCATTACATGTGGACCC 0,2 pmol/μl
Een 50 μl reactievolume bevat 1 x PCR-buffer, 1 x Q-solution, 1,8 μl dNTP’s van 5 mmol/l, 0,25 U HotStar Taq Polymerase, primers in de concentraties zoals in tabel 5 weergegeven en 150-300 ng template DNA.
Voor de PCR is een thermocycler gebruikt van Biometra met het volgende PCR programma: 15 minuten 96 °C (HotStar), 2 cycli (45 seconden 98 °C, 3 minuten 72 °C), 30 cycli (45 seconden 98 °C, 90 seconden 60 °C, 2 minuten 72°C) en een laatste annealing stap van 4 minuten bij 72 °C.
Tien microliter van elk geamplificeerd product is op een 1% agarose gel geanalyseerd. De gel is 60 minuten geëlektroforeerd bij een spanning van 5 Volt/cm. In de SOP (Standard Operation Procedure) van het KCHL ‘Submarine electroforese 012417 versie 3’ staat de werkwijze beschreven voor gelelektroforese [4]. De PCR-fragmenten zijn zichtbaar gemaakt met behulp van ethidiumbromide en UV-licht.
4.2 -Globin StripAssay
α
Voor de α-Globin StripAssay van het merk ViennaLab moeten per sample 3 PCR’s worden uitgevoerd, zijnde A1, A2 en B.
De kit bevat Taq DNA Polymerase van 5 U/μl. Hiervan is een 1:15 verdunning gemaakt met de bijgeleverde Taq Dilution Buffer wat resulteert in een eindconcentratie van 0,33 U/μl. Deze 25 µl reactiemix bevat 15 µl Amplification Mix (A1, A2 of B), 5 µl verdunde Taq DNA Polymerase en ± 150 ng/μl DNA template. Voor de PCR is een thermocycler van Biometra gebruikt in combinatie met het volgende PCR programma: 5 minuten 95 °C, 3 cycli (40 seconden 97 °C, 40 seconden 64 °C en 90 seconden 72 °C), 37 cycli (40 seconden 97 °C, 40 seconden 58 °C en 90 seconden 72 °C) en een laatste annealing stap van 5 minuten 72 °C. De PCR producten zijn anderhalf uur op een 2% gel geëlektroforeerd bij een spanning van 5 Volt/cm om te kijken of de amplificatie gelukt is.
Na een goede amplificatie zijn de PCR producten gehybridiseerd. Hiervoor zijn 2 strips gebruikt (strip A en B), A voor PCR product A1 en A2 en B voor product B. Het schudwaterbad is samen met Wash Solution A en de Hybridization Buffer voorverwarmd tot 45 °C. De overige benodigde reagentia moeten op kamertemperatuur zijn evenals de teststrips. In het schuitje waar teststrip A in komt te liggen is 20 μl DNAT, 10 μl amplificatie product A1 en 10 μl amplificatie product A2 gepipetteerd in dezelfde druppel (voorzichtig gemengd met pipet). In het schuitje waar teststrip B in komt te liggen is 10 μl DNAT en 10 μl amplificatie product B gepipetteerd in dezelfde druppel (voorzichtig gemengd met pipet) waarna denaturatie plaats vindt. Deze stap duurt 5 minuten bij kamertemperatuur.
Vervolgens worden na toevoeging van 1 ml Hybridization Buffer (voorverwarmd tot 45 °C) per schuitje, en voorzichtig mengen, de strips in de bijbehorende schuitjes gedaan met de markeringen naar boven. Na 30 minuten hybridisatie bij 45 °C in het schudwaterbad is de vloeistof verwijderd door middel van vacuümafzuiging. De strips zijn 10 seconden gewassen met 1 ml Wash Solution A (voorverwarmd tot 45 °C) middels zwenken waarna de wasvloeistof is verwijderd. De strips zijn nog 2 keer gewassen door 15 minuten met 1 ml Wash Solution A te incuberen bij 45 °C in het schudwaterbad.
Voor de kleurontwikkeling is per reactie 1 ml Conjugate Solution toegevoegd wat 15 minuten geïncubeerd is op een schudapparaat bij kamertemperatuur. Na de kleurreactie zijn de strips 10 seconden gewassen met 1 ml Wash Solution B (kamertemperatuur) middels zwenken waarna de wasvloeistof is verwijderd. De strips zijn nog 2 keer gewassen door 5 minuten met 1 ml Wash Solution B te incuberen op het schudapparaat bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van de wasvloeistof is 1 ml Color Developer toegevoegd en 15 minuten geïncubeerd op het schudapparaat in het donker. Na 15 minuten zijn de bandjes zichtbaar waarna de strips drie maal zijn gespoeld met H2O. Na het spoelen zijn de strips in het donker
op een tissue gedroogd.
4.3 -Globin StripAssay
β
Voor de β-Globin StripAssay van het merk ViennaLab moet per sample 1 PCR worden uitgevoerd.
De kit bevat geen Taq DNA Polymerase. Taq DNA Polymerase van het merk AmpliTaq is gebruikt voor de PCR. Deze Taq DNA Polymerase bevat 5 U/μl en is van te voren 1:25 verdund met de Taq Dilution Buffer uit de kit wat resulteert in een eindconcentratie van 0,2 U/μl.
Deze 25 µl reactiemix bevat 15 µl Amplification Mix, 5 µl verdunde Taq DNA Polymerase en ± 150 ng/μl DNA template. Voor de PCR is een thermocycler gebruikt van Biometra met
als PCR-programma: 2 minuten 94 °C, 35 cycli (15 seconden 94 °C, 30 seconden 58 °C en 45 seconden 72 °C) en een laatste annealing stap van 3 minuten 72 °C.
De PCR producten zijn anderhalf uur op een 2% gel geëlektroforeerd bij een spanning van 5 Volt/cm om te kijken of de amplificatie gelukt is.
Na een goede amplificatie zijn de PCR producten gehybridiseerd. Hiervoor is per reactie één strip gebruikt. Het schudwaterbad is samen met Wash Solution A en de Hybridization Buffer voorverwarmd tot 45 °C. De overige benodigde reagentia moeten op kamertemperatuur zijn evenals de teststrips. In het schuitje waar de teststrip in komt te liggen is 10 μl DNAT en 10 μl amplificatie product in dezelfde druppel gepipetteerd (voorzichtig gemengd met pipet) waarna denaturatie plaats vindt. Deze stap duurt 5 minuten bij kamertemperatuur.
Vervolgens worden na toevoeging van 1 ml Hybridization Buffer (voorverwarmd tot 45 °C) per schuitje, en voorzichtig mengen, de strips in de bijbehorende schuitjes gedaan met de markeringen naar boven. Na 30 minuten hybridisatie bij 45 °C in het schudwaterbad is de vloeistof verwijderd door middel van vacuümafzuiging. De strips zijn 10 seconden gewassen met 1 ml Wash Solution A (voorverwarmd tot 45 °C) middels zwenken waarna de wasvloeistof is verwijderd. De strips zijn nog 2 keer gewassen door 15 minuten met 1 ml Wash Solution A te incuberen bij 45 °C in het schudwaterbad.
Voor de kleurontwikkeling is per reactie 1 ml Conjugate Solution toegevoegd wat 15 minuten geïncubeerd is op een schudapparaat bij kamertemperatuur. Na de kleurreactie zijn de strips 10 seconden gewassen met 1 ml Wash Solution B (kamertemperatuur) middels zwenken waarna de wasvloeistof is verwijderd. De strips zijn nog 2 keer gewassen door 5 minuten met 1 ml Wash Solution B te incuberen op het schudapparaat bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van de wasvloeistof is 1 ml Color Developer toegevoegd en 15 minuten geïncubeerd op het schudapparaat in het donker. Na 15 minuten zijn de bandjes zichtbaar waarna de strips drie maal zijn gespoeld met H2O. Na het spoelen zijn de strips in het donker
5 Resultaten
5.1 -thalassemieën
α
De resultaten bevatten vier subonderwerpen: multiplex-PCR, de gecombineerde controles, de primerstock-houdbaarheidstest en de strip assay van ViennaLab.
De m-PCR is opgebouwd door de verschillende primers bij elkaar in een reactie te voegen. Dit is uitgebouwd tot de combinatie van alle primers uit tabel 5.
De condities van de m-PCR zijn zodanig geoptimaliseerd dat naast het normale αα, de deleties -α3.7, -α4.2, --SEA, -(α)20.5 en --MED kunnen worden gedetecteerd.
Bij aanwezigheid van een deletie of afwezigheid in geval van het normale αα, geeft het betreffende primerpaar een positief signaal. Homozygoten en compound heterozygoten worden waargenomen door de afwezigheid van het αα (α2) bandje.
Figuur 12: De multiplex-PCR met de optimale intensiteit van de bandjes en zonder bijproduct. Het LIS fragment
is 2503 bp, het –α3.7 fragment is 2022/2029 bp, het α2 fragment is 1800 bp, het –α4.2 fragment is 1628 bp, het --SEA fragment is 1349 bp, het –(α)20.5 fragment is 1007 bp en het --MED fragment is 807 bp
Van boven naar beneden gezien is het eerste bandje bij elk sample het LIS gen wat codeert voor een stukje UTR (Untranslated Region). Het is het grootste fragment en dient als controle voor de kwaliteit van het DNA. Als het LIS fragment geamplificeerd kan worden kunnen ook kleinere producten geamplificeerd worden.
De m-PCR bevat alle primers om de 5 verschillende deleties aan te tonen. De resultaten in figuur 12 zijn verkregen met de in tabel 5 weergegeven concentraties.
Na het optimaliseren van de m-PCR is getest met het combineren van controles. Het combineren van controles geeft als voordeel lagere materiaalkosten en minder pipetteerwerk.
Wanneer een controle sample wat normaal het genotype -(α)20.5/αα heeft wordt gecombineerd met een sample met genotype --SEA/αα, worden in de m-PCR vier verschillende PCR producten geamplificeerd, namelijk het LIS fragment, het -(α)20.5 fragment, het --SEA fragment en het αα oftewel α2 fragment. De controles uit tabel 6 zijn op deze manier gecombineerd en getest met als resultaat figuur 13 en figuur 14.
Tabel 6: Gecombineerde controles die samen een juiste intensiteit van de bandjes behouden
Genotypen Fragmenten Aantal basenparen
-(α)20.5/αα & --SEA/αα LIS, α2, --SEA, -(α)20.5 2350 bp, 1800 bp, 1349 bp, 1007 bp -α3.7/-α3.7 & --MED/αα LIS, -α3.7 ,α2, --MED 2350 bp, 2022/2029 bp, 1800 bp, 807 bp -α4.2/αα & -α3.7/-α3.7 LIS, -α3.7, α2, -α4.2 2350 bp, 2022/2029 bp, 1800 bp, 1628 bp -α4.2/αα & --SEA/αα LIS, α2, -α4.2, --SEA 2350 bp, 1800 bp, 1628 bp, 1349 bp -α4.2/αα & -(α)20.5/αα LIS, α2, -α4.2, -(α)20.5 2350 bp, 1800 bp, 1628 bp, 1007 bp --SEA/αα & --MED/αα LIS, α2, --SEA, --MED 2350 bp, 1800 bp, 1349 bp, 807 bp
Figuur 13: In deze afbeelding is te zien dat het
combineren van controles een juist resultaat geeft. 1 is H2O, 2 is een normale α2, 3 is -α3.7/αα, 4 is -α4.2/αα, 5 is een homozygote -α3.7, 6 is een –SEA/αα, 7 is een homozygote -α4.2, 8 is een combinatie van -α4.2/αα en een homozygote -α3.7. 9 is een combinatie van een --SEA/αα en een homozygote -α4.2
Figuur 14: Sample 1 is H2O, 2 is een combinatie van -α4.2/αα en -(α)20.5/αα, 3 is een combinatie van een homozygote -α3.7 en --MED/αα. 4 is --SEA/αα en --MED/αα. 5 is -α4.2/αα en een homozygote -α3.7. 6 is -α4.2/αα met een --SEA/-α3.7
De PCR fragmenten van figuur 14 zijn 50 minuten geëlektroforeerd waardoor de bandjes relatief dicht bij elkaar liggen. Bij het combineren van controles is het daarom belangrijk om eerder iets langer te elektroforeren.
In figuur 14 is bij sample 3 en sample 5 het -α3.7 fragment niet zichtbaar, terwijl deze wel zichtbaar is bij sample 6. De aanwezigheid van het -α3.7 fragment in sample 6 geeft aan dat de reactiemix goed was. De verklaring voor de afwezigheid van het -α3.7 fragment in sample 3 en 5 moet bij het sample gezocht worden.
Naast de gecombineerde controles is het maken van één stockoplossing die alle primers bevat ook een middel om de werkwijze van de multiplex-PCR te optimaliseren. Het voordeel van deze kant en klare stockoplossing is tijdbesparing en het reduceren van de kans op pipetteerfouten. Voor deze test zijn drie stockoplossingen gemaakt:
A primerstock
B primerstock verdeeld over epjes per 10 reacties C primerstock verdund in steriel H2O
De A primerstock-oplossing, en de B primerstock-oplossing bevatten de concentratie primers volgens tabel 7.
Tabel 7: De concentratie primers in de onverdunde stockoplossingen en aantal µl per reactie.
Primer Concentratie µl per reactie
Forward primer α2 / 3.7 (100 pmol/µl) 3,33 pmol/µl 0,05 µl Reversed primer α2 (100 pmol/µl) 3,33 pmol/µl 0,05 µl Reversed primer 3.7 / 20.5 (100 pmol/µl) 4,00 pmol/µl 0,06 µl Forward primer 20.5 (100 pmol/µl) 4,00 pmol/µl 0,06 µl Forward primer 4.2 (100 pmol/µl) 10,00 pmol/µl 0,15 µl Reversed primer 4.2 (100 pmol/µl) 10,00 pmol/µl 0,15 µl Forward primer SEA (100 pmol/µl) 6,67 pmol/µl 0,1 µl Reversed primer SEA (100 pmol/µl) 6,67 pmol/µl 0,1 µl Forward primer MED (100 pmol/µl) 6,67 pmol/µl 0,1 µl Reversed primer MED (100 pmol/µl) 6,67 pmol/µl 0,1 µl LIS Forward primer (100 pmol/µl) 6,67 pmol/µl 0,1 µl LIS Reversed primer (100 pmol/µl) 6,67 pmol/µl 0,1 µl
H2O - 0,38 µl
Totaal volume - 1,5 µl
Deze concentraties zijn verkregen door van de primers het aantal µl per reactie volgens tabel 7 bij elkaar te pipetteren vanuit de aangeleverde concentratie van 100 pmol/μl en deze mix aan te vullen met 0,38 ul H2O (per reactie).
Uit deze stockoplossing moet 1,5 µl per reactie gebruikt worden in plaats van losse primer werkoplossingen. Primer stock B is verdeeld over 10 epjes zodat bij gebruik niet de gehele stockoplossing ontdooit hoeft te worden wat bij A wel het geval is.
Aan de C primer stock is 23,88 μl per reactie toegevoegd, resulterend in een hoeveelheid van 25 μl per reactie. Een groter volume maakt de kans op pipetteerfouten kleiner wat een voordeel is van deze verdunde stockoplossing. Echter primers zijn in een hogere concentratie beter houdbaar. Voor het testen van de verschillende stockoplossing wordt de geoptimaliseerde m-PCR gebruikt. Er is 10 weken getest met A en B en 5 weken met C. Zie tabel 8 voor de planning van deze test.
Aan het einde van deze test zijn verschillende samples naast elkaar gezet om een verandering in intensiteit waar te nemen, zie figuur 15. Er zijn 8 samples meegenomen met uiteenlopende genotypen. De samples in figuur 15 zijn van week 13. Eerdere weken was er nauwelijks waarneembaar verschil tussen de verschillende primerstock-oplossingen.
Figuur 15: Week 13: A is de primermix stockoplossing, B is de primermixstockoplossing verdeeld over epjes en
C is de primermixstockoplossing verdund met steriel H2O
De bandjes van het grootste product, het LIS gen, zijn bij C nauwelijks waar te nemen. Deze amplificatie is dus minder goed verlopen.
Om samples met hetzelfde genotypen met elkaar te vergelijken zijn drie samples van de verschillende stockoplossingen naast elkaar gezet. Op deze manier kan de kwaliteit van de producten van het zelfde sample en de zelfde week onderling worden vergeleken (figuur 16). In week 7 is de intensiteit van B het hoogste bij sample 2 en 3. Bij sample 1 is dit niet het geval. In week 9 is er nauwelijks verschil qua intensiteit echter is ook hier te zien dat B de beste bandjes weergeeft. In week 11 is het ook B met de beste bandjes en in week 13 is het ook B behalve bij sample 1. Hier geeft A de beste resultaten. In figuur 16 is ook te zien dat van het LIS product, wat het grootste product is en daarom het minst ver door de gel migreert, de intensiteit af neemt. Het LIS product moet overal waarneembaar zijn.
Figuur 16: Van 3 samples zijn van de stockoplossingen A, B en C de verschillende PCR producten naast elkaar
gezet. Dit is gedaan van week 7, 9, 11 en 13. Van de weken 7 en 11 is stockoplossing C niet meegenomen in de test
Naast de m-PCR met de daarbij behorende tests is ook de α-Globin StripAssay getest. In de figuren 17 en 18 zijn resultaten van de strip assay te zien.
Figuur 17: Resultaten α-Globin StripAssay:sample 1 is een heterozygote --SEA, sample 2 een homozygote -3.7 en sample 3 een normale a2
In figuur 17 laat sample 1 het genotype --SEA/αα zien. De aanwezigheid van alle wildtype bandjes geeft aan dat er nog een normaal α2 gen aanwezig is. Wildtype is het gen zoals dit zonder mutaties voorkomt. Op de strip zijn dit delen van het normale gen, in dit geval het α-globine gen. Bij sample 2 zijn de wildtype bandjes afwezig en is het mutant bandje van de -α3.7 zichtbaar. Dit sample heeft het genotype -α3.7/-α3.7 en is dus homozygoot.
Bij sample 2 in figuur 18 zijn de wildtype bandjes 25 t/m 31 aanwezig wat betekent dat het een heterozygoot sample betreft. Echter zijn er 2 mutant bandjes aanwezig namelijk een -α3.7 en een -α4.2 bandje. Mogelijk is er sprake van ‘carryover’ tijdens de hybridisatie.
Figuur 18: Resultaten α-Globin StripAssay: sample 1 is een homozygote -α3.7, sample 2 een heterozygote -α3.7
sample 3 een heterozygote -α4.2, sample 4 een heterozygote -(α)20.5 sample 5 een heterozygote --SEA, sample 6 een compound heterozygote --SEA/α3.7 en sample 7 een heterozygote --MED
5.2 -thalassemieën
β
Negenendertig bloedsamples waarbij mogelijk een β-thalassemie aanwezig is zijn geanalyseerd door middel van de β-Globin StripAssay. Deze samples hebben een van de volgende diagnoses:
HbA2 verhoogd, dit pleit voor de diagnose heterozygote β-thalassemie.
HbS: verhoogd HbA2 door sikkelcel of mogelijke β-thalassemie.
HbE interfereert met HbA2. Een eventuele β-thalassemie is daarom niet uit te sluiten.
HbF verhoogd, dit pleit voor de diagnose homozygote β-thalassemie.
Deze diagnoses zijn gemaakt aan de hand van een verhoogd percentage HbA2 en een verlaagd
Hb. Ook is er sample met de Hb-typering AC en een sample met een mogelijke persisterende HbF geanalyseerd. In figuur 19 zijn resultaten te zien van enkele samples. Deze strips zijn geanalyseerd met de β-Globin StripAssay MED kit. Bij de samples 3, 4, 5 en 6 is naast de HbS mutatie geen andere β-thalassemie mutatie gevonden.
Bij 3 samples is met de kit gericht op het Mediterrane gebied geen mutatie gedetecteerd. Deze samples zijn nogmaals geanalyseerd met de IME kit. Bij sample Con-527 is met IME kit alsnog een mutatie gedetecteerd, zie tabel 9.
Figuur 19: Resultaten β-Globin StripAssay MED: sample 1 bevat een IVS 1.6 T>C mutatie, sample 2 bevat een
codon 5 –CT mutatie, sample 3, 4, 5 en 6 zijn samples met sikkelceltrait, sample 7 bevat een IVS 1.5 G>C mutatie en sample 8 bevat geen mutatie
In tabel 9 zijn de resultaten van alle samples weergegeven. Ook het Hb en het MCV van deze samples zijn in de tabel opgenomen.
Tabel 9: Overzicht van de samples met hun gedetecteerde uitslag
DNA-nr. Mutatie Hb-typering HbA2 % HbF % Hb MCV Con-500 IVS 1.6 [T>C] / wt AA 4,1 1,3 7,5 66 Con-501 codon 5 [-CT] / wt AA 5,1 0,4 7 60 Con-502 codon 39 [C>T] / wt AA 5,8 1,1 6,9 57 Con-503 codon 39 [C>T] / wt AA 5,7 0,3 7,4 57 Con-504 codon 39 [C>T] / wt AA 5,3 1,3 6,8 56 Con-505 codon 39 [C>T] / wt AA 4,6 0,6 6,8 61 Con-506 IVS 1.5 [G>C] / wt AA 4,7 1,1 7,8 63 Con-507 IVS 1.5 [G>C] / IVS 1.5 [G>C] HbF 0 102,3 3,9 70 Con-508 codon 8/9 [+G] / wt AA 3,6 0,7 4,9 66 Con-509 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 3,6 0,8 8,1 67 Con-510 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 4 0 5,7 75 Con-511 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 3,6 0,7 6,7 76 Con-512 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 4,1 2,7 7,2 78 Con-513 IVS 1.5 [G>C] / wt AA 4,3 0,5 6,5 61
Con-514 wild type AA 4,3 0,2 8 65
Con-515 codon 6 [-A] / wt AA 5 11,6 6,7 56 Con-516 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 3,7 0 6,3 80 Con-517 IVS 1.5 [G>C] / IVS 1.5 [G>C] HbF 2,7 99,9 6,3 70
Con-518 wild type AE ? ? 6,6 78
Con-519 wild type AA 6,7 11 7,4 75 Con-520 wild type AE 26,2 2,2 7,4 88
Con-521 wild type AE 27,9 2 8 71
Con-522 wild type AE 27,9 1 4,7 72 Con-523 wild type AA 5,1 4,8 5,7 70 Con-524 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 3,7 5,3 8 87 Con-525 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 3,8 0,2 7,3 78 Con-526 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 3,7 0,3 7,7 87 Con-527 codon 41/42 [-TTCT] / wt AA 5,4 0,5 5,6 57 Con-528 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 4,1 0,6 8,4 78 Con-529 codon 5 [-CT] / wt AA 5,2 2,7 8,4 59 Con-530 wild type AE n.t.i. 0 7,2 68
Con-531 wild type AA 3,7 1 6,6 68
Con-532 niet geanalyseerd monster AS 3,6 0,3 7 78 Con-533 wild type AE 26,2 1 7,9 88 Con-534 wild type AE 26,2 2,2 7,4 88 Con-535 wild type HbF 0 80,4 10 86 Con-536 codon 6 [G>A] HbC / wt AC 1,7 0 7,5 82 Con-537 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 4,4 0,8 7,9 72 Con-538 niet geanalyseerd monster AS 4,2 0,3 9,7 84 Con-539 codon 6 [A>T] HbS / wt AS 4,3 0,6 5,3 61 til-7237 IVS 1.110 / codon 39 [C>T] n.v.t. n.v.t. n.v.t. n.v.t. n.v.t.
Van de 15 samples met een Hb-typering AA en een verhoogd HbA2 zijn 14 samples getest
met de β-Globin StripAssay MED kit. Bij 11 van de 14 samples is met de β-Globin StripAssay MED kit een thalassemie mutatie gevonden. De 3 samples waarbij met de Globin StripAssay MED kit geen thalassemie mutatie is gevonden zijn later met de β-Globin StripAssay IME kit getest. Omdat er in de β-β-Globin StripAssay IME kit ruimte was voor een extra sample is één sample meegenomen wat niet met de β-Globin StripAssay MED kit was getest. In het totaal is bij 12 van 15 samples met duidelijke aanwijzingen voor een
β-thalassemie een mutatie gevonden. Van deze 12 samples heeft 33,33% de codon 39 [C>T] mutatie, 16,67% de codon 5 [-CT] mutatie, 16,67% de IVS 1.5 [G>C] mutatie, 8,33% de codon 8/9 [+G] mutatie, 8,33% de codon 41/42 [-TTCT] mutatie, 8,33% de codon 6 [-A] mutatie en 8,33% de IVS 1.6 [T>C] mutatie. De twaalf samples waarbij een β-thalassemie mutatie is gevonden hebben gemiddeld een HbA2 percentage van 4,9% (min. 3,6%, max.
5,8%) en een gemiddeld Hb van 6,9 (min. 4,9, max. 8,4). Het HbA2 en het Hb van de samples
waarin geen mutatie is gevonden liggen binnen deze spreiding.
De twee samples met de HbF-typering zijn beiden homozygoot voor de IVS 1.5 [G>C] mutatie. Deze samples hebben beiden ± 100% HbF. Van een van deze twee samples is het Hb 6,3 en van het andere sample 3,9.
Sample til-7237 is afkomstig van de neonatale screening. Voor de analyse is DNA geïsoleerd uit bloedspots. Dit sample bevat een compound heterozygote β-thalassemie met de mutaties IVS 1.110 en codon 39 [C>T].
Bij de samples met Hb-typering AE zijn geen β-thalassemie mutaties gedetecteerd.
De HbS samples bevatten naast de HbS mutatie geen andere β-thalassemie mutatie. Deze samples hebben een gemiddeld HbA2 van 3,9% (min. 3,6%, max. 4,3%).
Bij het sample met Hb-typering AC, is naast de HbC mutatie geen andere β-thalassemie mutatie aangetoond.
De samples Con-515 en Con-519 hebben de diagnose pleit voor een heterozygote β-thalassemie en door het verhoogde HbF mogelijk een Hereditaire Persisterende Foetaal Hemoglobine trait of δβ-thalassemie. Deze samples zijn getest met de β-Globin StripAssay MED kit waarbij bij Con-515 de codon 6 [-A] mutatie is gedetecteerd. Bij sample Con-519 zijn analyses uitgevoerd waarbij de mutaties HPFH-1, HPFH-2, HPFH-3, δβ-thalassemie Spanish en δβ-thalassemie Sicilian zijn uitgesloten (data niet weergegeven).
6 Kosten-batenanalyse
Het inzetten van de multiplex-PCR voor de diagnostiek voor α-thalassemieën duurt ± 30 minuten wanneer gebruik wordt gemaakt van een primermix stockoplossing zoals beschreven. Wanneer losse primer werkoplossingen worden gebruikt zal dit ± 40 minuten in beslag nemen.
De PCR van de α-Globin StripAssay neemt ± 40 minuten in beslag. Voor de β-Globin StripAssay neemt dit ± 30 minuten in beslag. De α-thalassemieën strip heeft namelijk 3 PCR reacties nodig per sample in tegenstelling tot de β-thalassemieën strip waar maar één PCR per sample nodig is. De PCR producten, zowel voor α- als β-thalassemieën, worden door middel van gelelektroforese gecontroleerd op een geslaagde amplificatie. De tijd die hiervoor nodig is, is gelijk aan een willekeurige gelelectroforese. De kosten voor de α-Globin StripAssay zijn hoger omdat hiervoor meer PCR-producten op gel moeten worden gezet. Dit kost iets meer tijd en eens zoveel aan materialen dan de andere gelelektroforeses, zie tabel 10. Bij de α-Globin StripAssay zijn twee rijen op een gel nodig in tegenstelling tot de β-α-Globin StripAssay waar maar één rij nodig is. Wanneer de amplificatie goed is verlopen wordt verder gegaan met de hybridisatie stappen. Door middel van kleurontwikkeling worden eventuele deleties of mutaties zichtbaar gemaakt op een strip. Dit duurt ± 2 uur en 20 minuten. De strip assay voor α-thalassemieën kost 5 uur analistentijd. Dit is 2 uur en 45 minuten meer dan de m-PCR. De Strip assay voor β-thalassemieën kost 4 uur en 35 minuten analistentijd.
Tabel 10: Benodigde analistentijd
Methode Isolatie PCR Gelelektroforese Hybridisatie Totaal
m-PCR α-thalassemieën 0:60 0:30 0:45 - 2:15 Strip assay α-thalassemieën 0:60 0:40 0:55 2:25 5:00 Strip assay β-thalassemieën 0:60 0:30 0:45 2:20 4:35
Naast de benodigde analistentijd zijn de kosten van de materialen ook uiteenlopend en mogelijk doorslaggevend. In tabel 11 is een kostenindicatie te vinden. Gezien het aantal samples van het afgelopen jaar is de schatting dat er ± 7 samples per week worden geanalyseerd. Voor de berekeningen is hiervan uitgegaan. Hierbij zijn ook de materiaalkosten van de α-thalassemie assay met losse PCR’s zoals deze tot op heden wordt uitgevoerd meegenomen. In bijlage 2 zijn de rekenmodellen te vinden waaruit deze bedragen tot stand zijn gekomen.
Tabel 11: Kosten assays per 7 samples
Methode Isolatie Gelelektroforese PCR Hybridisatie Totaal Per sample Assay losse PCR’s α-thal 39,20 47,71 60,67 n.v.t. 147,58 21,08 m-PCR α-thalassemieën 39,20 10,99 17,02 n.v.t. 67,21 9,60 Strip assay α-thalassemieën 39,20 31,74 462,00 532,94 76,13 Strip assay β- 39,20 15,87 413,00 468,07 66,87
thalassemieën
De efficiëntie van de analyse neemt toe als het aantal samples toeneemt. Het aantal samples per keer kan uitgebreid worden tot maximaal 14 waardoor de analistentijd per sample aanzienlijk minder zal worden. Ook zal dit de materiaalkosten naar beneden halen. De grootste kostenpost van de strip assays zijn de strips. Deze worden niet goedkoper door meerdere samples per keer te analyseren.
